Neste protocolo, um ensaio combinado de amplificação da polimerase recombinase CRISPR/Cas12a é ilustrado para a detecção do patógeno invasor da planta, Fusarium oxysporum f. sp. cubense raça tropical 4.
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Artigo de método
Ensaio CRISPR/Cas12a de amplificação da polimerase recombinase combinada para detecção de Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4
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Neste artigo
Resumo
Resumo
A vigilância regular e precisa é fundamental para o gerenciamento eficiente de doenças de plantas. Pode indicar qual curso de ação é mais apropriado e se é necessária prevenção, erradicação ou nenhuma ação. A vigilância baseada apenas na sintomatologia em plantas hospedeiras muitas vezes não é confiável devido às semelhanças nos sintomas causados por estresses bióticos e abióticos. Métodos moleculares baseados em laboratório, como reação em cadeia da polimerase (PCR) e (q)PCR quantitativo, são os mais comumente e confiáveis usados para detecção de patógenos de plantas, mas dependem de equipamentos caros e operadores qualificados. Aqui, descrevemos um protocolo que combina uma extração simplificada de DNA, amplificação da polimerase recombinase (RPA) e repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) / Cas12a (RPA-Cas12a) para a detecção do patógeno invasor, Fusarium oxysporum f. sp. cubense raça tropical 4 (Foc TR4). A técnica fornece uma alternativa simples de detecção de tubo único que é analiticamente robusta com especificidade aprimorada em comparação com os ensaios de detecção molecular disponíveis e elimina a necessidade de equipamentos de laboratório caros e sofisticados.
Introdução
A murcha de Fusarium, causada pelo patógeno fúngico transmitido pelo solo Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc), é globalmente considerada como um dos patógenos de plantas transfronteiriças mais devastadores da história1. Uma vez introduzido em uma nova área, o Foc permanece invisível até que as plantas infectadas desenvolvam sintomas. Isso pode levar meses, permitindo que o fungo se estabeleça e se espalhe sem saber. Uma vez estabelecido, é quase impossível erradicar economicamente devido à produção de clamidósporos resilientes e à natureza perene da produção de banana. A importância da prevenção e detecção precoce, portanto, é fundamental para proteger os produtores vulneráveis1. A atual epidemia da doença, causada pela raça tropical Foc 4 (TR4), requer detecção por vigilância regular para identificar bananeiras sintomáticas em áreas de alto risco. Restrições abióticas, como estresse hídrico e certas deficiências nutricionais, produzem amarelecimento externo, que é semelhante aos sintomas produzidos pela infecção por Foc TR4. Além disso, os sintomas resultantes da infecção por diferentes raças de Foc não podem ser distinguidos. A purificação laboratorial e a subsequente detecção fenotípica e molecular são, portanto, necessárias para a detecção confiável de Foc TR42. Vários ensaios moleculares estão disponíveis para detecção de Foc TR4, incluindo PCR, PCR quantitativo (q) e ensaios de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) 3,4,5,6,7. A maioria desses protocolos, no entanto, ainda requer habilidades e equipamentos caros e especializados, que devem ser conduzidos em ambientes de laboratório. A amplificação da polimerase recombinase (RPA) pode ser realizada isotermicamente e, portanto, elimina a necessidade de tais equipamentos e pode ser considerada para protocolos de detecção em campo8.
Os sistemas de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR)-Cas têm sido cada vez mais utilizados para melhorar o diagnóstico molecular9. Esses sistemas são empregados porque são baratos, simples e não requerem o uso de instrumentação especial e, portanto, podem ser considerados para detecção em campo. Os diagnósticos baseados em CRISPR geralmente envolvem a amplificação isotérmica de uma sequência alvo, seguida pelo reconhecimento do alvo por meio de proteínas CRISPR-Cas e a clivagem colateral de um corante repórter fluorescente de DNA ou RNA para indicar a presença do alvo10,11. Nos sistemas CRISPR-Cas12a, especificamente, o RNA CRISPR (crRNA) orienta Cas12a para reconhecer e clivar alvos de ácidos nucleicos. Este crRNA pode ser projetado para atingir uma região específica de DNA ou RNA de interesse por meio de hibridização para uma sequência complementar. Uma vez ligado, resulta em Cas12a clivando o alvo com especificidade de nucleotídeo único, seguido por clivagem colateral de moléculas repórter12. Recentemente, os sistemas CRISPR-Cas12a foram empregados para detectar vários patógenos fúngicos de plantas economicamente importantes 13,14,15,16,17,18,19,20.
