Estabelecimento e Avaliação de um Modelo Ovino de Defeito Osteocondral de Espessura Total

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo integrado para gerar lesões osteocondrais controladas nos joelhos de ovelha, a fim de estabelecer um modelo experimental adequado para estudos de regeneração óssea e cartilaginosa. O protocolo descreve um método para induzir um defeito osteocondral de espessura total no côndilo femoral, utilizando técnicas que minimizam os impactos no bem-estar animal e a variabilidade nos resultados.

Resumo

Envelhecimento, traumas, predisposição genética e estilo de vida impactam a degradação da cartilagem do corpo humano. Uma vez ferido, insultos contínuos resultantes das atividades diárias podem desencadear condições patológicas como osteoartrite, a principal causa de deficiência e perda socioeconômica no mundo. O principal objetivo de todos os cirurgiões ortopédicos que tratam lesões da cartilagem articular tem sido reduzir a extensão anatômica da lesão, reparar a superfície da cartilagem e restabelecer a estabilidade articular. Modelos animais são essenciais para o desenvolvimento de medicamentos terapêuticos, mas os modelos atuais para defeitos de cartilagem são insatisfatórios. Lesões osteocondrais em ovelhas são um modelo valioso para testar novas terapias e biomateriais que podem auxiliar na recuperação da cartilagem e do osso em ambientes articulares humanos. Este estudo estabeleceu um protocolo eficiente para induzir defeitos osteocondrais agudos em animais de grande porte. Uma lesão padronizada foi criada em ambos os côndilos femorais mediais. Um joelho foi designado aleatoriamente para receber tratamento com gelatina-metacriloíla, enquanto o joelho contralateral serviu como controle. Seis meses após o procedimento cirúrgico, a área do côndilo femoral foi removida, as articulações do joelho dissecadas foram descalcificadas, embutidas em parafina e cortadas em seções, que foram tingidas com hematoxilina e eosina. As pontuações foram usadas para avaliar a lesão. Essa metodologia permite observação macroscópica imediata após a indução da lesão. Além disso, esse modelo replica efetivamente defeitos clínicos da cartilagem, fornecendo um modelo valioso para estudar sua patologia e desenvolver abordagens terapêuticas inovadoras.

Introdução

A cartilagem é essencial para preservar a competência mecânica do sistema esquelético, fornecendo uma superfície sem atrito entre os ossos nas articulações diartródicas, prevenindo assim a erosão da superfície^{articular 1}. A capacidade da cartilagem de realizar essas funções mecânicas exigentes depende fortemente da composição e organização únicas de sua matriz extracelular — particularmente seu teor excepcionalmente alto de água. A água desempenha um papel crucial na estrutura e função da cartilagem articular, representando aproximadamente 70-80% de sua composição. A água é o principal elemento responsável pela carga durante a compressão. A capacidade do tecido de resistir às forças compressivas depende de como a água é estruturada e restringida dentro da matriz. Essa organização é possível pela interação da água com as principais macromoléculas da cartilagem, como colágeno e proteoglicanos, especialmente agregados ligados ao ácido^{hialurônico 1}. Esses atuam como estruturas de contenção que ordenam e limitam o movimento da água. Essa interação proporciona ao tecido não apenas rigidez, mas também resiliência e a capacidade de se recuperar após a deformação. A interação entre água livre, água ligada e a matriz macromolecular constitui o núcleo do comportamento biomecânico^{da cartilagem 2}.

Apesar de sua notável capacidade de suportar e distribuir cargas físicas e mecânicas que atingem as articulações, uma vez lesionada, a cartilagem articular (CA) tem potencial limitado para reparo espontâneo devido à baixa atividade mitótica dos condrócitos e à fraca vascularização^{tecidual 2}. O dano articular geralmente está associado à perda progressiva de moléculas e proteínas da matriz extracelular (ECM), que constituem 95% do tecido e conferem características biomecânicas à AC³. Um desequilíbrio entre síntese e degradação dos componentes da MEC, que se desloca para processos catabólicos, pode resultar em osteoartrite (OA), a doença degenerativa articular mais prevalente no mundo. A osteoartrite afeta aproximadamente 10-12% da população adulta, causando dor, limitando a mobilidade e reduzindo significativamente a autonomia dos^{pacientes 4}. A osteoartrite é mais prevalente em populações envelhecidas devido a insultos acumulados na articulação ao longo da vida; No entanto, diversos fatores de risco têm sido associados ao início da condição clínica, como gênero, predisposição genética, obesidade e hábitos diários⁴. Até agora, as abordagens terapêuticas para tratar a OA consistiam no manejo clínico dos sintomas e na substituição total das articulações nos casos mais^graves. Sem uma estratégia terapêutica robusta, reprodutível e confiável para tratar a OA de forma eficaz, abordagens inovadoras para entender e tratar os problemas associados à lesão da cartilagem articular estão sendo estudadas.

