É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Medindo a permeabilidade da barreira intestinal detectando o fluxo de traçadores fluorescentes nas monocamadas de colonóides humanos

1K vistas

⸱

DOI:

10.3791/68857

⸱

17 de outubro de 2025

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Children's Hospital Colorado, 2Department of Medicine, Mucosal Inflammation Program, Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Colorado, 3Rocky Mountain Veterans Hospital

Neste artigo

Resumo

Descrevemos uma técnica para medir a integridade da barreira intestinal, em que a taxa de translocação de um açúcar marcado com fluorescência de tamanho conhecido reflete a permeabilidade de colonoides intestinais humanos derivados de tecidos.

Resumo

A barreira intestinal é um local crítico de regulação entre os antígenos luminais e o sistema imunológico do hospedeiro, e sua desregulação está implicada em múltiplas doenças gastrointestinais. Os organoides intestinais podem ser uma ferramenta útil para entender e modelar as diferenças na integridade da barreira intestinal. Aqui, descrevemos um protocolo que usa colonoides humanos para quantificar as diferenças funcionais da barreira intestinal, medindo o fluxo de traçadores fluorescentes em monocamadas organoides. Depois de cultivar monocamadas até a confluência, adicionamos um traçador fluorescente, como FITC-dextrano, à câmara apical e detectamos sua translocação para a câmara basolateral ao longo do tempo. O aumento da translocação do traçador fluorescente reflete uma barreira epitelial mais permeável ou mais fraca. Este protocolo é uma plataforma adaptável que permite a avaliação das diferenças funcionais da barreira intestinal em várias condições em paralelo. Usando variações deste protocolo, pode-se avaliar a permeabilidade transepitelial a moléculas de vários tamanhos, formas e estruturas químicas, bem como diferenças de permeabilidade no contexto de tratamentos isolados ou alterações microambientais nos lados apical ou basolateral das células epiteliais. Isso permite uma compreensão mais profunda do mecanismo e do tratamento da ruptura da barreira em estados de doença.

Introdução

A mucosa intestinal é uma estrutura complexa que desempenha um papel importante na regulação do contato entre os metabólitos, antígenos e micróbios no lúmen intestinal e no sistema imunológico e na circulação entérica. As células epiteliais intestinais são um componente chave desse sistema e, em condições saudáveis, formam uma barreira altamente seletiva. O transporte através do epitélio pode ocorrer por meio de múltiplos mecanismos: transporte transcelular ativo ou passivo, poros paracelulares ou vias de vazamento reguladas por junções apertadas e junções aderentes. Se qualquer uma dessas vias pode ser usada por uma molécula para se translocar através do epitélio é determinado pela hidrofobicidade, tamanho e estrutura química. Uma vez atravessado o epitélio, essas moléculas podem interagir mais facilmente com as células imunes da mucosa e entrar na circulação sanguínea ou linfática do intestino 1,2 A ruptura da barreira intestinal é uma marca registrada de várias doenças gastrointestinais inflamatórias, como doença inflamatória intestinal e doença celíaca 1,3,4,5,6,7. Acredita-se que essa barreira intestinal enfraquecida desempenhe um papel na fisiopatologia desses processos patológicos por meio da translocação desregulada de antígenos patogênicos, que podem criar uma resposta inflamatória local ou sistêmica.

Existem vários protocolos estabelecidos para medir a barreira intestinal. Os estudos in vitro tradicionalmente usam linhagens de células cancerígenas, como células T84 ou Caco-2, para medir a resistência elétrica transepitelial (TEER) e quantificar os componentes da junção apertada e da junção aderente8. Ex vivo, as medições da corrente transepitelial podem ser feitas usando câmaras de Ussing em biópsia ou amostras de intestino ressecado9. Os estudos in vivo geralmente envolvem a administração de marcadores inertes por via oral e, em seguida, a medição da absorção desses marcadores no sangue ou na urina10,11. Embora essas técnicas tenham se mostrado úteis no estudo da barreira intestinal, elas apresentam várias limitações: linhagens celulares imortais transformadas inerentemente têm alterações metabólicas e citoesqueléticas que afetam a barreira intestinal de maneiras mal definidas; o acesso a pacientes, amostras de pacientes ou organismos modelo pode ser limitado; Os estudos in vivo são difíceis de controlar quanto a fatores de confusão ou tirar conclusões em nível molecular. Assim, embora evidências dessa ruptura de barreira tenham sido relatadas em vários modelos de doenças, a compreensão do mecanismo desses defeitos de barreira intestinal permanece limitada e nossa capacidade de direcionar e tratar esse aspecto da doença gastrointestinal permaneceu indefinida.