Neste protocolo, é descrito o desenvolvimento de uma técnica de detecção de tubo único, combinando uma extração simplificada de DNA, amplificação da polimerase recombinase (RPA) e tecnologia CRISPR/Cas12a (RPA-Cas12a) para a detecção de Foc TR4, que foi visualizada tanto em um fluorômetro portátil quanto a olho nu sob um transiluminador de luz azul de diodo emissor de luz (LED) de baixo custo21. O método pode ser otimizado ainda mais para detecção em campo para melhorar as estratégias de prevenção e contenção. Uma abordagem semelhante também pode ser utilizada para projetar ensaios de detecção baseados em Cas12a para outros patógenos de plantas.
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Protocolo
1. Extração simplificada de DNA de material vegetal
NOTA: Consulte a Figura 1 para obter uma visão geral.
- Realize a extração de DNA.
- Transfira 250 mg de cada pedaço de pseudocaule sintomático para um saco de extração separado (ver Tabela de Materiais).
- Adicione 2 mL de NaOH-PVP 0,5 M (Tabela de Materiais) aos sacos com material vegetal. Moa os vasos infectados em um saco de extração usando um moedor manual como um pilão.
NOTA: Adicione 1-2 mL suplementares de NaOH-PVP 0,5 M, se necessário, para obter extrato líquido suficiente da bolsa. - Adicione 195 μL de Tris-HCL 100 mM (pH 8,0) (Tabela de Materiais) em tubos de 1,5 mL.
- Pipete 5 μL de extrato do saco para o tubo de 1,5 mL com 195 μL de Tris-HCL 100 mM (pH 8,0), diluindo o extrato 40 vezes.
- Vortex os tubos por 15-30 s e armazene a -20 °C até o uso.
2. Síntese de crRNA e controle de qualidade
- Execute a transcrição.
- Usando o kit de transcrição de RNA (Tabela de Materiais), adicione o seguinte a um tubo de PCR de 0,2 mL: 1,5 μL de tampão de reação 10x T7, 1,5 μL de cada dNTP, 1,5 μL de mistura de DNA polimerase T7, 1 μL de água livre de nuclease e 10 μL de DNA molde T7 de 100 μM para um volume total de 20 μL.
- Incubar o tubo a 37 °C em banho-maria ou máquina de PCR durante pelo menos 4 h.
- Use um espectrofotômetro (Tabela de Materiais) para determinar a quantidade de RNA transcrito. Dilua o RNA a 250 ng/μL (10 μg) em um volume de 40 μL usando água livre de nuclease ou tampão TE (Arquivo Suplementar 1).
NOTA: O RNA transcrito pode ser armazenado a -80 °C até continuar com os tratamentos DNase e etapas de limpeza.
- Realize o tratamento com DNase e a limpeza do crRNA.
NOTA: Execute todas as etapas em temperatura ambiente. Mantenha a enzima RNA e DNase I no gelo.- Trate a amostra de RNA com DNase I incluída no kit de limpeza de RNA (Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante22.
- Limpe o RNA sample usando o kit de limpeza de RNA de acordo com as instruções do fabricante, seguindo o Protocolo II22.
- Nanodrop o crRNA limpo para determinar a quantidade e a qualidade presentes. Diluir o RNA a 100 ng/μL usando água livre de nuclease e armazenar a -80 °C até o uso.
- Aqueça o crRNA com corante de carga de RNA (Tabela de Materiais) a 70 ° C por 10 min em banho-maria e submeta o crRNA à eletroforese em um gel de agarose a 1,5% para visualizar o crRNA sintetizado (Figura 2).
3. Amplificação da polimerase recombinase (RPA)-Cas12a reação de um tubo para detecção in vitro de Foc TR4
NOTA: Consulte a Figura 3 para obter uma visão geral.