Para reparar, regenerar e aprimorar o movimento articular nas articulações artríticas, o progresso na medicina regenerativa surgiu como uma nova esperança para restaurar o AC ^6,7 danificado. O uso de condrócitos autólogos combinado com implantação de ECM e injeção intraarticular de células-tronco representa o estado atual da arte nessa^{área 8,9,10}. O principal desafio dessas abordagens é garantir a diferenciação adequada e a síntese funcional de MEE por células implantadas. Os condrócitos autólogos tendem a formar fibrocartilagem ou evoluir para um estado hipertrófico, criando novo tecido disfuncional que não recapitula as características fisiológicas do AC, levando a uma recuperação incompleta e frequentemente a deterioração^{tardia 11}. Biomateriais podem ser usados para guiar o comportamento celular durante a regeneração tecidual, fornecendo um andaime temporário para que as células aderam e sintetizem matrizes extracelulares novas, naturais e^funcionais 12,13,14. O biomaterial ideal para a engenharia da cartilagem deve garantir forte integração com os tecidos ao redor, especialmente o osso subcondral, pois a falha nessa interface compromete o reparo a longo prazo. No entanto, a fraca ligação entre a cartilagem e as camadas ósseas dos andaimes osteocondrais e a má integração com o tecido hospedeiro continuam sendo grandes^desafios. Embora andaimes tentem imitar a arquitetura osteocondral nativa, reproduzir a complexa microestrutura da interface ainda é difícil. Isso reforça a importância da pesquisa e desenvolvimento de andaimes com propriedades biológicas que possam simultaneamente apoiar a regeneração de cartilagem e osso, mantendo a estabilidade da interface¹⁶. A gelatina, derivada do colágeno — um componente fundamental do tecido cartilaginoso — possui propriedades como motivos de ligação celular e biodegradabilidade, sugerindo seu potencial como biomaterial de suporte quando combinada com fatores regenerativos para o tratamento de lesões osteocondrais. Quando modificado quimicamente com anidrido metacrílico para formar gelatina metacriloíla (GelMA), ele se torna foto-reticulável, permitindo a injeção e fotopolimerização in situ, o que aumenta a estabilidade mecânica para aplicações em medicina^{regenerativa 17}.

Lesões osteocondrais possuem capacidade regenerativa limitada, o que representa um desafio clínico. Investigações pré-clínicas que utilizam modelos animais de grande porte de lesão na articulação do joelho são essenciais para a pesquisa translacional porque permitem a avaliação sistemática das variáveis que afetam os mecanismos da doença e os resultados terapêuticos. Espécies comumente usadas incluem porcos, cabras, cães, cavalos e ovelhas, cada uma apresentando vantagens e limitações específicas que devem ser consideradas no desenho experimental. Além disso, todas essas espécies apresentam reparação endógena limitada de defeitos condrais e osteocondrais, como observado em^{humanos 18}. Para garantir que esses modelos sejam preditivos dos resultados humanos, eles devem reproduzir parâmetros relevantes como anatomia, fisiologia e propriedades^{biomecânicas 18}. Para comparação, a espessura da cartilagem articular humana nos côndilos femorais varia de 1,8 a 2^{mm 19}, e o diâmetro das lesões cartilaginosas que normalmente requerem tratamento é de 10 mm ou^{mais 20}.

O modelo suíno oferece vantagens para estudos de regeneração de cartilagem e osteocondral, já que o tamanho das articulações, a espessura da cartilagem e as necessidades de suporte de peso se assemelham muito aos observados em^{humanos 18}. Algumas raças de porquinho miniatura, como o miniporco de Göttingen, são fáceis de manusear e atingem a maturidade esquelética entre 18 e 22 meses de^idade. A espessura da cartilagem varia de 1 a 2 mm, e defeitos de 6 a 8 mm podem ser criados^{em 18} mm. As características ósseas, incluindo espessura trabecular, taxa de apposição óssea e organização das fibras de colágeno, são comparáveis às dos humanos^. No entanto, o modelo suíno também apresenta limitações: mesmo em raças miniatura, a articulação do joelho (stifle) é menor do que em humanos, limitando a criação de grandes defeitos experimentais. Além disso, a maioria dos estudos utiliza animais imaturos por esqueletos devido aos custos de manutenção associados, que podem superestimar o potencial de^{reparo 23}.