Os organoides intestinais humanos oferecem uma capacidade única e empolgante de elucidar a causa e o tratamento dos defeitos da barreira intestinal. Os organoides intestinais humanos derivados de tecidos são culturas de células primárias derivadas de células-tronco adultas localizadas na base das criptas intestinais12. Essas células podem ser isoladas de biópsias ou espécimes cirúrgicos e cultivadas para manter as alterações genéticas e epigenéticas observadas nos pacientes dos quais foram derivadas 13,14,15. Eles servem como um modelo fisiologicamente mais relevante do que as linhagens celulares imortais tradicionais, pois não apresentam as alterações metabólicas das linhagens de células cancerígenas e podem ser diferenciados nos vários tipos de células presentes no epitélio intestinal maduro 16,17,18. Além disso, por poderem ser expandidos in vitro, são mais acessíveis e úteis para estudos controlados do efeito celular de vários tratamentos e condições de crescimento em paralelo. Embora também existam limitações inerentes aos modelos organoides intestinais, principalmente a ausência de outros tipos de células não epiteliais e o contexto do sistema de corpo inteiro, foi demonstrado que os organoides intestinais humanos fornecem um modelo confiável para vários aspectos da doença gastrointestinal13.

Entre estes, os organoides intestinais demonstraram modelar de perto os defeitos da barreira intestinal, demonstrando mudanças esperadas na organização das junções apertadas e TEER no cenário de insultos de barreira 19,20,21. Aqui, adaptamos uma técnica de avaliação da integridade da barreira em colonóides humanos, na qual o fluxo de moléculas marcadas com fluorescência através de monocamadas organoides é detectado22. Neste protocolo, os organoides são cultivados e amadurecidos em monocamadas bidimensionais polarizadas em membranas semipermeáveis. O ensaio envolve a adição de um traçador fluorescente à superfície apical da monocamada epitelial, e sua presença no lado oposto é quantificada ao longo do tempo. O aumento do fluxo do traçador reflete um epitélio mais permeável ou com vazamento. Este ensaio fornece uma leitura de barreira funcional, que pode ser aditiva para avaliações da estrutura de junções apertadas e aderentes. Além disso, embora as medições TEER sejam frequentemente usadas para fornecer uma avaliação básica da integridade da barreira, o ensaio de fluxo descrito aqui pode ser adaptado para detectar a permeabilidade de moléculas de várias classes, carga e tamanho, caracterizando assim a barreira com muito mais detalhes. Vários traçadores fluorescentes disponíveis comercialmente podem ser usados para esse fim. Além disso, através do uso de espectros fluorescentes não sobrepostos, a permeabilidade a múltiplos traçadores pode ser avaliada simultaneamente. Além disso, a configuração monocamada deste ensaio permite a avaliação da resposta de barreira a condições de crescimento aplicadas especificamente à superfície apical ou basolateral das células apenas. Com isso, é possível uma avaliação controlada do efeito da terapêutica, mudanças microambientais e condições de co-cultura.

Sabe-se que os defeitos da barreira intestinal desempenham um importante papel patogênico no desenvolvimento de várias doenças gastrointestinais, mas o termo "intestino permeável" é cada vez mais usado na mídia popular sem precisão23, e os esforços para atingir a barreira intestinal defeituosa têm sido limitados em sucesso. Isso destaca a necessidade de modelos aprimorados para avaliar e caracterizar a barreira intestinal. O sistema descrito usa monocamadas organoides intestinais fisiológicas derivadas de tecido humano para avaliar a integridade da barreira funcional sob condições controladas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todas as amostras foram adquiridas e utilizadas de acordo com um protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade do Colorado, protocolo número 14-2012.

NOTA: Todos os procedimentos nas etapas 1-3 devem ser feitos em um gabinete de biossegurança estéril com técnica estéril. Um esquema do protocolo é apresentado na Figura 1.

