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Artigo de método

Produção e uso de moldes de agarose personalizáveis para cultura de folículos ovarianos de camundongos sem andaimes

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DOI:

10.3791/68871

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24 de outubro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Descrevemos métodos para cultura de folículos ovarianos em um novo molde de agarose livre de andaimes que complementa a gametogênese in vitro .

Resumo

O folículo ovariano é a unidade funcional do ovário que produz hormônios e gametas necessários para sustentar a função reprodutiva e a saúde feminina. A capacidade de recapitular a foliculogênese, a ovulação e a luteinização in vitro tem ampla utilidade básica, translacional e clínica. Os sistemas de crescimento folicular in vitro mais avançados mantêm a arquitetura tridimensional (3D) do folículo, que é crucial para o desenvolvimento de oócitos metafásicos II meiticamente competentes em humanos. Recentemente, um método livre de scaffold-free para crescimento folicular in vitro de folículos secundários multicamadas de camundongos foi desenvolvido e validado. Para isso, foram utilizados moldes personalizados impressos em 3D para micropadronizar a agarose com micropoços que acomodam a expansão volumétrica dos folículos. Os folículos cultivados neste ambiente livre de andaimes mostraram produção e viabilidade hormonal comparáveis em relação aos sistemas de crescimento folicular in vitro encapsulados à base de alginato bem estabelecidos (eIVFG). É importante ressaltar que os micropoços de agarose são um método escalável, menos exigente tecnicamente e apresentam melhores taxas de crescimento folicular e ovulação em relação ao eIVFG. Essa metodologia produz moldes personalizáveis que são biocompatíveis com o oócito, uma célula altamente sensível a lixiviados específicos de materiais e outros contaminantes ambientais. Além disso, os folículos neste sistema são cultivados no mesmo plano focal, permitindo imagens e análises em timelapse em tempo real. Para aumentar a acessibilidade dessa nova abordagem, este artigo detalha os métodos necessários para projetar e imprimir moldes mestres em 3D, criar moldes de silicone para placas de 24 ou 96 poços e cultivar folículos ovarianos secundários multicamadas isolados nos moldes de agarose. Essa configuração também pode ser integrada a um sistema de imagem de lapso de tempo econômico, permitindo a análise morfocinética. Além disso, os moldes podem ser embebidos em parafina para análises histológicas a jusante. No geral, este método fácil de usar é uma ferramenta versátil para cultura de folículos e pode ser personalizado ainda mais para promover a diferenciação e maturação de células germinativas dentro do contexto do folículo para sustentar a gametogênese completa in vitro .

Introdução

O oócito, ou gameta feminino, contribui com a maior parte do citoplasma e metade do material genético para o embrião na fertilização, o que é essencial para o desenvolvimento da próxima geração. A oogênese começa durante o desenvolvimento embrionário, quando as células germinativas primordiais entram na meiose e param na prófase I. Esses oócitos residem dentro dos folículos primordiais e constituem a reserva ovariana, um pool finito e não renovável do qual são progressivamente recrutados. Os folículos se desenvolvem em um processo conhecido como foliculogênese, com o objetivo de produzir um gameta maduro capaz de fertilizar 1,2,3,4,5. O desenvolvimento do folículo começa com uma fase inicial independente da gonadotrofina, onde a sinalização parácrina é essencial para a sobrevivência e crescimento do folículo. À medida que os folículos amadurecem para o estágio secundário, eles se tornam dependentes de gonadotrofinas, marcando uma mudança para a sinalização endócrina. Uma característica chave dos folículos secundários é um oócito cercado por um mínimo de duas camadas completas de células da granulosa cuboidal, juntamente com a camada de teca recém-desenvolvida. As células tecais formam a camada mais externa do folículo, fornecendo andrógenos e suporte estrutural 6,7. Finalmente, uma cavidade antral cheia de líquido se forma e se rompe em resposta a um aumento do hormônio luteinizante (LH) durante a ovulação, liberando um gameta competente para fertilização preso na meiose II 2,8,9.