Cabras apresentam anatomia articular, biomecânica e espessura de cartilagem semelhantes às dos humanos^. Eles não exigem instalações especializadas, são fáceis de manusear e são relativamente^{baratos 25}. A espessura da cartilagem de cabra varia de 0,8 a 2,0 mm, e o tamanho de defeito crítico mais relatado é de 6^{mm 26}. No entanto, há variação significativa na espessura da cartilagem entre raças, tamanhos e sexos, o que pode levar a resultados^{inconsistentes 27}. A proporção cartilagem para osso subcondral e a estrutura óssea trabecular também são comparáveis às dos humanos^. A maturidade esquelética ocorre relativamente tarde, entre 24 e 36 meses de^{idade, aos 29} anos. Do ponto de vista biomecânico, o joelho da cabra sofre pressões articulares e cargas cíclicas semelhantes às dos humanos^{, embora} a flexão do joelho durante a marcha seja maior (50°-70° em cabras contra <30° em humanos), resultando em áreas de contato^{distintas 30}. Essa diferença, combinada com pressões de pico mais altas, pode contribuir para um reparo da cartilagem menos^{eficiente 30}.

Entre os modelos animais de grande porte, os cães se destacam pela capacidade de tolerar regimes de reabilitação, imobilização articular e treinamento para caminhada na esteira, natação e exercícios controlados de suporte^{de carga 18}. A espessura da cartilagem articular varia de 0,9 a 1,3 mm, e o tamanho crítico do defeito é aproximadamente 4 mm, limitando a comparação direta com o modelo^{humano 25}. A maturidade esquelética ocorre entre 8,5 e 13,7 meses de^{idade, aos 31} anos. Anatomicamente, o joelho canino difere do joelho humano, e variações na biomecânica, padrões de carga e maturidade entre raças complicam a extrapolação dos^{resultados 32}. Apesar dessas diferenças anatômicas e do pequeno tamanho do defeito, o modelo canino continua sendo valioso para estudos que incluem protocolos de reabilitação ou patologias espontâneas da cartilagem semelhantes às humanas. No entanto, seu uso experimental é restrito por considerações^{éticas 29}.

O modelo equino é o maior modelo animal disponível para pesquisa em reparação de cartilagem e desenvolve naturalmente lesões condrais relacionadas à idade ou trauma e osteoartrite semelhantes às de humanos^. Os cavalos apresentam características anatômicas e biomecânicas comparáveis aos humanos, como articulação do joelho ereta, tamanho articular grande, espessura da cartilagem entre 2 e 3 mm mais próxima da cartilagem humana — extensão completa do joelho durante a marcha, e densidade mineral óssea^{comparável de 34}. A maturidade esquelética ocorre entre 24 e 48 meses, e os tamanhos dos defeitos comumente estudados variam de 6 a 20 mm^32,33. As limitações incluem a alta carga vertical sobre a articulação do stifle equino durante a locomoção, que expõe os implantes a forças maiores do que em humanos e dificulta a cicatrização a longo^{prazo 35}. Além disso, os custos de aquisição e manutenção são altos, e são necessárias instalações^{especializadas 36}.

As ovelhas são amplamente utilizadas como modelo em estudos de reparo de cartilagem devido à sua disponibilidade, temperamento dócil, boa tolerância a cirurgias articulares e facilidade de^{manuseio 37}. A maturidade esquelética em ovelhas é tipicamente atingida por volta dos 2-3 anos de idade^{, aos 25} anos. Além disso, o joelho ovino apresenta semelhanças anatômicas e biomecânicas com a articulação humana^{do joelho 38}. A espessura da cartilagem no côndilo femoral medial varia de 0,7 a 1,7 mm, e a densidade mineral óssea e as pressões de contato também são comparáveis, embora a fração de volume ósseo seja maior em^{ovelhas 39}. Devido à redução da espessura da cartilagem, defeitos induzidos frequentemente se estendem para o osso subcondral, tornando este modelo mais adequado para estudos de defeitos^{osteocondrais 32}. Lesões de 6 a 8 mm de diâmetro geralmente são criadas em locais como os côndilos femorais e o^{trocleo 32}. Além disso, o modelo ovino oferece vantagens para estudos bilaterais, permitindo a comparação de locais tratados e controles dentro do mesmo animal, reduzindo assim a variabilidade relacionada ao hospedeiro, melhorando a consistência e reprodutibilidade, e minimizando o número de animais^{necessários para 40}. Cada modelo apresenta diferentes graus de semelhança com a fisiologia humana e biomecânica. Portanto, a seleção do modelo deve equilibrar relevância biológica, viabilidade prática e considerações éticas. No presente estudo, foram incluídas ovelhas nulíparas de 12 meses, avaliadas durante o período sazonal do anestro.