1. Estabelecimento de colonóides humanos de culturas congeladas

NOTA: Certifique-se de que todos os materiais estejam prontos no gabinete de biossegurança antes de descongelar as células para minimizar a exposição de organoides descongelados ao meio de congelamento. O protocolo começa com colonoides humanos derivados de tecidos criopreservados. Protocolos para derivação e criopreservação de colonoides humanos foram descritos anteriormente24.

  1. Preparação de meio de caule organoide intestinal humano
    1. Prepare o meio condicionado Wnt-3A / Noggin / R-Spondin 3 (L-WRN) de acordo com os protocolos descritos anteriormente 25,26.
    2. Complemente o meio L-WRN com os seguintes fatores de crescimento: Fator de crescimento epidérmico [50 ng/mL], Nicotinamida [10 mM], A83-01 [500 nM], SB202190 [10 μM], CHIR99021 [3 μM], Tiazovivina [4 μM], SB431542 [4 μM], Gastrina I [10 nM].
    3. Misture o meio L-WRN suplementado 1:1 com meios organoides intestinais comerciais.
    4. Imediatamente antes de usar, suplemente com Y-27632 [10 μM].
      NOTA: A composição ideal do meio do caule organoide intestinal pode variar de acordo com o laboratório e a linha do colonoide. O uso de meio L-WRN suplementado sozinho ou o uso de meio organoide intestinal comercial sozinho também pode ser possível. O uso deste protocolo de partes iguais de meios condicionados L-WRN e meios comerciais é mais resiliente à variabilidade de lote para lote em comparação com o uso de meios condicionados sozinhos e é mais econômico em comparação com o uso de meios comerciais sozinhos.
  2. Preparação do meio de diferenciação
    1. Suplemente DMEM/F12 com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina e 2 mM de dipeptídeo de L-alanil-L-glutamina.
    2. Misture DMEM/F12 1:1 suplementado com meio de caule organoide intestinal da etapa 1.1
  3. Preparação da matriz extracelular (MEC)
    1. Descongele a ECM durante a noite no gelo e, em seguida, prepare alíquotas de 100 μL.
      NOTA: As alíquotas podem ser recongeladas a -20 °C. Consulte as instruções do fabricante para obter detalhes.
    2. Incube alíquotas no gelo até o momento do plaqueamento das células.
  4. Descongelamento e revestimento de organoides
    1. Descongele o conteúdo de criogenia em banho-maria a 37 °C, garantindo que o frasco permaneça submerso, mas a tampa fique acima da água, até descongelar.
    2. Transfira o conteúdo do frasco para injetáveis para um tubo cónico de 15 ml contendo 13 ml de meio DMEM/F12 suplementado com gelo (do passo 1.2.1).
    3. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C.
    4. Aspire o sobrenadante, deixando aproximadamente 1 mL de volume residual acima do pellet celular.
    5. Coloque o tubo no gelo. Adicione 1 mL de DMEM / F12 suplementado com gelo (da etapa 1.2.1) e pipete a suspensão 10-15 vezes para ressuspender o pellet.
    6. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C.
    7. Remova o sobrenadante usando uma pipeta, deixando o mínimo possível de meio de lavagem residual sobre o pellet celular.
    8. Adicione 100 μL de ECM descongelado ao pellet. Ressuspenda completamente, garantindo que os organoides estejam uniformemente dispersos sem grumos. Pipete lentamente para evitar a introdução de bolhas de ar.
    9. ECM de placa pipetando aproximadamente 10 cúpulas ou gotículas tridimensionais de ECM, cerca de 10 μL cada, em um poço de uma placa de 6 poços.
    10. Inverter a placa rapidamente e incubar a 37 °C durante 5-10 min ou até que as cúpulas estejam solidificadas.
    11. Assim que as cúpulas estiverem definidas, adicione 2 mL de meio de caule organoide intestinal (da etapa 1.1) ao poço.
    12. Incubar a 37 °C, em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. Substitua a mídia a cada 2 dias.
    13. Prossiga com a etapa 2 quando os organoides estiverem ocupando mais de 75% da área da cúpula do ECM ou acumulando detritos centrais.

