Normalização baseada em MTT da liberação de glicerol para quantificação precisa da lipólise em adipócitos epididimmais primários de ratos

Summary

Artefatos experimentais, incluindo flutuações na viabilidade celular e interferência no ensaio, dificultam a quantificação precisa da liberação de glicerol em adipócitos primários ricos em lipídios. Para mitigar esses desafios, uma estratégia de normalização baseada em MTT é usada para ajustar as medições de glicerol para a atividade metabólica celular, aumentando assim a confiabilidade da quantificação da lipólise.

Abstract

A lipólise, uma via metabólica crítica, envolve a hidrólise de triglicerídeos armazenados em ácidos graxos livres e glicerol. No entanto, a quantificação precisa da produção de glicerol em adipócitos primários ricos em lipídios é frequentemente confundida por artefatos experimentais, como variabilidade na viabilidade celular e interferência do ensaio. Para resolver essas limitações, um método simples foi estabelecido para normalizar as medições de liberação de glicerol usando o ensaio de viabilidade celular baseado em brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Este protocolo aproveita a diferença de gravidade específica entre adipócitos e soluções aquosas, permitindo a quantificação simultânea da produção lipolítica e da viabilidade celular. Em experimentos de triagem de drogas, a pravastatina e a sinvastatina aumentaram significativamente a liberação de glicerol dos adipócitos abdominais, enquanto a atorvastatina e a lovastatina não alteraram significativamente a produção de glicerol. Essas descobertas sugerem que a normalização baseada em MTT oferece uma abordagem robusta e conveniente para quantificar com precisão a lipólise, com aplicações potenciais na descoberta de medicamentos visando a obesidade e a síndrome metabólica. Este estudo ressalta a necessidade de reavaliar os ensaios convencionais de lipólise para distinguir respostas metabólicas genuínas de vazamento de membrana inespecífico.

Introduction

O tecido adiposo pode ser dividido em tecido adiposo branco (TAB) e tecido adiposo marrom (BAT)¹. O WAT desempenha a função de armazenamento de energia em excesso como triglicerídeos, enquanto o BAT tem a função de geração de calor para manter a temperatura corporal, que converte energia química em energia térmica sob a estimulação do frio¹. O tecido adiposo também tem função endócrina². Ele pode secretar uma variedade de hormônios, citocinas e metabólitos (coletivamente chamados de adipocinas) e controlar o equilíbrio energético do corpo, regulando o comportamento de busca de alimentos do sistema nervoso central e a atividade metabólica dos tecidos circundantes².

A lipólise é um processo de hidrólise passo a passo de lipídios intracelulares sob a ação de uma série de enzimas lipolíticas ^3,4. Nos adipócitos, os lipídios são armazenados principalmente em gotículas lipídicas na forma de triglicerídeos⁵. As gotículas lipídicas são cobertas com a família da perilipina proteica associada às gotículas lipídicas, que impede a hidrólise dos triglicerídeos por enzimas lipolíticas ^6,7. No entanto, quando o sinal de lipólise é aumentado, os níveis de expressão da família da perilipina nos adipócitos diminuem e as enzimas lipolíticas entram nas gotículas lipídicas ^3,4. Consequentemente, os triglicerídeos são decompostos em glicerol e ácidos graxos livres ^3,4,5.

A lipólise, a quebra dos triglicerídeos armazenados em glicerol e ácidos graxos livres, é um processo fundamental no metabolismo dos adipócitos⁸. Embora a medição direta de produtos de lipólise, como o glicerol, forneça informações valiosas, a quantificação precisa tem sido um desafio, particularmente em adipócitos primários suspensos devido a erros operacionais decorrentes de diferenças no número de células entre os grupos experimentais. Este estudo teve como objetivo enfrentar esse desafio empregando um ensaio de viabilidade celular para normalizar a quantificação da liberação de glicerol de adipócitos abdominais primários de ratos. Ao padronizar o método de medição, o ensaio de liberação de glicerol normalizado foi aplicado como uma ferramenta potencial para a descoberta de medicamentos direcionados à obesidade e síndrome metabólica em adipócitos.

Protocol

Este protocolo aproveita a diferença de gravidade específica entre adipócitos e soluções aquosas para permitir a medição simultânea da liberação de glicerol (como um indicador de lipólise) e viabilidade celular de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) nos mesmos poços de uma placa de 96 poços, simplificando assim o fluxo de trabalho experimental e aumentando a eficiência.