Este estudo buscou desenhar um protocolo eficaz para gerar defeitos osteocondrais agudos em animais grandes. O protocolo envolve a criação de uma lesão osteocondral de espessura total para estabelecer um modelo adequado para estudos de medicina regenerativa. Além disso, a aplicação do hidrogel GelMA é explorada como guia para a cicatrização de tecidos e como um método prospectivo para a entrega de moléculas e células regenerativas. O protocolo descreve o procedimento cirúrgico para criar lesões osteocondrais na cartilagem articular do joelho da ovelha. É adaptável a várias aplicações de engenharia de tecidos, incluindo a indução de lesões semelhantes em outros modelos de grandes animais para medicina regenerativa.

Protocolo

O estudo recebeu aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa e foi certificado com um Certificado de Apresentação Ética numerado em 6092250823/2023. No presente estudo, nove ovelhas brancas de Suffolk com 12 meses de idade foram selecionadas. O defeito foi criado em ambos os côndilos femorais mediais de cada animal. Defeitos vazios eram usados como controles. Cada animal teve um joelho randomizado para tratamento com GelMA e o outro como controle. Essa estratégia nos permitiu avaliar a capacidade regenerativa natural e reduzir o impacto das variações individuais, como fatores genéticos e maturidade esquelética. Os animais foram acompanhados por 6 meses para avaliar a formação da cartilagem hialina.

1. Procedimento anestésico

1. Prive os animais de comida e água por aproximadamente 24 horas antes do procedimento cirúrgico.
2. Pré-medicar os animais com meperidina intramuscular 4 mg/kg combinada com midazolam 0,3 mg/kg.
3. Encha o vaporizador anestésico um dia antes do uso, com o quarto vazio, e use luvas de proteção para minimizar o risco de exposição ocupacional.
4. Verifique o circuito anestésico em busca de vazamentos antes de cada procedimento e realize todas as manipulações em uma área bem ventilada, seguindo as diretrizes institucionais de biossegurança.
5. Após 15 minutos, canular os animais com um cateter de 18 g e administrar a solução de Ringer Lactado a uma dose de 10 mL^∙kg-1∙^h-1.
6. Administre anestesia intravenosa usando 1% de propofol na dose de 4 mg/kg.
7. Intube os animais com um tubo endotraqueal com manguito de 7,5-8,0 mm e mantenha-os sob ventilação espontânea usando um sistema respiratório circular semi-fechado que fornece oxigênio com FiO₂ de 1,0 e vazão de 50 mL/kg.
8. Use a técnica de anestesia intravenosa parcial (PIVA), mantenha o propofol como infusão contínua em 0,1 mg∙^{kg-1 min-1}, e ajuste apenas a concentração de isoflurano para alcançar um plano cirúrgico adequado de anestesia. Monitore a profundidade da anestesia durante todo o procedimento.
9. Realize bloqueios perineurais dos nervos femoral e ciático, guiados por um neurolocalizador. Administre 0,2 mL/kg de lidocaína 2% para cada bloqueio.
   NOTA: A cirurgia só deve começar depois que o animal estiver sob anestesia cirúrgica confirmada (sem resposta a um beliscão firme na casca e sem tónus da mandíbula).

