Artigo de método

Estimulação de células endoteliais vasculares usando armadilhas extracelulares de neutrófilos na presença de lipoproteína de baixa densidade

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DOI:

10.3791/68830

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12 de agosto de 2025

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1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

Neste artigo

Resumo

Uma série de métodos é descrita, incluindo o isolamento da lipoproteína de baixa densidade (LDL) do plasma humano, diferenciação de células HL-60 em células semelhantes a neutrófilos, preparação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) na presença de LDL e estimulação de células endoteliais aórticas humanas com uma mistura de NETs e LDL.

Resumo

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs) surgiram como fatores causais em várias doenças não infecciosas e têm sido implicadas em distúrbios cardiovasculares, como aterosclerose e trombose. A formação de TNE é observada na parede vascular, e há evidências convincentes de que os marcadores plasmáticos de formação de TNE aumentam com a gravidade da doença. Os componentes do TNE derivados de neutrófilos, incluindo mieloperoxidases e proteases, afetam as lipoproteínas plasmáticas e a homeostase vascular. Aqui, uma série de métodos para estimular células vasculares com TNEs formadas na presença de lipoproteína de baixa densidade (LDL) é descrita. O LDL foi fracionado do plasma humano por ultracentrifugação. As células HL-60 foram tratadas com ácido all-trans retinóico para diferenciá-las em células semelhantes a neutrófilos e, em seguida, estimuladas com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) para induzir a formação de NET. Após a remoção e lavagem do PMA, as células foram incubadas com LDL. Os sobrenadantes coletados contendo TNEs e LDL foram imediatamente utilizados para estimular as células endoteliais da aorta humana (HAECs). Como resposta representativa, a alteração morfológica dos HAECs induzida pelo tratamento com TNE foi aumentada pela presença de LDL, sugerindo que a formação de NET, em combinação com LDL, aumenta a resposta dos HAECs. Esses métodos são benéficos para explorar os efeitos do LDL nas células endoteliais sob ativação de neutrófilos e inflamação associada ao TNE, fornecendo novos insights sobre os mecanismos subjacentes às doenças cardiovasculares associadas ao aumento do LDL plasmático.

Introdução

Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), produzidas por neutrófilos ativados após infecção bacteriana, bem como sob condições fisiologicamente plausíveis não infecciosas, liberam DNA e proteínas descondensados, como histonas, mieloperoxidase (MPO) e elastase de neutrófilos1. Como esses componentes podem desmantelar células e tecidos marginais, causando inflamação persistente, a formação de TNE emergiu como um fator causador no início e progressão de várias doenças agudas e crônicas, incluindo artrite reumatoide, psoríase, diabetes, doença de Alzheimer, metástase de câncer e doenças cardiovasculares2. Análises histológicas de lesões vasculares humanas de aterosclerose3 e aneurisma de aorta abdominal4 mostraram que a infiltração de neutrófilos e a formação de TNE foram colocalizadas. No sangue circulante, os níveis de marcadores NETs, como histonas citrulinadas, NET-DNA e MPO, aumentam com a gravidade da doença arterial coronariana5. Nos estágios iniciais da aterosclerose, a formação de TNE geralmente precede o acúmulo de lipídios, que ocorre por meio da formação de células espumosas acionadas por macrófagos 6,7. Esses fenômenos sugerem fortemente que a MPO e as enzimas proteolíticas liberadas extracelularmente durante a formação do TNE podem atuar não apenas nos tecidos vasculares, mas também nos componentes do sangue, como as lipoproteínas. As lipoproteínas são complexos lipídico-proteicos frágeis que podem ser danificados por proteínas derivadas de TNE, como MPO8; portanto, a formação de TNE pode causar alterações estruturais e bioquímicas nas lipoproteínas, influenciando a homeostase vascular. No entanto, os efeitos sinérgicos da formação de TNE e lipoproteínas na desregulação induzida por células vasculares e nas respostas inflamatórias permanecem obscuros.

Aqui, este manuscrito fornece um método para examinar as respostas celulares de células endoteliais vasculares humanas induzidas pelo tratamento com NETs preparadas a partir de células semelhantes a neutrófilos derivadas de HL-60 e lipoproteínas de baixa densidade (LDL) fracionadas de plasma humano. Resultados representativos demonstram o fracionamento de LDL do plasma humano por ultracentrifugação e as respostas celulares de células endoteliais aórticas humanas (HAECs) estimuladas com NETs após co-incubação com LDL. Este método é amplamente aplicável ao estudo de células vasculares envolvendo outras lipoproteínas.