Todos os procedimentos em animais cumpriram as diretrizes do ARRIVE e foram conduzidos de acordo com o Guia do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publication No. 8023, revisado em 1978). O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (número de aprovação 202112, aprovado em 5 de maio de 2021). Os ratos Wistar machos usados neste estudo tinham pelo menos 8 semanas de idade com pesos corporais de ≥200 g em condições de alojamento padrão. O tecido adiposo branco do epidídimo foi coletado com rendimentos típicos de 0,6-0,8 g por rato. Notavelmente, ratos mais velhos ou alimentados com dietas ricas em gordura exibiram massa de tecido adiposo branco significativamente aumentada (geralmente 1,5-3 g), exigindo ajuste proporcional das concentrações de enzimas de digestão (por exemplo, colagenase) para manter a eficiência consistente da dissociação do tecido. O uso exclusivo de ratos machos evitou potenciais efeitos de confusão das flutuações hormonais do ciclo estral feminino. A seleção de cepas (por exemplo, Sprague-Dawley, Wistar ou Long-Evans) foi mantida de forma consistente nos experimentos para garantir a uniformidade genética nas respostas do tecido adiposo. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento de adipócitos abdominais primários de ratos

1. Anestesiar um rato Wistar adulto macho com uma injeção intraperitoneal de hidrato de cloral a 7% (dissolvido em H₂O destilado) (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
2. Confirme a anestesia completa verificando a ausência de respostas reflexas e, em seguida, faça uma incisão abdominal na linha média usando uma tesoura cirúrgica estéril.
3. Remova cuidadosamente o tecido adiposo visceral dos lados esquerdo e direito da almofada de gordura do epidídimo.
   NOTA: Os adipócitos do epidídimo são relativamente grandes e flutuantes, o que facilita a separação e a análise.
4. Transfira o tecido coletado para solução salina tamponada com fosfato (PBS; Figura 1A).
5. Lave o tecido duas vezes com PBS para remover impurezas, incluindo vasos sanguíneos aderidos e coágulos sanguíneos.
6. Corte o tecido lavado em pedaços pequenos.

2. Purificação de adipócitos abdominais primários de ratos

1. Incubar o tecido adiposo dissecado com tripsina e colagenase tipo II (10 mg em 10 ml de solução de tripsina) a 37 °C durante 2 h sob agitação.
2. Filtre o tecido adiposo digerido através de um filtro de células (Figura 1A).
3. Centrifugue o filtrado a 120 × g durante 3 minutos à temperatura ambiente para remover a actividade enzimática residual.
4. Transfira os adipócitos suspensos (a camada branca superior) para um tubo limpo e lave-os com PBS.
5. Centrifugue o filtrado a 120 × g durante 3 min à temperatura ambiente para remover o PBS.
6. Incubar os adipócitos filtrados (a camada branca superior) no meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e solução de penicilina-estreptomicina a 1% por não mais que 30 min.

3. Análise da liberação de glicerol

1. Semeie os adipócitos filtrados (10^{4-10 5} células por poço; 200 μL) em uma placa de cultura de células de 96 poços.
   NOTA: Os adipócitos foram quantificados usando um hemocitômetro padrão. Devido à grande variação no tamanho dos adipócitos, algumas células maiores não puderam ser contadas com precisão. Portanto, a contagem de células pode não refletir com precisão o número real de adipócitos. O objetivo principal era alcançar uma distribuição uniforme de células entre os poços, em vez de uma quantificação exata.
2. Trate os adipócitos com dimetilsulfóxido a 0,05% (DMSO; como grupo controle) e atorvastatina 50 μM, pravastatina, lovastatina e sinvastatina por 4 h a 37 ° C sob agitação suave.
   NOTA: Essas condições de tratamento são fornecidas como referência e podem ser ajustadas conforme necessário com base nos objetivos específicos e no projeto do experimento.
3. Colete o meio de cultura celular (a camada vermelha inferior) para analisar a liberação de glicerol, que indica o início da lipólise (Figura 1B).
4. Use um kit comercial de ensaio de liberação de glicerol para avaliar a lipólise de adipócitos em resposta a diferentes tratamentos.
5. Meça a absorbância a 570 nm usando um leitor de microplacas.