2. Procedimento cirúrgico in vivo

1. Desinfete o joelho raspado usando gluconato de clorexidina antisséptico tópico e coloque o animal na posição de decúbito dorsal na sala de cirurgia.
2. Localize a cavidade articular tocando o joelho do animal para determinar o local exato da incisão. Faça uma incisão cutânea dupla curva (começando distal ao epicôndilo femoral lateral e terminando medialmente no nível da tuberosidade tibial).
3. Identifique o tendão patelar, a patela, o ligamento patelar e a porção medial da cápsula articular. Incenda a cápsula para expor o côndilo femoral medial. Hiperflexione o joelho para visualizar a região mais distal da cartilagem articular do côndilo.
4. Faça uma incisão cirúrgica de aproximadamente 3-5 cm na região do côndilo do animal. Remova as camadas de tecido abaixo da pele para acessar o côndilo e mantenha a área da incisão limpa para evitar contaminação.
5. Colete o líquido sinovial usando seringa e agulha. Transfira parte da amostra para um tubo EDTA para análise e use o material restante para preparar lâminas de borrifaça.
6. Posicione os retratores para expor totalmente a superfície condilar. Quanto mais exposto estiver o côndilo, mais fácil será induzir lesão na próxima etapa.
   NOTA: Neste momento, fique atento à pata do animal. A flexão ou extensão do joelho pode ajudar a expor o côndilo.
7. Perfure um defeito de 8 mm de diâmetro e 5 mm de profundidade no centro do côndilo femoral medial usando uma broca ortopédica equipada com uma broca de trépina de 8 mm, garantindo alinhamento adequado para evitar dimensões ou formatos indesejados, e mantendo um ângulo de 0° em relação à região mais distal da cartilagem articular.
   NOTA: Realize a trepanação na menor velocidade possível, operando suavemente o controle da broca e usando apenas rotação suficiente para cortar a cartilagem e o osso subcondral, além de realizar resfriamento local com 0,9% de NaCl em temperatura ambiente, mesmo em baixa velocidade.
8. Realize a extração cirúrgica do tampão osteocondral usando o martelo ortopédico e o osteótomo.
9. Limpe a extensão da ferida com gaze estéril, garantindo que o interior da lesão esteja livre de sangue e detritos de tecido.
10. Aplique 200 μL da formulação líquida de GelMA a 20% (p/v), contendo 0,25% (p/v) fenil-2,4,6-trimetilbenzosífinato (LAP) como fotoiniciador, no interior da lesão até que ela alcance a superfície.
11. Fotocruze o hidrogel GelMA sob um LED de 395-405 nm (9 W de potência total) posicionado aproximadamente 5 cm da amostra por 180 s. Nessas condições, a irradiância estimada na superfície é de ~10 mW/cm², resultando em uma energia total de exposição de aproximadamente 1,8 J/cm².
    NOTA: Use óculos de proteção ao usar luz ultravioleta.
12. Remova os retratores com cuidado.
13. Feche a lesão com suturas independentes nas diferentes camadas de tecido para evitar a formação de seroma. O número de pontos necessários dependerá da extensão da incisão cirúrgica.
14. Aplique um curativo estéril nos pontos para evitar infecções.

3. Cuidados pós-operatórios

1. Monitore os animais durante a recuperação da anestesia, incluindo sinais vitais como frequência cardíaca (70-90 batimentos/min), frequência respiratória (12-20 respirações/min), temperatura corporal (39 °C a 40,5 °C) e membranas mucosas normais, com tempo de recarga capilar de 1-2 segundos. Palpe regularmente as artérias faciais e femures para verificar se o pulso é facilmente perceptível.
   NOTA: A recuperação anestésica deve ocorrer em um ambiente silencioso, limpo, quente e acolchoado, com iluminação mínima e baixo nível de ruído.
2. Realizar curativos cirúrgicos usando penicilina tópica (benzatina penicilina G: 1.250.000 UI; procaína penicilina G: 1.250.000 UI; dihidroestreptomicina sulfato: 1,25 g; ureia: 2,50 g), uma vez ao dia por 10 dias.
3. Certifique-se de que os animais permaneçam em posição quadrúpede imediatamente após acordarem da anestesia, apoiem peso no membro operado e não demonstrem sinais de desconforto.
4. A analgesia pós-operatória consistiu em meloxicam (0,4 mg/kg a cada 24 horas) e tramadol (2 mg/kg a cada 12 horas) por 5 dias. Uma dose adicional de resgate de tramadol foi aplicada quando expressões faciais relacionadas à dor foram identificadas usando a Escala de Careta de^{Ovelha 41}, uma ferramenta validada baseada em unidades específicas de ação facial (incluindo contração orbital, resposta de Flehmen, posição da orelha e posição da cabeça) para avaliar dor e sofrimento pós-operatório em ovelhas.

