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Artigo de método

Investigando lesão recorrente de AVC isquêmico em um modelo de oclusão secundária da artéria cerebral média em camundongo

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DOI:

10.3791/68806

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16 de setembro de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of California, Davis, 2Department of Nutrition, China Medical University, 3Division of Neurosurgery, Department of Surgery, College of Medicine and Hospital, National Taiwan University, 4Institute of Toxicology, College of Medicine, National Taiwan University, 5Department of Medical Research, China Medical University Hospital, China Medical University, 6Department of Pediatrics, College of Medicine and Hospital, National Taiwan University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Aviso de errata

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Resumo

Aqui, apresentamos um método para oclusão secundária da artéria cerebral média em camundongos para investigar a progressão do AVC isquêmico recorrente. Os procedimentos cirúrgicos, cuidados pós-operatórios, alterações patológicas neuronais e taxa de sobrevida são descritos.

Resumo

O AVC é a segunda principal causa global de mortalidade e incapacidade, com AVCs recorrentes contribuindo significativamente para desfechos ruins e aumento da carga neurológica. Apesar dos avanços no manejo clínico do AVC agudo, os modelos experimentais para AVC isquêmico recorrente permanecem limitados devido à complexidade do procedimento e às altas taxas de mortalidade. Neste estudo, nosso objetivo foi estabelecer um AVC isquêmico recorrente em um modelo de camundongo e avaliar as alterações patológicas cerebrais e déficits funcionais usando um protocolo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) em dois estágios. Camundongos C57BL/6J machos adultos foram submetidos a MCAO transitório sob monitoramento do fluxo sanguíneo Laser Doppler. Um MCAO secundário foi realizado 14 dias após a cirurgia inicial para simular a recorrência do AVC. As avaliações pós-operatórias incluíram análise da atividade locomotora, pontuação de déficits neurocomportamentais usando um sistema de pontuação de seis pontos, marcadores inflamatórios, incluindo fator 1α induzível por hipóxia (HIF-1α) e fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e avaliação histopatológica usando coloração de hematoxilina e eosina (H&E). Após a administração recorrente de MCAO, os camundongos exibiram atividade locomotora significativamente reduzida, diminuição da velocidade de movimento e diminuição dos escores neurocomportamentais, bem como aumento dos marcadores inflamatórios, em comparação com os grupos controle. A detecção histopatológica revelou necrose de células neuronais moderada a grave, vacuolização do neurópilo e hemorragia localizada no córtex e hipocampo de camundongos MCAO recorrentes. Os marcadores inflamatórios também foram induzidos neste procedimento recorrente de MCAO. Este modelo de camundongo MCAO de dois estágios apresenta, pela primeira vez, um método que simula efetivamente o AVC isquêmico recorrente com resultados neurológicos e patológicos consistentes e melhora a sobrevida pós-operatória. Este modelo pode fornecer uma plataforma confiável para estudos mecanísticos e pode ser aplicado na avaliação futura de terapias neuroprotetoras para AVC recorrente.

Introdução

O AVC continua sendo uma das principais causas de morte e incapacidade de longo prazo em todo o mundo, representando um fardo clínico e socioeconômico significativo. Mais de 30 milhões de pessoas em todo o mundo são afetadas pelo AVC e suas consequências, incluindo perda de mobilidade, comprometimento cognitivo e aumento do risco de doenças vasculares 1,2. Apesar dos avanços no tratamento agudo, como trombólise e trombectomia endovascular, muitos sobreviventes permanecem com alto risco de recorrência do AVC, que está associado a pior prognóstico, maior incapacidade e aumento das taxas de mortalidade. Os AVCs recorrentes ocorrem em aproximadamente 10-20% dos pacientes dentro de 90 dias após um evento primário, com o maior risco durante um período de ataque isquêmico transitório ou AVC menor3. Mais importante, o AVC recorrente geralmente afeta territórios vasculares e resulta em infarto mais extenso e lesão grave, como comprometimento hemodinâmico cerebral4, desregulação imunológica aguda e crônica e necrose neuronal subcortical5, sugerindo que o cérebro pode se tornar mais vulnerável e causar mais complicações após um insulto isquêmico inicial.