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Protocolo

O protocolo para preparação do LDL foi aprovado pelo comitê de ética da Escola de Farmácia da Universidade Médica Showa (nº 231). O consentimento informado por escrito foi obtido de acordo com a Declaração de Helsinque, e todos os participantes forneceram voluntariamente suas assinaturas para participação neste estudo. As células foram manipuladas assepticamente usando uma capela de fluxo laminar. O critério de inclusão foi a faixa etária de 22 a 65 anos. Os critérios de exclusão incluíram hábitos tabágicos, doenças cardiovasculares pré-existentes (como doenças coronarianas, acidente vascular cerebral e doenças arteriais periféricas), disfunção hepática grave e condições crônicas não controladas, incluindo diabetes, hipertensão, dislipidemia, doenças inflamatórias graves e câncer. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento do LDL do plasma humano

  1. Colete sangue total de um voluntário humano saudável na presença de heparina anticoagulante (10 unidades / mL).
  2. Centrifugar 45-50 ml de sangue total humano obtido num tubo de heparina (700 × g durante 15 min a 4 °C). Certifique-se de reduzir lentamente a velocidade da centrífuga. Recolher a camada superior que compreende a fracção plasmática.
  3. Efectuar a centrifugação duas vezes (700 × g, 15 min a 4 °C) com a mesma desaceleração que no passo 1.2 para eliminar as células sanguíneas. Adicione um volume de 1:1.000 de EDTA 250 mM (pH 7,4) para evitar a oxidação mediada por íons metálicos divalentes de lipoproteínas.
  4. Coloque 2,7 mL de plasma em um tubo de policarbonato de 4 mL (4PC), cubra 900 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 250 μM EDTA (PBS/EDTA) e ultracentrífuga (600.000 × g, 7 min a 4 ° C).
  5. Descarte 900 μL da camada superior para eliminar o quilomícron. Empilhe 900 μL de PBS/EDTA no plasma e na ultracentrífuga (600.000 × g, 2,5 h a 4 °C).
  6. Descarte 900 μL da camada superior para eliminar a lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL). Esta etapa é importante para evitar a contaminação do LDL com outras frações lipoproteicas.
  7. Adicione 540 μL de solução KBr 0,5 mg / mL para ajustar a densidade para d = 1,063, seguido de mistura suave com uma pipeta e depois ultracentrífuga (600.000 x g, 2,5 h a 4 ° C).
  8. Colete 540 μL da camada superior contendo LDL. Uma camada amarelo-laranja indica separação bem-sucedida do LDL9. Transfira para uma membrana de diálise.
  9. Dialisar a fração LDL três vezes contra 2 L de PBS/EDTA a 4 °C no escuro para eliminar KBr.
  10. Conservar o LDL a 4 °C no escuro antes de utilizar.

2. Preparação de poços revestidos de poli-L-lisina ou gelatina

  1. Prepare uma solução de poli-L-lisina a 0,01%10 diluindo a solução de poli-L-lisina a 0,1% com água estéril, seguida de filtração com um filtro estéril de 0,2 μm. Conservar a 4 °C antes de utilizar.
  2. Adicione 152 μL / poço de solução de poli-L-lisina a 0,01% a cada poço de uma placa de 12 poços e incube por pelo menos 5 min.
  3. Remova a solução e lave uma vez com 200 μL / poço de água estéril e seque por pelo menos 2 h.
  4. Armazene em temperatura ambiente antes de usar na preparação de TNEs.

3. Preparação de poços revestidos de gelatina

  1. Prepare uma solução de gelatina a 0,1% antes de usar, diluindo a solução de gelatina a 2% com água estéril.
  2. Adicionar 152 μL/alvéolo da solução de gelatina a 0,1 % a cada alvéolo de uma placa de 12 poços e incubar durante, pelo menos, 5 min11.
  3. Remova a solução e lave uma vez com 200 μL / poço de água estéril e seque por pelo menos 2 h.
  4. Armazene em temperatura ambiente antes de usar.

4. Manutenção e preparação de células endoteliais da aorta humana (HAECs)

  1. Cultura de HAECs primários em frasco de cultura não revestido utilizando meio completo contendo 2% de soro fetal de vitelo (FCS), 5 ng/ml de fator de crescimento epidérmico, 10 ng/ml de fator básico de crescimento de fibroblastos, 20 ng/ml de fator de crescimento semelhante à insulina, 0,5 ng/ml de fator de crescimento endotelial vascular, 1 μg/ml de ácido ascórbico, 22,5 μg/ml de heparina e 0,2 μg/ml de hidrocortisona, conforme indicado nas instruções do fabricante. Mude o meio a cada dia alternado até que as células estejam 70% -80% confluentes.
  2. Para estimulação, semeie HAECs em placas de 12 poços revestidas com gelatina. Mude o meio a cada dia alternado até que a confluência seja alcançada. Realize o experimento entre as passagens 4 e 7.

5. Preparação de células semelhantes a neutrófilos derivadas de HL-60 seguidas de NETs

  1. Manter as células HL-60 com meio RPMI-1640 suplementado com 5% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina, utilizando placas não tratadas.
  2. Para a preparação de células semelhantes a neutrófilos derivadas de HL-60, cultive 2 × 106 células por 10 mL de células HL-60 por 4 dias em meio RPMI-1640 contendo 2 μM de ácido all-trans retinóico (AtRA).