O oócito atinge a competência de desenvolvimento para a fertilização e a capacidade de apoiar o desenvolvimento embrionário pré-implantação precoce, referido como maturação nuclear e citoplasmática, durante a oogênese e a foliculogênese 10,11,12. A maturação citoplasmática é aparente morfologicamente, à medida que os oócitos se expandem ao longo da foliculogênese. Como resultado da proliferação de células somáticas, incluindo teca, granulosa e células cumulus, os próprios folículos experimentam uma expansão volumétrica significativa. Em camundongos, o diâmetro do folículo aumenta cinco vezes desde os folículos secundários precoces até os pré-ovulatórios. A comunicação bidirecional entre o oócito e as células somáticas circundantes é essencial para a oogênese. Nos folículos primários, a zona pelúcida se forma a partir de proteínas secretadas pelo oócito, e a comunicação entre esses compartimentos foliculares é parcialmente mediada por projeções transzonais, que proporcionam contato físico entre esses dois compartimentos foliculares13,14. Assim, o microambiente folicular é vital para orquestrar corretamente o crescimento, bem como a maturação nuclear e citoplasmática do oócito 2,5. Para entender melhor os mecanismos discretos que suportam esses processos, há necessidade de técnicas de cultivo in vitro avançadas e fisiologicamente relevantes. A capacidade de cultivar folículos in vitro tem amplas aplicações, incluindo tecnologias de reprodução assistida e preservação da fertilidade 15,16,17,18, conservação de espécies19,20, desenvolvimento de medicamentos21 e triagem toxicológica22,23.

Os sistemas de cultura de folículos in vitro também são uma etapa intermediária essencial para a capacidade de gerar gametas a partir de células-tronco pluripotentes, também conhecida como gametogênese in vitro (IVG)24. Os pesquisadores utilizaram células-tronco embrionárias, células-tronco mesenquimais e células-tronco pluripotentes induzidas para desenvolver gametas em uma variedade de espécies, muitas vezes contando com células somáticas para recriar o microambiente folicular nativo 25,26,27,28,29,30. Embora os principais marcos de prova de conceito tenham sido alcançados por meio desses métodos, ainda há um desafio de oócitos de baixa qualidade, refletido no baixo desenvolvimento embrionário e nas taxas de descendentes vivos após a fertilização in vitro em camundongos31,32. Nenhum nascido vivo foi alcançado ainda em outras espécies, ressaltando a necessidade de refinamento contínuo dos protocolos para apoiar totalmente a oogênese e a foliculogênese.

Atualmente, várias estratégias são utilizadas para a cultura de folículos. As abordagens tecnicamente menos exigentes e de maior rendimento são os métodos sem andaimes, onde os folículos são colocados em um prato de plástico ou inserção de membrana33,34. Aqui, as células da granulosa aderem à superfície da cultura, perdendo o contato com o oócito33,34. A quebra da arquitetura folicular limita a usabilidade e a relevância biológica dessas técnicas. No entanto, a cultura livre de scaffold em placas de baixa inserção ou gotas invertidas permite que o folículo mantenha a integridade estrutural em várias espécies de mamíferos35 , 36 , 37 . Infelizmente, com essas técnicas, é difícil controlar a interação entre os folículos e a quantidade de suporte mecânico que eles recebem. Assim, para melhor recapitular a fisiologia in vivo, foram desenvolvidos métodos de cultura onde os folículos são encapsulados em hidrogéis com composições químicas definidas e ajustáveis e / ou propriedades mecânicas 33,34,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53. Por exemplo, o sistema de crescimento folicular in vitro encapsulado em alginato pode recapitular as principais assinaturas transcriptômicas observadas in vivo21.

Apesar do sucesso e do valor dos protocolos de cultura encapsulados, existem várias desvantagens. Eles podem ser tecnicamente desafiadores, trabalhosos, de baixo rendimento e não são compatíveis com métodos automáticos de imagem. Além disso, os métodos de cultura encapsulada precisam de abordagens de várias etapas para espécies de mamíferos maiores devido à maior expansão volumétrica do folículo37. Além disso, as técnicas encapsuladas exercem suporte uniforme em todas as direções e os folículos precisam ser liberados do hidrogel antes da ovulação. Isso não ocorre in vivo, onde o folículo interage com o microambiente ovariano circundante, que fornece suporte biomecânico dinâmico54. Por exemplo, o córtex ovariano rígido mantém a quiescência dos folículos primordiais, enquanto grandes folículos de crescimento são normalmente encontrados no compartimento medular mais macio55,56. Uma vez que um folículo com um oócito competente atinge seu tamanho terminal, as modificações na parede do folículo e no epitélio da superfície ovariana permitem a ovulação. Portanto, técnicas de cultura em que os folículos podem crescer em uma única direção com pouca resistência podem imitar melhor a fisiologia in vivo.