Alguns estudos recentes realizaram modelos de AVC isquêmico ou hemorrágico em animais experimentais e revelaram padrões de lesão específicos da região, respostas neurovasculares interrompidas e diferentes mecanismos de reparo endógeno para se adequar às condições clínicas humanas 6,7. No entanto, os modelos de pesquisa de AVC recorrente permanecem menos estabelecidos devido aos seus procedimentos complicados e alta taxa de mortalidade. Alguns estudos anteriores estabeleceram um modelo de camundongo fototrombótico, que emergiu como uma ferramenta valiosa para estudar o AVC isquêmico recorrente 8,9,10. Eles demonstraram a lesão neuronal exacerbada, a resposta inflamatória prolongada e o declínio cognitivo em camundongos com AVC recorrente e exploraram os mecanismos subjacentes, incluindo demência multi-infarto e priming inflamatório 8,9,10.

Outro estudo mostrou um novo modelo de camundongo envelhecido de hemorragia intracerebral recorrente no estriado bilateral, que foi injetado com colagenase duas vezes, resultando em recuperação retardada da função locomotora e causou perda cognitiva e lesão neurológica nos camundongos recorrentes11. Vale ressaltar que os modelos de camundongos com AVC fototrombótico e hemorrágico freqüentemente induzem lesões em regiões anatômicas distintas durante o AVC recorrente, refletindo diferenças metodológicas inerentes. Tais variações geram padrões heterogêneos de lesão neuronal, interrompem a dinâmica microcirculatória e exercem efeitos divergentes nas respostas imunes periféricas11,12. Por outro lado, o modelo MCAO, amplamente considerado como o paradigma de roedor mais representativo do AVC isquêmico, oferece a vantagem da estabilidade do procedimento e permite um controle preciso sobre o local e a duração da oclusão cerebral. No entanto, a OCM e a OCM recorrente também demonstraram um risco substancialmente alto de mortalidade13,14, o que impõe limitações significativas à sua aplicabilidade mais ampla em pesquisas experimentais. Neste estudo, nosso objetivo foi estabelecer um modelo de camundongo MCAO de dois estágios estável e reprodutível que imita o AVC recorrente. Avaliamos a lesão neuronal associada, os comprometimentos funcionais e as alterações histopatológicas. Este modelo também demonstrou uma taxa de sobrevida estável, sugerindo sua aplicabilidade para pesquisas futuras sobre fisiopatologia recorrente do AVC e estratégias terapêuticas neuroprotetoras.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Nacional de Taiwan (Plano de Estudo ID20230335) e foram conduzidos seguindo diretrizes éticas estabelecidas para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. Preparação animal

  1. Camundongos C57BL/6J machos de 8 semanas de idade, pesando 20-25 g, sob condições ambientais controladas a 22 ± 1 °C, com 55% de umidade relativa e um ciclo de 12 h de luz/12 h de escuridão. Fornecer atendimento humano com acesso gratuito a alimentos e água destilada.
  2. Atribua aleatoriamente 28 camundongos machos em três grupos: simulado (n = 8), MCAO (n = 10) e MCAO recorrente (n = 10). Animais em quarentena por 2 semanas (−d14); realizar aclimatação, pesagem e agrupamento em −d7; administrar MCAO em d0; realizar testes comportamentais em d0, d2, d14 e d16; e realizar cirurgia recorrente de MCAO em d14.