6. Preparação de TNEs com LDL

  1. Colete células HL-60 4 dias após o tratamento com 2 μM de AtRA. Após a diferenciação das células HL-60 em células semelhantes a neutrófilos, as células tornam-se menores.
  2. Células de centrífuga (220 × g, 4 min a 18-22 °C). Aspire o sobrenadante e lave as células com um volume igual de RPMI-1640 sem soro.
  3. Centrifugue as células (220 × g, 4 min a 18-22 °C) e, em seguida, ressuspenda as células com RPMI-1640 sem soro.
  4. Conte as células e, em seguida, ressuspenda as células para 2 × 106 células / mL em RPMI-1640 sem soro e semeie 0,5 mL de suspensão celular nos poços de uma placa de 12 poços pré-revestida com poli-L-lisina. Cultura por pelo menos 30 min.
  5. Adicione 100 μL de RPMI-1640 sem soro com ou sem 300 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) à concentração final de 0 ou 50 nM de PMA. Cultura por 30 min.
  6. Remova o meio e lave as células uma vez com RPMI-1640 sem soro. Substitua o meio por RPMI-1640 sem soro com ou sem 20 μg / mL de LDL e, em seguida, cultive por 2 h.
  7. Colete o meio de cultura e centrífugo (700 × g, 3 min a 18-22 °C) para remover os detritos celulares.

7. Estimulação de AECs com TNEs e LDL

  1. Substitua o meio por 0,5 mL de meio de cultura fresco. Cultura por pelo menos 30 min antes da estimulação.
  2. Adicione 167 μL do meio de cultura contendo NETs e LDL (etapa 6.7) e LDL às placas de HAEC. Verificar as alterações morfológicas nos HAECs induzidas após estimulação durante 12 h ou mais.

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Resultados

Após a remoção dos quilomícrons, seguida de frações VLDL do plasma humano por meio de ultracentrifugação sequencial, o plasma humano foi misturado com uma solução KBr para ajustar a densidade para d = 1,063. Nesta etapa, o precipitante remanescente não foi completamente dissolvido na solução, e a mistura severa, que criou bolhas de gás, foi evitada para manter o LDL intacto. Após a ultracentrifugação, o LDL foi avaliado visualmente na camada superior por sua cor amarelo-alaranjada9 (

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Discussão

Este protocolo descreve a preparação de TNEs a partir de células dHL-60 induzidas pela coexistência de LDL, que são posteriormente utilizadas para analisar as respostas do HAEC. A importância deste protocolo é o uso de meio fresco contendo NETs e LDL para a estimulação das células, embora muitos outros estudos utilizem uma solução estoque de NETs congeladas a -20 °C. Como as lipoproteínas são complexos lipídico-proteicos, suas estruturas e características intactas são perdidas durante o...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado em parte pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência, KAKENHI (números de concessão 23K10897 e 19K07069). Gostaríamos de agradecer à Editage (www.editage.jp) por editar o idioma inglês.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,1% de poli-L-lisinaSigmaAldrichRolamento P8920-100ML
Prato de 10 cmCorning430591
Placas de cultura de tecidos de 12 poçosFalcão353043
2% de gelatinaSigmaAldrichG1393-20ML
tubo 4PCHimacS404332A
ácido retinóico totalmente transWako188-01113Pode ser substituído por qualquer fornecedor
Tubo de diálise CelluroseMISUMI Group Inc.0327-23-37-07 (UC18-32-100)Pode ser substituído por qualquer fornecedor
EDTADojindo345-01865Pode ser substituído por qualquer fornecedor
Kit de Meio de Crescimento de Células Endoteliais 2PromoCellC-22111
Soro fetal bovinoGibco10270-106Pode ser substituído por qualquer fornecedor
Heparina sódica (5.000 unidades/5 mL)Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.Pode ser substituído por qualquer fornecedor
Centrífuga refrigerada de alta velocidadeTOMYSRX-201Aceleração: 9, Desaceleração: 7
células endoteliais da aorta humanaLonzaCC-2535
KBrWako168-03475Pode ser substituído por qualquer fornecedor
Software de microscopia KEYENCEKEYENCEAnalisador BZ-II
Micro UltracentrífugaHimacCS150GX
MicroscopiaOLIMPOCK40
MicroscopiaKEYENCEBZ-9000Para imagens de lapso de tempo (opcional)
Câmera de microscopiaNikonDS-Fi3
Software para câmera de microscopiaNikonDS-L4
Penicilina/estreptomicinaGibco15140-122 100MLPode ser substituído por qualquer fornecedor
tampão fosfato salino (× 10)Dissolver 2,6 g de NaH2PO4· 2H2O, 29 g de Na2HPO4· 12H2O, 80 g de NaCl e 2,0 g de KCl em água destilada e ajustar ao volume de 1 L. (Pode ser substituído por qualquer fornecedor)
PMA (Phorbol 12-Miristato 13-Acetato)Wako162-23591Pode ser substituído por qualquer fornecedor
Pacote de reagentesLonzaCC-5034(CC-5022: Solução salina tamponada com HEPES, CC-5012: Tripsina/EDTA, CC-5002: Solução neutralizante de tripsina) 
RotorHimacS100AT6-0242
RPMI-1640 (com vermelho de fenol)Wako189-02025Pode ser substituído por qualquer fornecedor
RPMI-1640 (sem vermelho de fenol)Wako186-02155Pode ser substituído por qualquer fornecedor
Balão T-25Corning3275

Referências

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