2. Passagem e expansão de colonóides humanos

  1. Para cada poço, aspire o meio de crescimento dos poços sem interromper as cúpulas do ECM.
  2. Lave as cúpulas suavemente com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada e, em seguida, remova o PBS.
  3. Adicione 1 mL de tripsina gelada a cada poço. Use uma pipeta para quebrar as cúpulas do ECM pipetando para cima e para baixo. Pipete a mistura 10-15 vezes para dissociar totalmente o ECM.
  4. Incubar a placa a 37 °C durante 3-5 min.
  5. Adicione 1 mL de DMEM / F12 suplementado com gelo (da etapa 1.2.1) ao poço para neutralizar a tripsina. Pipete a mistura vigorosamente 20-30 vezes até que as células estejam dissociadas em grupos de 2-3 células cada.
  6. Transfira a suspensão celular para um cônico de 15 mL.
  7. Use mais 1 mL de DMEM/F12 suplementado (da etapa 1.2.1) para lavar o poço e adicione a solução de lavagem ao cônico de 15 mL.
  8. Adicione DMEM/F12 suplementado (da etapa 1.2.1) para atingir um volume total de 13 mL na cônica de 15 mL.
  9. Prossiga com as etapas 1.4.3-1.4.12 da etapa 1 usando uma quantidade apropriada de ECM para expandir para poços adicionais.
    NOTA: Um poço confluente de organoides em 100 μL de ECM normalmente pode ser passado para 2-3 poços (200-300 μL de ECM). Um poço confluente de organoides é suficiente para aproximadamente 3-6 monocamadas na etapa 3.

3. Geração de monocamadas de colonóides humanos

  1. Inserções de cultura de células de revestimento de colágeno
    1. Coloque as inserções de cultura de células de poliestireno (tamanho de poro de 0,4 μm) em uma placa de 24 poços e adicione 100 μL de solução de revestimento de colágeno à câmara apical de cada inserção.
    2. Sele a placa com filme de vedação para evitar a evaporação.
    3. Incubar a 4 °C durante 4-24 h.
      NOTA: Não há diferença nos resultados dentro deste tempo de incubação, mas um tempo de incubação mais curto ou mais longo pode ser escolhido para caber em um ponto de pausa conveniente.
  2. Monocamadas organoides de revestimento
    1. Siga as etapas 2.1-2.5 para dissociar os organoides.
    2. Passe a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm para um tubo cônico de 50 mL.
    3. Enxágue os poços com 1 mL de DMEM/F12 suplementado (da etapa 1.2.1). Recolha este meio de lavagem e passe-o pelo filtro de células.
    4. Lave o filtro de células com DMEM/F12 suplementado (da etapa 1.2.1) até que o volume total no tubo cônico de 50 mL atinja 15 mL.
    5. Transferir o filtrado para uma cónica de 15 ml.
    6. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C.
    7. Aspire o sobrenadante, deixando 1 mL acima do pellet.
    8. Adicione mais 1 mL de meio DMEM / F12 suplementado (da etapa 1.2.1) e ressuspenda.
    9. Examinar a suspensão ao microscópio para confirmar a dissociação completa. Se necessário, pipete as células vigorosamente até que sejam principalmente células únicas.
    10. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante usando uma pipeta, deixando o mínimo possível de meio de lavagem residual sobre o pellet celular.
    11. Ressuspenda em um pequeno volume (200-1000 μL) de meio de caule organoide intestinal (da etapa 1.1). Mantenha no gelo.
    12. Pegue uma alíquota da suspensão celular para usar na contagem de células viáveis usando o método preferido. Use a contagem de células viáveis para determinar o volume de suspensão celular necessário para plaquear 100.000 células viáveis por inserção.
    13. Aspire a solução de revestimento de colágeno de cada inserção sem tocar na membrana da inserção.
    14. Adicione o volume apropriado de meio do caule organoide intestinal (da etapa 1.1) à câmara apical de cada inserto para trazer o volume final para 200 μL uma vez que a suspensão celular é adicionada.
      NOTA: Se preferir, a suspensão celular na etapa 3.2.12 pode ser ajustada para uma concentração final de 100.000 células/200 μL, então 200 μL podem ser semeados na câmara apical. No entanto, se toda a suspensão celular não for usada para revestimento monocamada, isso pode levar ao desperdício excessivo de mídia.
    15. Adicionar o volume adequado de suspensão celular à câmara apical.
    16. Adicione 500-1000 μL de meio de haste organoide intestinal à câmara basolateral.
      NOTA: 500 μL é suficiente para colonóides típicos. Se as células forem mais metabolicamente ativas ou sensíveis ao acúmulo de resíduos, o uso de um volume maior na câmara basolateral pode ser útil para manter o crescimento.
    17. Repita para todas as inserções/poços.
    18. Incubar a 37 °C, em uma incubadora umidificada com 5% de CO2.
    19. Substitua a mídia uma vez por semana.
      NOTA: Os tratamentos de interesse podem ser aplicados nas câmaras apicais e/ou basolaterais das inserções a qualquer momento antes ou depois do reforço.