2. Primeira administração cirúrgica de MCAO

  1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos em autoclavagem, pese cada camundongo, administre carprofeno por via oral a 5 mg / kg 1 h antes da incisão inicial e induza a anestesia com isoflurano a 3% em um gás misturado com oxigênio.
  2. Monitore a frequência respiratória (100-120 respirações/min, BPM) e avalie a profundidade da anestesia verificando a pálpebra e o reflexo de deglutição. Posicione o assunto em uma placa de aquecimento eletrônico para manter a temperatura corporal a 37 °C.
  3. Raspe as costas e o pescoço perto da cabeça e remova o pelo e os detritos dos ratos usando um aspirador. Aplique pomada oftálmica, esfregue a pele e desinfete por procedimentos assépticos para cirurgia de sobrevivência de roedores.
  4. Use tesoura e pinça de pele para fazer a incisão inicial de 0,5 cm entre as orelhas para expor o lado esquerdo da linha de fusão central e posterior ao bregma no crânio. Remova o tecido mole no topo do crânio usando uma pinça.
  5. Centralize o adaptador Laser Doppler no cérebro do mouse e fixe-o com cola de tecido em uma posição 3 mm lateral à esquerda e 2 mm caudal ao bregma, garantindo que a borda do adaptador seja pré-aparada para caber na base do crânio e, em seguida, prenda a tampa do Laser Doppler com adesivo para permitir o monitoramento contínuo do fluxo sanguíneo.
    NOTA: Nesta etapa, fixe a tampa do Laser Doppler com segurança no bregma usando cola de tecido, posicionando-a na interseção das suturas coronal e sagital na linha média superior da calvária para garantir o monitoramento estável do fluxo sanguíneo cerebral.
  6. Quando estiver confiante com a área seccionada, retire a cola de tecido usando a micropipeta e aplique a cola ao redor da base do adaptador.
  7. Prepare o cimento dentário e aplique uma quantidade suficiente para envolver a tampa Doppler para garantir sua estabilidade durante todo o procedimento.
  8. Gire o animal para a posição supina e faça uma incisão na pele de 1 cm da entrada torácica em direção ao queixo ao longo da linha média do pescoço.
  9. Continue com a dissecção romba para separar a barriga posterior dos músculos digástrico, esterno-hióideo e esternomastóideo, seguida pelo uso de afastadores para afastar suavemente os músculos para expor as artérias carótidas comum (CCA), externa (ECA) e interna (ICA) e coloque uma seção de seda 6-0 ao redor da CCA.
    NOTA: Nesta etapa, as glândulas salivares devem ser viradas para cima para facilitar o isolamento da bifurcação da ACC e ECA. O ICA está localizado acima do CCA. A dissecção romba com pinça de pele é usada para prevenir a ruptura vascular e isolar os tecidos moles e os nervos circundantes.
  10. Localize um pequeno ramo (artéria tireoidiana superior, STA) projetando-se da ECA. Use o cauterizador bipolar para queimar este pequeno galho. Prossiga para cortar o recipiente queimado; isso isolará ainda mais o ECA.
    NOTA: O STA é tipicamente o primeiro ramo do ECA emergindo abaixo do nível do corno maior do osso hióide. Para evitar lesões, use um cauterizador bipolar para queimar o ramo do vaso para obter hemostasia.
  11. Coloque duas seções de sutura de seda 6-0 ao redor do ECA. Faça um nó permanente no lado distal do ECA e um nó solto no local da bifurcação.
  12. Coloque a sonda de agulha Laser Doppler no adaptador da sonda no crânio. Certifique-se de que o software de aquisição mostre um valor de leitura do fluxo sanguíneo cerebral (CBF). Registre a leitura da linha de base.
    NOTA: A medida padronizada de FSC obtida pelo Laser Doppler foi apresentada como unidades de perfusão (UP), com valores basais tipicamente calibrados na faixa de 350 a 450. Se forem observados valores reduzidos da unidade de perfusão (PU), ajuste a posição do adaptador da sonda Laser Doppler no mouse para garantir uma medição precisa (consulte a etapa 2.5).
  13. Prenda o ICA usando o grampo do vaso microvascular e use a seção de seda 6-0 ao redor do CCA para fazer um nó deslizante para ligar o CCA temporariamente.
    NOTA: Nesta etapa, uma redução do CBF é detectada no monitor Laser Doppler.
  14. Prepare o monofilamento de nylon revestido de borracha de silicone. Marque o filamento usando o Sharpie prateado a 9-10 mm da ponta da cabeça de silicone e use uma tesoura microcirúrgica para fazer uma pequena incisão entre a sutura apertada e a sutura solta no ECA.
    NOTA: O sangue residual no local da incisão deve ser limpo e enxaguado com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para preservar a integridade vascular.
  15. Insira cuidadosamente o filamento (cabeça de silicone primeiro) no ECA através da pequena incisão.
    NOTA: Esta etapa de inserção do filamento é omitida nos animais simulados.
  16. Quando cerca de metade da cabeça de silicone tiver sido inserida, aperte levemente a sutura solta ao redor da artéria e do filamento e remova a braçadeira do ICA.
  17. Corte o ECA por baixo do primeiro nó apertado, gire cuidadosamente o vaso e o filamento do ECA para baixo (sentido anti-horário) para que a cabeça de silicone aponte para cima e empurre a ponta do filamento para cima em direção ao ICA.
    NOTA: Esta etapa é crítica e deve ser executada lentamente no sentido anti-horário para minimizar a ruptura vascular e reduzir o risco de emaranhamento ou ruptura.
  18. Uma vez que toda a parte de silicone esteja no vaso sanguíneo, aperte levemente a sutura de retenção, afrouxe o nó deslizante no CCA e continue a empurrar o filamento para dentro, usando a marcação prateada no filamento para orientação da posição.
  19. Monitore continuamente o software Laser Doppler e, quando a resistência impedir o avanço do filamento sob a força apropriada enquanto um declínio acentuado no FSC for observado, termine a inserção na artéria cerebral média distal.
    NOTA: A redução do FSC para menos de 30% da condição pré-isquêmica é um procedimento padrão conhecido como método de Longa15.
  20. Mantenha o filamento dentro da MCA por 40 min para induzir lesão isquêmica cerebral.
  21. Remova o filamento após o período isquêmico designado de 40 minutos para restabelecer o FSC, aplique cola de tecido para obter hemostasia, registre a medição correspondente do FSC restaurado, retire todos os afastadores e remova o adaptador montado no crânio.
  22. Feche a incisão na pele perto do vaso com um clipe de ferida, mantenha o monitoramento contínuo da temperatura corporal a 37 °C e avalie a frequência respiratória. Depois de confirmar a pressão arterial estável e a respiração dentro de 160-200 BPM, interrompa a anestesia e permita a recuperação.