- Prepare as misturas de reação RPA e Cas12a.
NOTA: Certifique-se de que essas etapas sejam realizadas em um espaço livre de DNA no gelo, com os reagentes e materiais pré-resfriados. Limpe a superfície de trabalho e as pipetas com água sanitária e etanol 70% antes do experimento. Consulte a Tabela 1 para obter informações sobre todos os oligonucleotídeos usados neste estudo.- Prepare uma mistura de reação Cas12a de 20 μL em um tubo separado de 0,5 mL (Tabela de Materiais) com os seguintes volumes de reagente: 2 μL de 10x NEBuffer r2.1 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 μg/mL de Albumina Recombinante, pH 7,9), 0,4 μL de 10 μM de proteína LbCas12a, 0,6 μL de 100 ng/μL crRNA, 0,4 μL de repórter de 10 μM e 16,6 μL de água deionizada.
NOTA: As concentrações finais da proteína LbCas12a, crRNA e repórter são de 200 nM, respectivamente. - Prepare uma mistura de reação RPA de 9,5 μL em um tubo separado de 0,5 mL com os seguintes volumes de reagente: 5 μL de tampão de reação 2x (concentração final 1x de acordo com as diretrizes do fabricante), 1,6 μL de mistura dNTP (concentração final 1,6 mM), 1 μL de 10x Basic E-Mix (concentração final 1x de acordo com as diretrizes do fabricante), 0,5 μL de cada primer RPA a 10 μM (concentração final de 0,5 μM cada), 0,5 μL de mistura de reação de núcleo 20x (concentração final 1x de acordo com as diretrizes do fabricante) e 0,4 μL de água deionizada.
- Coloque uma tira de 8 tubos em um rack de tubos (Tabela de Materiais) no gelo.
- Transfira a mistura de reação Cas12a de 20 μL para a base do tubo.
- Transfira a mistura de reação RPA de 9,5 μL para a tampa da tira do tubo. Adicione 0,5 μL de 280 nM MgOAc (concentração final de 14 nM) à mistura de reação RPA na tampa da tira do tubo e misture pipetando para cima e para baixo.
- Adicione 0,5 μL de água deionizada à tampa do tubo de controle não molde (NTC) e feche com cuidado para garantir que as misturas de reação RPA e Cas12a não sejam combinadas.
NOTA: Um controle sem modelo (NTC) está incluído para garantir a confiabilidade dos resultados.
- Prepare uma mistura de reação Cas12a de 20 μL em um tubo separado de 0,5 mL (Tabela de Materiais) com os seguintes volumes de reagente: 2 μL de 10x NEBuffer r2.1 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 μg/mL de Albumina Recombinante, pH 7,9), 0,4 μL de 10 μM de proteína LbCas12a, 0,6 μL de 100 ng/μL crRNA, 0,4 μL de repórter de 10 μM e 16,6 μL de água deionizada.
- Adicione o DNA modelo e inicie a reação.
- Adicione 0,5 μL de DNA molde à mistura de reação RPA de 10 μL contendo MgOAc na tampa da tira de tubo, exceto para o NTC, com água deionizada no lugar do DNA. Sempre adicione um DNA Foc TR4 de controle positivo conhecido em um poço para garantir que o ensaio funcione conforme o esperado. Misture pipetando para cima e para baixo.
- Feche cuidadosamente as tampas das tiras de tubos para garantir que a reação RPA e Cas12a não se misture.
- Ligue o fluorômetro portátil (Tabela de Materiais) e crie um Run Profile para o ensaio RPA-Cas12a (Suplementar File 2). Abra o Run Profile salvo e coloque a tira de tubo no fluorômetro portátil para incubar por 30 min a 37 °C.
NOTA: Tenha cuidado para não tocar no fundo dos tubos ao manusear a tira de tubos; em vez disso, segure as bordas externas na extremidade superior esquerda e direita. - Remova a tira do tubo do fluorômetro portátil após 30 min. Inverta os tubos seis vezes para misturar as reações RPA e Cas12a e gire para baixo em uma mini centrífuga (consulte a Tabela de Materiais) por 5 s.