4. Medição da resistência elétrica transepitelial (TEER) e maturação em monocamada

  1. Medir resistência
    1. Use um voltímetro epitelial / ohm na configuração de ohm. Limpe a sonda limpando-a com um lenço embebido em etanol a 70%. Coloque o braço mais longo do eletrodo no compartimento basolateral e o braço mais curto no compartimento apical da inserção. Registre a medição.
      NOTA: Se as medições TEER também forem um ponto final de interesse, faça também medições de resistência de uma inserção revestida de colágeno sem células como fundo. Em seguida, o TEER é calculado como (resistência - resistência da pastilha de fundo) x área de superfície da pastilha. A área de superfície do inserto neste protocolo é de 0,33 cm2. Este cálculo dará TEER em ohm·cm2. Se estiver usando um voltímetro epitelial / ohm diferente do listado na Tabela de Materiais, use as instruções do fabricante para uso do medidor para medir a resistência.
    2. Repita diariamente até que as medições se estabilizem.
      NOTA: O platô geralmente ocorre após 2 a 3 semanas com TEER maior que 200 ohm·cm2, mas varia de acordo com a linha do colonóide e as condições de crescimento.
  2. Uma vez que a resistência tenha se estabilizado, inicie a maturação organoide substituindo o meio do caule por meio de diferenciação (a partir da etapa 1.2).
  3. Continue as medições diárias do TEAR. Espere um aumento no TEER e um segundo platô.
    NOTA: O segundo platô normalmente ocorre em torno de 7 dias com TEER de 1500-2500 ohm·cm2, mas isso varia de acordo com a linha do colonóide e as condições de crescimento.
  4. Depois que as medições do TEER se estabilizarem pela segunda vez, prossiga com a etapa 5.

5. Ensaio de fluxo FITC-dextrano

NOTA: Este protocolo usa FITC-dextrano 4 kDa (raio de Stokes 14 Å). No entanto, dependendo das necessidades experimentais, traçadores fluorescentes de diferentes tamanhos, cargas e fluoróforos podem ser usados22. Podem também ser utilizados múltiplos traçadores ao mesmo tempo, caso em que devem ser confirmados os espectros de excitação e fluorescência de emissão não sobrepostos. Sugere-se que as etapas 5.1-5.3 sejam executadas em um gabinete de aquecimento (incubadora não umidificada, sem CO2 ) ajustada para 37 °C. Se isso não estiver disponível, os reagentes devem ser aquecidos a 37 ° C antes do uso, e as células, tampões e amostras coletadas devem ser mantidos a 37 ° C durante os tempos de incubação.