3. Segunda administração MCAO

  1. Remova os clipes da ferida 14 dias após a cirurgia inicial do MCAO e, em seguida, repita as etapas 2.1 a 2.9 para realizar a preparação do crânio, garantir a colocação da sonda Doppler a laser e expor o CCA.
  2. Isole o CCA do tecido circundante e coloque três segmentos de sutura de seda 6-0 ao redor do CCA.
  3. Coloque a sonda Laser Doppler no adaptador e registre o CBF da linha de base.
  4. Faça um nó corrediço no lado distal do CCA, um nó permanente na extremidade proximal e um nó solto no meio.
  5. Prepare o nylon revestido de borracha de silicone do filamento de oclusão para administração de MCAO de acordo com a Etapa 2.14 descrita.
  6. Faça uma pequena incisão no CCA próximo ao permanente e insira o filamento no CCA.
    NOTA: O sangue residual no local da incisão também deve ser limpo e enxaguado com PBS para preservar a integridade vascular. Isso é muito importante.
  7. Aperte levemente o nó solto e solte o nó corrediço. Avance o filamento para dentro do ICA até que o filamento esteja sob a força apropriada e seja detectada uma redução acentuada no CBF.
    NOTA: A redução do FSC para menos de 30% da condição pré-isquêmica também é considerada um procedimento padrão.
  8. Mantenha o filamento na posição por 40 min para induzir lesão isquêmica, conforme especificado na etapa 2.20.
  9. Após a conclusão do intervalo isquêmico designado, retire o filamento e feche a incisão na pele seguindo os procedimentos descritos nas etapas 2.21 e 2.22 da cirurgia MCAO inicial.

4. Cuidados pós-operatórios

  1. Administre solução salina normal quente por via subcutânea a 10 mL · kg-1 · dia-1 duas vezes ao dia por 3 dias consecutivos para evitar a desidratação após a cirurgia de MCAO. Aplicar solução de iodopovidona a 10% no local cirúrgico e administrar amoxicilina (10 mg/kg) para prevenir a infecção. Forneça carprofeno (5 mg/kg) por via oral por 3 dias para aliviar o estresse pós-operatório e facilitar a recuperação sob supervisão veterinária após o primeiro e o segundo procedimentos MCAO.
  2. Realize avaliações diárias do estado de saúde dos ratos. Registre mudanças na aparência, bem como no consumo de alimentos e água durante o primeiro e segundo procedimentos.