- Coloque a tira de tubo de volta no fluorômetro portátil e incube por mais 30 minutos a 37 ° C usando o Run Profile salvo.
- Visualize os resultados.
- Interprete as unidades de fluorescência relativas médias (RFUs) medidas no fluorômetro portátil (Suplementar File 2 e o manual do usuário23).
- Visualize os tubos sob luz azul LED no comprimento de onda de excitação de 465 nm usando um transiluminador de luz azul (Arquivo Suplementar 3). Capture imagens com uma câmera de telefone.
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Resultados
A detecção bem-sucedida de Foc TR4 de material vegetal infectado usando extração simplificada de DNA seguida pelo ensaio combinado RPA-Cas12a quando conduzida no fluorômetro portátil Genie III é ilustrada na Figura 4A. As amostras positivas mostram fluorescência visível (pista 6-8), enquanto as amostras negativas mostram fluorescência de ponto baixo (pista 1-5). Quando os tubos de amostra foram visualizados sob luz azul LED, as amostras infectadas com Foc TR...
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Discussão
A vigilância regular é uma estratégia importante para esforços eficazes de prevenção e contenção de Foc TR4 e outras pragas invasoras importantes. Protocolos de detecção que podem ser aplicados em campo e identificar patógenos com rapidez e precisão podem acelerar a tomada de decisões e limitar os custos associados aos esforços de vigilância. Para tanto, o protocolo aqui apresentado combinou uma extração simplificada de DNA, realizada diretamente no material vegetal amostrado, que foi po...
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros ou intelectuais concorrentes.
Agradecimentos
Reconhecemos o financiamento da Fundação Nacional de Pesquisa da África do Sul, número de concessão: 138109, sob o programa de apoio competitivo para pesquisadores não classificados. Também reconhecemos o financiamento da bolsa Marie Sklodowska-Curie do programa de pesquisa e inovação Horizonte 2020 da União Europeia sob o número de concessão do projeto INDICANTS: 890856.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Proteína EnGen Lba Cas12A (Cfp1) | Biolaboratórios da Nova Inglaterra | M0653T | |
| Diluente EnGen Lba Cas12a | Biolaboratórios da Nova Inglaterra | B0653A | |
| Tubos de PCR Eppendorf | Merck | EP0030124332 | |
| Tubos de Ensaio Micro Eppendorf Safe-Lock | Merck | EP0030121708 | |
| Sacos de Extração Universais | BIOREBA | 430100 | |
| GeneRuler Escada de DNA 100 pb | Thermo Fischer Scientific | SM0241 / SM0242 | |
| Centrífuga Genie Mini-6KO | OptiGene | OP-FUGE | |
| Gênio III | OptiGene | https://www.optigene.co.uk/instruments/genie-iii/ | |
| Suporte para Tira Genie | OptiGene | GBLOCK-01 / GBLOCK-02 / GBLOCK-03 | |
| Tiras Genie | OptiGene | OP-0008-50 / OP-0008-500 | |
| Kit de Síntese de RNA de Alto Rendimento HiScribe T7 | Biolaboratórios da Nova Inglaterra | E2040S | |
| Espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 UV/Vis | Thermo Fischer Scientific | https://caeonline.com/buy/spectrometers/nanodrop-nd-1000/293669253 | |
| NEBuffer 3 | Biolaboratórios da Nova Inglaterra | B7003S | |
| NEBuffer r2.1 | Biolaboratórios da Nova Inglaterra | B6002S | |
| Pó de polivinilpirrolidona (PVP) | Sigma-Aldrich | 9003-39-8 | |
| Kit de RNA Clean e Concentrador-5 | Zymo Research | R1013 | |
| Corante de Carga de RNA | Thermo Fischer Scientific | R0641 | |
| Transiluminador SmartBlue Blue Light | Instrumentos Accuris | E4000-E | |
| Pellets de hidróxido de sódio (NaOH) | Merck, EMPARTA | K277 | |
| Tris (hidroximetil) aminometano | Merck | 77-86-1 | |
| Kit Básico Líquido TwistAmp | TwistDx | TALQBAS01 |
Referências
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Reimpressões e permissões