  1. Preparação de reagentes
    1. Prepare a solução salina tamponada de Hank (HBSS) com HEPES 10 mM e ajuste o pH para 7,4. Aquecer a 37 °C.
      NOTA: Se necessário, prepare HBSS+HEPES com tratamentos de interesse. Prepare o suficiente para 80 μL / poço na câmara apical e 1 mL / poço na câmara basolateral.
    2. Despeje cerca de 50 mL do HBSS+HEPES quente em um copo pequeno para enxaguar as inserções. Tenha um copo maior por perto para resíduos líquidos.
    3. Descongelar completamente o FITC-dextrano 4 kDa. Preparar uma solução de 1,25 mg/ml em HBSS com HEPES. Preparar um volume adequado de solução de FITC-dextrano para distribuir 80 μL por alvéolo e 1 μL para a curva padrão.
      NOTA: A concentração inicial pode ser ajustada com base no tamanho e na permeabilidade esperada do traçador. Por exemplo, marcadores menores ou mais permeáveis podem ser adicionados em uma concentração mais baixa para conservar os reagentes. Se for necessário aplicar tratamentos na câmara apical, prepare a solução de FITC-dextrano em HBSS+HEPES adequadamente tratado.
  2. Aplicação de FITC-dextrano em monocamadas
    1. Prepare uma nova placa de 24 poços adicionando 1 mL de HBSS+HEPES (com tratamento, se desejar) nos poços apropriados.
    2. Lave as monocamadas organoides segurando o inserto com uma pinça, levantando-o para fora do poço, mergulhando-o no béquer contendo HBSS + HEPES quente (da etapa 5.1.2) para encher a câmara apical e, em seguida, invertendo-o sobre o copo de resíduos para esvaziar a solução de lavagem.
    3. Repita esta lavagem mais 2 vezes.
    4. Colocar o inserto no compartimento adequado da placa fresca preparada no passo 5.2.1.
    5. Pipetar suavemente 80 μL de solução de FITC-dextrano para a câmara apical. Pipetar para o lado da inserção para evitar perturbar a monocamada.
    6. Repita a etapa 5.2.5 para todas as monocamadas.
    7. Adicione HBSS ou PBS a quaisquer poços vazios para manter a umidade.
  3. Coletando amostras de fluxo
    1. Imediatamente após a etapa 5.2.7, coletar 70 μL da câmara basolateral de cada poço em um poço de uma placa preta plana de fundo transparente de 96 poços e mantê-los protegidos da luz a 37 ° C. Este será o ponto de tempo 0.
    2. Incubar a placa, protegida da luz, a 37 °C.
    3. A cada 30 minutos por 2 h, misture o tampão no poço basolateral e, em seguida, colete 70 μL adicionais em poços vazios da placa de fundo transparente de 96 poços da etapa 5.3.1.
  4. Preparação da curva-padrão
    1. Adicione 1 μL da solução reservada de FITC-dextrano (1,25 mg / mL; etapa 5.1.3) em 999 μL de HBSS + HEPES. Esta será a diluição de 1:1000 ou 1,25 μg/mL para a curva padrão.
    2. Dilua esta solução em série 1:1 tomando 150 μL da solução e adicionando-a a 150 μL de HBSS+HEPES e, em seguida, misturando bem. Repita isso em série dez vezes adicionais para um total de uma diluição de 12 etapas.
      NOTA: Isso criará uma curva padrão de: 1250, 625, 312,5, 156,25, 78,13, 39,06, 19,53, 9,77, 4,88, 2,44, 1,22 e 0,61 ng/mL. Dependendo da permeabilidade das linhagens celulares, a curva padrão pode precisar ser mais ou menos concentrada. Na primeira vez que o experimento for executado, reserve uma solução adicional de FITC-dextrano 1,25 mg / mL para o caso de a curva padrão precisar ser refeita em uma concentração diferente.
    3. Pipetar 70 μL de cada diluição da curva-padrão para os alvéolos vazios da placa de fundo transparente de 96 poços dos passos 5.3.1 e 5.3.3. Repita para a segunda replicação.
  5. Meça a fluorescência em um leitor de placa fluorescente com as seguintes configurações: excitação 490 nm, emissão para 520 nm, leitura do fundo da placa, com um ganho de 100 e altura de leitura de 7 mm.
    NOTA: Ajuste os comprimentos de onda de excitação/emissão conforme apropriado para o fluoróforo de sua escolha.
  6. Análise de dados
    1. Plote a curva padrão com concentração no eixo x e fluorescência no eixo y. Use isso para determinar a equação de regressão linear.
    2. Use esta equação de regressão linear e as leituras fluorescentes das amostras para calcular a concentração de FITC-dextrano em cada ponto de tempo para cada amostra.
    3. Representar graficamente a concentração ao longo do tempo para cada amostra e calcular a inclinação de uma equação de regressão linear, que representa microgramas/min (μg/min). Divida isso pela área de superfície do inserto de cultura de células (0,33 cm) para determinar a taxa de fluxo como micrograma por minuto por centímetro quadrado (μg/min/cm2).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Usando este protocolo, a permeabilidade de colonóides humanos saudáveis na presença e ausência de sinalização inflamatória foi analisada. A adição de uma mistura de citocinas inflamatórias, denominada citomix, que inclui IFNγ, TNFα e IL-1β (cada uma a 10 ng/ml), demonstrou anteriormente induzir disfunção da barreira intestinal, medida por TEER em modelos de células epiteliais intestinais20,27. Nosso objetivo foi determinar se essa disfunção de barreira poderia se...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Este é um protocolo para avaliar a barreira intestinal no modelo fisiologicamente representativo de monocamadas de colonóides humanos. O ensaio de fluxo traçador fluorescente descrito aqui fornece informações sobre a integridade funcional da barreira além do que é obtido com outros tipos de ensaios de barreira, como TEER, medições de câmara de Ussing ou avaliação da expressão de proteínas de junção apertada. Além disso, o uso de modelos organoides intestinais derivados de pacientes confe...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Não há divulgações ou conflitos de interesse.