5. Avaliação da atividade locomotora e lesão neurobiológica do animal

  1. Avalie a atividade locomotora avaliando a trajetória, distância e velocidade do movimento. Posicione os mouses dentro de caixas de teste (10 x 20 x 15 cm) e configure sob uma condição de baixa luminosidade.
  2. Aclimatar o mouse ao ambiente de teste por meio de um período de estabilização de 30 minutos, seguido por uma avaliação formal de 10 minutos. Registre e analise todos os parâmetros, incluindo distância percorrida (cm), velocidade (cm/s), duração (s) do movimento, duração total (s) na zona, latência da primeira ocorrência (s) e graus de rumo (vezes) para determinar a atividade locomotora.
  3. Avalie a lesão neurobiológica usando um sistema de pontuação da função motora modificado (0-6 pontos)16 e referenciando as pontuações mNSS (em parte da avaliação da função motora, 6 pontos)17.
  4. Defina os níveis de lesão da seguinte forma: escore 0 para ausência de déficit neurológico, escore 1 para flexão do membro anterior afetando o punho ou ombro, escore 2 para flexão do membro anterior acompanhada de resistência reduzida ao empurrão lateral, escore 3 para circular unidirecional em direção ao lado do déficit, escore 4 para giro longitudinal em direção ao lado do déficit, escore 5 para giro longitudinal acompanhado de atividade convulsiva, e pontuação 6 para perda completa de movimento.

6. Protocolo de coloração de hematoxilina e eosina

  1. Fixe o MCAO e o tecido cerebral MCAO recorrente em tampão de formaldeído a 10% e disseque a amostra em quatro partes iguais usando um cortador de cérebro de camundongo coronal de 1 mm. Processe a terceira porção anterior para avaliação patológica.
  2. Realize a reidratação de amostras embebidas em parafina: xileno por 10 min, etanol a 95% por 10 min, etanol a 75% por 10 min, etanol a 50% por 10 min, água destilada (ddH2O) por 10 min e PBS por 10 min.
  3. Manchar as amostras: coloração de hematoxilina por 45 s e enxágue em ddH2O quente a 30 °C por 1 min; coloração de eosina por 30 s e em ddH2O frio por 45 s.
  4. Desidratar e secar as amostras em etanol a 75%, 95%, 100% e em xileno por 45 s cada, e secar ao ar por 60 s.
  5. Monte as lâminas e guarde-as em uma câmara escura.
  6. Avaliar a gravidade da lesão de acordo com um critério estabelecido em uma escala de cinco pontos: 1 = mínimo (<1%); 2 = leve (1-25%); 3 = moderado (26-50%); 4 = moderado a grave (51-75%); 5 = grave (76-100%). Realize um exame patológico do tecido cerebral sob avaliação cega por um patologista veterinário.

7. Protocolo de Western blotting

  1. Homogeneizar tecidos cerebrais de camundongos MCAO e recorrentes em tampão RIPA suplementado com inibidor de protease e fosfatase (fluoreto de sódio 30 mM, ortovanadato de sódio 30 mM e pirofosfato de sódio 30 mM).
  2. Centrifugar lisados a 10.000 x g e coletar o sobrenadante. Quantificar a concentração de proteína sobrenadante utilizando um ensaio de ácido bicinconínico (BCA).
  3. Realize o western blotting conforme descrito anteriormente18: carregue 20 μg de proteína total desnaturada, preparada fervendo em água fervente a 100 ° C, em géis de dodecil sulfato-poliacrilamida de sódio a 8-12% (SDS-PAGE).
  4. Transfira com 100 V por 90 min para separar proteínas nas membranas de PVDF na câmara fria e bloqueie as membranas com albumina de soro bovino a 3% por 60 min.
  5. Incubar durante a noite a 4 ° C com fator de necrose tumoral alfa (TNF-α, diluições 1:1000), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH, diluições 1:2.000) e fator 1 alfa induzível por hipóxia (HIF-1α, diluições 1:1.000). Incubar membranas com anticorpos secundários apropriados por 1 h.
  6. Detecte a expressão de proteínas usando um kit de substrato de quimioluminescência (ECL) aprimorado e visualize com um sistema de fotoimagem digital.

8. Análise estatística

  1. Apresentar os dados como média ± erro padrão da média (EPM) e realizar análise estatística usando análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste post hoc de Tukey para determinar diferenças entre vários grupos. Interprete os resultados como estatisticamente significativos quando p < 0,05.