4. Análise histológica

1. Seis meses após a cirurgia, realize a eutanásia. Para alcançar a sedação profunda antes da administração do agente de eutanásia, premedice os animais por via intravenosa com cetamina (10 mg/kg) e xilazina (1 mg/kg), usando doses intencionalmente maiores do que as normalmente recomendadas para procedimentos clínicos, garantindo o início rápido de uma sedação profunda, conforme apoiado pelos protocolos aceitos de eutanásia. Subsequentemente, administre propofol para induzir um coma anestésico. Depois, administre cloreto de potássio a 2 mEq/kg IV até ocorrer parada respiratória e cardiovascular e todos os reflexos protetores ausentes.
2. Secciona a epífise distal do fémur para remover a área dos côdilos. Fixe as articulações do joelho dissecadas com formalina 10% tampada neutra e descalcifique em 5% de EDTA (ácido etilendediaminetetraacético) a 34 °C, trocando a solução de EDTA a cada 3 dias.
3. Embutido o material em parafina e corte em seções de 4 μm. Remova a parafina das lâminas deixando-as de molho em xileno a 65 °C por 3 x 5 minutos. Hidrate com 10-20x imersão em etanol (99%, 95%, 70%) seguida de água desionizada por 5 min⁴².
4. Para a coloração de hematoxilina e eosina (H&E), tinga as seções com hematoxilina Harris e contra-colore com eosina, escaneia a 20× de ampliação usando um microscópio automatizado de varredura de lâminas e analisa usando o software vinculado.
5. Avaliar a lesão de acordo com a iniciativa⁴³ de histopatologia da Osteoarthritis Research Society (OARSI): pontuação 0 indica cartilagem normal; uma pontuação de 1 reflete fibrilação superficial sem perda de cartilagem; uma pontuação de 2 corresponde a fendas verticais que alcançam a camada imediatamente abaixo da zona superficial, acompanhadas por perda parcial da lâmina superficial; uma pontuação de 3 indica fendas verticais ou erosão que se estendem para dentro da cartilagem calcificada e afetam menos de 25% da superfície articular; Escores de 4, 5 e 6 representam fendas verticais ou erosão que alcançam a cartilagem calcificada e envolvem 25-50%, 50-75% e mais de 75% da superfície articular, respectivamente.
   NOTA: Neste estudo, lesões com fendas verticais ou erosões que se estendem para a cartilagem calcificada e envolvem mais de 25% da superfície articular receberam uma pontuação de 4.

Resultados

Indução de defeitos osteocondrais

Este estudo teve como objetivo desenvolver um protocolo eficiente para induzir defeitos osteocondrais agudos em animais de grande porte. As lesões foram criadas mecanicamente durante um procedimento cirúrgico, resultando em uma lesão de aproximadamente 8 mm de diâmetro e 5 mm de profundidade (Figura 1). Considerando as pontuações estabelecidas pela International Cartilage Regenera...