Agradecimentos

O Dr. Sean Colgan é financiado por doações do NIH DK1047893, DK50189, DK095491, DK103639 e VA Merit BX002182.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de centrífuga cônicos de 15 mLTratamento de células229411
Frasco criogênico com rosca interna de 2 mL Corning430488
Tubos de centrífuga cônicos de 50 mLTratamento de células229421
Placa de 6 poços, tratamento para cultura de tecidosTratamento de células229106
70 μ filtro de célula mFalcão352350
Placa inferior preta/transparente de 96 poçosThermo Científico165305
A83-01 R& D2939
Leitor de placas BioTek SynergyAgilentSinergia H1
Contador de células Celómetro Auto T4 BrightfieldNexcelcomCMT-AT4P
Câmaras de contagem de células de celômetroNexcelcomNC1531583
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046-5MG
Solução de revestimento de colágenoAplicações de células125-50
DMEM/F-12Gibco11330057
DMSOSigma-AldrichD2650-100ML
Etanol 100%Fisher CientíficoResposta 4094
Medidor EVOM2 Voltohm com eletrodo Stx2Instrumentos de precisão mundiaisNC9792051
Soro fetal bovino (FBS)CytivaSH30396.03HI
Pontas de pipeta de filtroFisher Científico02-707-000, 02-707-002, 02-707-006, 02-707-008
Isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano, 4kDaSigma-Aldrich46944
Gastrina I (Humana)R& D3006
GlutaMAX Fisher Científico35050061200 mM de dipeptídeo de L-alanil-L-glutamina
Solução salina tamponada Hanks 10xThermo Científico14065056
HEPES 1MThermo Científico15630080
Interferon gama humano recombinanteBioLegend575308
Interleucina 1 beta recombinante humanaTermocientífico200-01B-500UG
Meio de Crescimento Organoide Intestinal IntestiCult (Humano)Tecnologias STEMCELL06010 Meios organoides intestinais comerciais
Microscópio invertido ao vivoOlimpoIX85
MatrigelCorning354234Matriz extracelular (MEC)
Incubadora microbiológicaFisher Científico151030515
Placa multipoços para cultura de suspensão, 24 poçosGreiner Bio-one662102
NicotinamidaR& D4106
ParafilmeMillipore SigmaHS234526BFilme de vedação
Pipetas Pasteur (vidro borossilicato)Fisher Científico13-678-20B
PBS Gibco10010-023
Penicilina estreptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140122
Fator de crescimento epidérmico recombinanteR& D2028-POR
Centrífuga refrigeradaBeckman CoulterBE-AX15R
SB202190 R& D1264
TiazovivinaR& D3845
Inserto de cultura de células ThinCert para placa de 24 poços, 0,4 μ mGreiner Bio-one662641
Tripsina-EDTA (0,25%)Fisher Científico25200114
Fator de necrose tumoral alfa humano recombinanteR& D10291-TA-100
Y-27632 dicloridrato TocrisTB1254-GMP