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Resultados

Avaliação da atividade locomotora e da lesão neuronal em camundongos MCAO de primeira e recorrente
Nos primeiros procedimentos de MCAO, um monofilamento de nylon revestido de borracha de silicone foi inserido do ECA, ICA para MCA por 40 min. O fluxo sanguíneo cerebral (FSC) pôde ser detectado como caindo de forma visível (quedas <30% da linha de base) pelo equipamento Laser Doppler, quando o filamento estava permanecendo na área da ACM. Neste procedimento, todos os ca...

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Discussão

O AVC continua sendo a segunda principal causa de mortalidade e incapacidade em todo o mundo, com alto risco de AVC recorrente. Atualmente, apesar dos avanços no desenvolvimento de tecnologia e estratégias médicas, a prevenção do AVC e sua recorrência permanece insuficiente para melhorias. Nas últimas décadas, vários modelos de estudo de AVC têm sido amplamente utilizados na investigação de lesões e mecanismos de AVC isquêmico. Entre eles, o método cirúrgico MCAO é considerado o mais pró...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado tecnicamente pelas equipes do Centro Nacional de Animais de Laboratório e apoiado financeiramente por doações da Fundação do Hospital Universitário Nacional de Taiwan, Taiwan (112-S0074), Hospital da Universidade Médica da China, Taiwan (CMU113-S-06) e do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia, Taipei, Taiwan (112-2314-B-002 -219).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sutura de seda 6-0  Shin-Teh Inc. AVISO.ST1N-ST6
Fatiador coronal de 1 mm para cérebro de camundongoThermo Fisher Scientific Inc., EUAV11335
Máquina de cortar pelos de animaisMAIS URBANO. Inc. TWMB033
Fatiador coronal de cérebro de camundongoInstrumento Zivic. Inc EUA & NBSP;BSMAS001-1
Sistema digital de fotoimagemAzure Biosystem, Inc., Dublin, CA, EUAAzure -300
Cauterizador bipolar eletrônicoIndiamartAARON 940
Placa térmica eletrônicaReptizooAHM23
Pomada para os olhosCuidados Veterinários de Lodi. NOS17033-21-38
Detector Doppler a laserInstrumentos mouro Reino Unido e nbsp;moorVMS-LDF1-HP
Adaptador de sonda Doppler a laserThermo Fisher Scientific Inc.05-700-76
Detector de atividade locomotora Orchid scientific Inc.Todo software de rastreamento Maze.
(Sistema All Maze)Orchid scientific Inc.Trackezi. ver 7.39
Pinça microvascular para vasosShin-Teh Inc. AVISO.ST-M104
Tesouras microcirúrgicas de vasosShin-Teh Inc. AVISO.ST-V108
Monitor de frequência respiratóriaSDR Scientific Ltd. EUASAR-830/AP
Monofilamento de nylon revestido de silicone revestido de borrachaFisher científicaNC1773962
Pinças cutâneasShin-Teh Inc. AVISO.ST-H212
Tesoura de peleShin-Teh Inc. AVISO.ST-S014PK
Cotonete estérilVencedor Médico401 003
Sistema de transferênciaSistema semi-seco. Laboratório Bio-rad, EUA)1703940
Químicos
10% povidona– Solução de iodoYoshida Pharmaceutical Co., Ltd JAPPVP– I  10%
Solução de etanol 75%  Sigma-Aldrich. EUA111727
AmoxicilinaSigma-Aldrich, EUA & nbsp;A5955
Albumina sérica bovinaSigma-Aldrich, EUA.A2153
CarprofenoPlexx Inc. Reino UnidoMD150-2
Anticorpo GAPDHSanta Cruz Biotechnology, CA, EUASC-32233
H& Solução EBioPioneer Tech. CO. TWG1005
Anticorpo fator 1 alfa induzível por hipóxiaTecnologia de Sinalização Celular, MA, EUA#36169
Isoflurano (anestésico)Ciências da VidaR510-22-10
Soro fisiológico normal estérilNova-Tech Inc. EUA1760RX
Fator de necrose tumoral alfaTecnologia de Sinalização Celular, MA, EUA#3707

Referências

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Errata


Formal Correction: Erratum: Investigating Ischemic Stroke Recurrent Injury in a Secondary Middle Cerebral Artery Occlusion Model in Mouse
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68806

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