4. Análise da viabilidade celular

1. Dissolva o pó de MTT na concentração de 5 mg/mL em H₂O destilado e esterilize através de um filtro de 0,22 μm antes de usar.
2. Após a análise da libertação de glicerol, adicionar a solução de MTT (a um final de 0,5 mg/ml) às células e incubar a 37 °C durante 2 h.
3. Transfira os adipócitos suspensos (a camada roxa superior) para um tubo limpo contendo DMSO para análise da viabilidade celular (Figura 1B).
4. Vórtice brevemente para solubilizar cristais de formazan roxo formados.
5. Meça a absorbância a 570 nm usando um leitor de microplacas.

5. Cálculo de normalização

1. Realizar todos os experimentos em triplicata e repetir quatro vezes (n = 4).
   NOTA: Para cada experimento independente (n = 4), os adipócitos foram isolados de três ratos, e cada condição de tratamento foi realizada em triplicata.
2. Para cada grupo de tratamento, divida o valor de absorbância de liberação de glicerol pelo valor de absorbância de viabilidade celular correspondente.
3. Apresente os dados como média ± desvio padrão (DP).
   NOTA: A média e o DP foram calculados usando o Microsoft Excel com as funções =MÉDIA(intervalo) e =DESVPAD. S(intervalo). Para comparações entre os grupos, foram realizados testes t bicaudais não pareados usando o GraphPad Prism 6 com a função teste t de Comparar médias.
4. Determinar a significância estatística das diferenças entre os grupos usando o teste t de Student, com um valor de P menor que 0,05 considerado estatisticamente significativo.

Results

Após a triagem preliminar do medicamento, as estatinas anti-hiperlipidêmicas foram usadas para investigar os efeitos lipolíticos nos adipócitos pelo método de liberação de glicerol normalizado⁹.

Impacto das estatinas na liberação de glicerol de adipócitos abdominais primários de ratos
O efeito das estatinas na lipólise em adipócitos abdominais primários de ratos foi avaliado tratando as células com 50 μM de pravastatina, sinvastatina, atorvastatina, ...

Discussion

Este estudo fornece um método mais preciso para medir a lipólise em adipócitos primários carregados de lipídios. Verificou-se que a pravastatina e a sinvastatina induzem a liberação de glicerol e reduzem a viabilidade em adipócitos epididimais de ratos, enquanto a atorvastatina e a lovastatina não mostraram efeitos significativos. A administração de sinvastatina resultou em um aumento mínimo na liberação de glicerol dos adipócitos. Para resolver essa questão, o ensaio MTT foi empregado p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22-µ Filtro M	Sangon Biotech Co. Ltd.	F513165-0001	filtro de seringa, aquo-system, estéril
Brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio	Sangon Biotech Co. Ltd.	A600799-0001	1 g
Placas de cultura de células de 96 poços	Sangon Biotech Co. Ltd.	F603204-0001	estéril
Sal de cálcio de atorvastatina	Cayman Chemical	10493-5	5 mg
Filtro de células	Sangon Biotech Co. Ltd.	F513450-0001	malha de 80 telas
Hidrato de cloral	Sangon Biotech Co. Ltd.	A500288-0250	250 gramas
Dimetilsulfóxido	Sangon Biotech Co. Ltd.	A460700-0100	100 mL
Meio Eagle Modificado da Dulbecco	Sangon Biotech Co. Ltd.	E600003	500 mL, glicose alta, estéril
Soro fetal bovino	Sangon Biotech Co. Ltd.	E600001	100 ml, estéril
Kit de ensaio colorimétrico de glicerol	Cayman Chemical	10010755-96	96 poços
Lovastatina	Cayman Chemical	10010338-5	5 mg
Ratos adultos machos	Universidade de Putian	Wistar	aproximadamente 10-12 semanas
Solução de penicilina-estreptomicina	Sangon Biotech Co. Ltd.	B540732-0010	10 mL, estéril
Solução salina tamponada com fosfato	Sangon Biotech Co. Ltd.	E607009-0500	500 mL, estéril, sem cálcio ou magnésio
Sal de pravastatina sódica	Cayman Chemical	10010343-5	5 mg
Sinvastatina	Cayman Chemical	10010344-5	5 mg
Solução de tripsina	Sangon Biotech Co. Ltd.	E607003-0100	100 mL, sem EDTA e vermelho de fenol, estéril
Colagenase tipo II	Sangon Biotech Co. Ltd.	A004174-0100	100 mg