Discussão

Para superar desafios na terapia com cartilagem, como a inadequação da diferenciação condrogênica e da maturação da MEC, estudos não clínicos continuam sendo essenciais para avaliar estratégias terapêuticas. Métodos para modelos não clínicos de tecido cartilaginoso lesionado já foram relatados anteriormente utilizando várias^{técnicas 45}. No entanto, a literatura ainda carece de relatórios detalhados e procedimentos padronizados para induzir lesão osteocondral aguda...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fio de sutura poliglecaprono 25, nº 2-0	Ethicon		Fio de sutura para fechamento geral dos tecidos moles era usado para suturar a cápsula articular e o tecido celular subcutâneo.
Anticorpos anti-β-Tubulina	Invitrogen	PA516863	Anticorpo contra a β-tubulina, duas subunidades (α/β) que compõem os microtúbulos do citoesqueleto
Dispositivo de anestesia	HB hospitalar		Equipamento de anestesia inalatória
Axio Scan Z1	Zeiss, Munique, Alemanha		Microscópio
Penicilina benzatina G	Ourofino		Antibióticos
Cateter 18 G	Solidor		Cateter intravenoso
Cefalexina	Virbac		Terapia antimicrobiana
Solução Aquosa de Digluconato de Clorexidina	RIOQUÍ MICA		Antisséptico usado para antissepsia cutânea
Tubo endotraqueal com manguito 7,5 e traço; 8,0 mm	Solidor		Tubo endotraqueal com manguito
DAPI	Sigma	D9542	Corante fluorescente
Eagle Médio Modificado de Dulbecco	Gibco	12100-046	Meio de cultura celular
Sulfato de dihidroestreptomicina	Ourofino		Antibióticos
Tubo EDTA	Becton Dickinson	362788	Tubo de coleta
Eosina	Neon	1795	Um corante usado para visualizar a morfologia celular, coloração   citoplasma.
Etilenediaminamina ácido tetraacético	Sigma	E5134	Promove a desmineralização gradual do tecido ósseo
Soro Fetal Bovino	Gibco	12657-029	Suplemento para cultura celular com fatores de crescimento
Formol	Sigma-Aldrich	47608	Preservar a morfologia dos tecidos
GelMA Liofilizado	TissueLabs	GLMA-LYO-1	Hidrogel fotocruzável
Harris hematoxilina & nbsp;	Laborclin	620503	Um corante usado para visualizar a morfologia celular, colorindo núcleos.
Isoflurano	Cristá Lia		Manutenção anestésica
Ketamina 10%	VETNIL		Procedimento de eutanásia
Solução de Ringer Lactato	Fresenius Kabi		Terapia fluida
L-Glutamina 200 mM	Gibco	25030-081	Aminoácido essencial para cultura celular
Cloridrato de lidocaína	Cristá Lia		Anestesia local
Kit de viabilidade VIVA/MORTO/citotoxidade	Invitrogen	L3224	Kit de ensaio fluorescente para avaliar a viabilidade celular
Meloxicam	Ouro fino		Anti-inflamatório e analgésico para o período pós-operatório
Cloridrato de midazolam	Cristá Lia		Medicação pré-anestésica
Fio de sutura mononylon, nº 3-0	Ethicon		Sutura usada para fechamento da pele
NaCl 0,9%	Cristalia		Solução salina
Neurolocalizador	Neurolocalizador DL 250 DeltaLife		Anestesia local guiada por um neurolocalizador e eletroestimulador do nervo periférico.
Broca Ortopédica	Mini Furadeira Ortopédica Encanulada (Delicada) - Mandrel Cromado - Marca Makita		Usado em cirurgias ortopédicas.
Martelo ortopédico	Edlo	Hammer Neufield (10-3155)	Características gerais: 20cm de comprimento e 560gr de peso; material: aço inoxidável de alta qualidade; Uso: Indicado para procedimentos de traumatologia e ortopedia que exigem impacto controlado. Certificações: os produtos possuem certificações de qualidade como ISO (Organização Internacional de Padronização): 13485:2016, com normas de conformidade europeia e Boas Práticas de Fabricação.
Osteótomo de Lambotte	Edlo	Ostetótomo de Lambotte (10-0749)	O osteótomo Lambotte (6 mm x 17 cm / 6 3/4") é um instrumento cirúrgico de alta precisão usado principalmente em cirurgias ortopédicas e procedimentos neurocirúrgicos envolvendo manipulação óssea. Com uma ponta de 6 mm de largura, é ideal para cortes delicados, remodelagem e remoção de cartilagem compacta e osso subcondral.
Penicilina Estreptomicina	Gibco	15140-122	Antibiótico de amplo espectro amplamente utilizado em cultura celular
Cloridrato de petidina	Cristá Lia		Medicação pré-anestésica
Cloreto de potássio 19,1%	Samtec		Procedimento de eutanásia
Procaína penicilina G	Ourofino		Antibióticos
Propofol	Cristá Lia		Indução e manutenção anestésica
Lactato de Ringer	Cristá Lia		Terapia fluida
Sistema respiratório circular semicerrado	HB hospitalar		Circuito respiratório para anestesia
Curativo estéril de crepe	Cremer		Curativo estéril de crepe, usado para cobrir as extremidades distais dos membros operados.
Stimuplex D, 22 Ga. x 2 pol. (50 mm) Agulha Isolada com Conjunto de Extensão, 30&º; Chanfrado (STIMD2250/30)	BBRAUN		Anestesia local perineural
Cloridrato de tramadol	Cristá Lia		Analgesia pós-operatória
Broca de Trephine	Broca de Trefina Óssea, diâmetro em mm – modelo: contra-angle, marca: surgical WF		Broca de Trephine Coletora de Ossos 8,0 mm; produzido em aço cirúrgico; utilizado em cirurgias de enxerto ósseo; serve para remover o bloco ósseo para análise histológica ou autoenxerto.
Xilazina 10%	VETNIL		Procedimento de eutanásia