Referências

  1. Vanuytsel, T., Tack, J., Farre, R. The role of intestinal permeability in gastrointestinal disorders and current methods of evaluation. Front Nutr. 8, 717925(2021).
  2. Tsai, P. Y., et al. Il-22 upregulates epithelial claudin-2 to drive diarrhea and enteric pathogen clearance. Cell Host Microbe. 21 (6), 671-681.e4 (2017).
  3. Bjarnason, I., O'morain, C., Levi, A. J., Peters, T. J. Absorption of 51chromium-labeled ethylenediaminetetraacetate in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 85 (2), 318-322 (1983).
  4. Bjarnason, I., Peters, T. J., Veall, N. A persistent defect in intestinal permeability in coeliac disease demonstrated by a 51cr-labelled EDTA absorption test. Lancet. 1 (8320), 323-325 (1983).
  5. Schulzke, J. D., Bentzel, C. J., Schulzke, I., Riecken, E. O., Fromm, M. Epithelial tight junction structure in the jejunum of children with acute and treated celiac sprue. Pediatr Res. 43 (4 Pt 1), 435-441 (1998).
  6. Schumann, M., et al. Cell polarity-determining proteins par-3 and pp-1 are involved in epithelial tight junction defects in coeliac disease. Gut. 61 (2), 220-228 (2012).
  7. Zeissig, S., et al. Changes in expression and distribution of claudin 2, 5 and 8 lead to discontinuous tight junctions and barrier dysfunction in active Crohn's disease. Gut. 56 (1), 61-72 (2007).
  8. Schoultz, I., KeitaÅ, V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909(2020).
  9. Thomson, A., et al. The ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19 (1), 98(2019).
  10. Gan, J., et al. A case for improved assessment of gut permeability: A meta-analysis quantifying the lactulose:Mannitol ratio in coeliac and Crohn's disease. BMC Gastroenterol. 22 (1), 16(2022).
  11. Sequeira, I. R., Lentle, R. G., Kruger, M. C., Hurst, R. D. Standardising the lactulose mannitol test of gut permeability to minimise error and promote comparability. PLoS One. 9 (6), e99256(2014).
  12. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  13. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  14. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nat Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Basak, O., et al. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190.e4 (2017).
  19. Jelinsky, S. A., et al. Molecular and functional characterization of human intestinal organoids and monolayers for modeling epithelial barrier. Inflamm Bowel Dis. 29 (2), 195-206 (2023).
  20. Kollmann, C., et al. Human organoids are superior to cell culture models for intestinal barrier research. Front Cell Dev Biol. 11, 1223032(2023).
  21. Parente, I. A., Chiara, L., Bertoni, S. Exploring the potential of human intestinal organoids: Applications, challenges, and future directions. Life Sci. 352, 122875(2024).
  22. Sanders, S. E., Madara, J. L., McGuirk, D. K., Gelman, D. S., Colgan, S. P. Assessment of inflammatory events in epithelial permeability: A rapid screening method using fluorescein dextrans. Epithelial Cell Biol. 4 (1), 25-34 (1995).
  23. Lacy, B. E., Wise, J. L., Cangemi, D. J. Leaky gut syndrome: Myths and management. Gastroenterol Hepatol. 20 (5), 264-272 (2024).
  24. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and Culture of Human Intestinal Organoids Derived from Adult Stem Cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  25. Vandussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-wrn conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Res. 37, 101430(2019).
  26. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  27. Wang, R. X., Lee, J. S., Campbell, E. L., Colgan, S. P. Microbiota-derived butyrate dynamically regulates intestinal homeostasis through regulation of actin-associated protein synaptopodin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (21), 11648-11657 (2020).
  28. Al-Qadami, G., et al. Intestinal organoid coculture systems: Current approaches, challenges, and future directions. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 328 (3), G252-G276 (2025).
  29. Wang, Y., Kim, R., Sims, C. E., Allbritton, N. L. Building a thick mucus hydrogel layer to improve the physiological relevance of in vitro primary colonic epithelial models. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (4), 653-655.e5 (2019).
  30. Yang, L., et al. A tunable human intestinal organoid system achieves controlled balance between self-renewal and differentiation. Nat Commun. 16 (1), 315(2025).
  31. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659-668 (2018).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Organoides IntestinaisFITC DextranoPermeabilidade TransepitelialBarreira EpitelialIntegridade da BarreiraModelo de Organoides
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.