Em uma nova abordagem, foi desenvolvido um método de cultura reprodutível, escalável, tecnicamente menos exigente e econômico para folículos secundários multicamadas de camundongos57. Aqui, micropoços de agarose de adesão ultrabaixa com geometria precisamente controlável (forma, dimensões) e arranjo espacial (número, proximidade) são fabricados usando métodos acessíveis. Os folículos nos moldes de agarose experimentam suporte mecânico em todas as direções, exceto uma, e são cultivados no mesmo plano focal, permitindo imagens de lapso de tempo para análise morfocinética avançada. A impressão 3D de estereolitografia (SLA) foi utilizada como um método acessível para fabricar um molde mestre, seguido por etapas de moldagem que criam moldes de silicone sem lixiviado para moldar a agarose. Melhores resultados de crescimento folicular e ovulação foram alcançados usando o novo sistema em comparação com o eIVFG tradicional, sem comprometer a sobrevida geral do folículo, maturação ou luteinização57. Este artigo de protocolo descreve as etapas necessárias para personalizar e fabricar moldes de agarose, como semear e cultivar folículos secundários multicamadas, processar e, finalmente, realizar a análise de lapso de tempo (Figura 1).

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Protocolo

Todos os procedimentos em animais relacionados a este protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Northwestern University e realizados de acordo com o Guia do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Adapte o projeto do molde mestre

Esta seção descreve as primeiras etapas realizadas durante a fase de projeto (Figura 1), onde micropoços personalizados são introduzidos em um projeto auxiliado por computador (CAD) de um molde mestre para placas de cultura de 24 poços, chamado de projeto de base de molde mestre de 24 poços (Arquivo Suplementar 1). As dimensões dos micropoços determinam a quantidade de suporte e o tamanho máximo de crescimento dos folículos, enquanto o número de poços determina o número máximo de folículos por bolor de agarose. O projeto de molde mestre adaptado será usado na próxima seção para criar moldes de silicone biocompatíveis para fundição de agarose.

  1. Abra o arquivo .step do projeto da base do molde mestre de 24 poços usando o software CAD (Figura 2A).
  2. Selecione a área da superfície interna do objeto, navegue até a guia Sólido na área de trabalho Design e selecione Criar esboço para inserir o experimento de micromolde desejado (Figura 2Bi).
  3. Introduza as dimensões xy desejadas e o número de micropoços e selecione concluir esboço na barra de ferramentas (Figura 2Bii).
    NOTA: Para folículos secundários multicamadas, uma forma geométrica de estádio de 500 x 700 μm foi usada anteriormente57. A resolução de impressão pode variar dependendo das resinas e impressoras SLA utilizadas; permitir um espaçamento mínimo de 400 μm entre os micropoços.
  4. Crie os micropoços de 800 μm de profundidade usando a função de extrusão (clique em Sólido | Criar | Extrusão). Certifique-se de selecionar a operação de corte , criando a cavidade do micropoço (Figura 2Biii).
  5. Selecione um filete de 0,100 mm de raio (clique em Design | Sólido | Modificar | Filete) para o topo dos micropoços
    NOTA: Para criar um micropoço de fundo arredondado, use a operação de filete novamente para o fundo do poço de cultura e tenha o valor do raio igual ao raio do projeto do micropoço. Por exemplo, ao projetar poços de 500 μm x 700 μm, selecione um valor de raio de 0,250 mm (Figura 2Biv).
  6. Exporte uma cópia do novo projeto de molde mestre no formato .step (clique em Arquivo | exportar).

2. Criação de recipientes de molde de silicone

NOTA: Para evitar a lixiviação de compostos citotóxicos das peças impressas em 3D, serão feitos dois moldes de silicone biocompatíveis. Esta seção descreve as últimas etapas da fase de projeto (Figura 1) e resultará nos dois recipientes usados para moldagem de silicone. Aqui, três arquivos CAD diferentes serão usados, ou seja, o novo projeto de molde mestre criado a partir da seção 1 e os recipientes de fundição de silicone de 24 poços 1 e 2 (Figura 2Ci-ii e Arquivo Suplementar 2, Arquivo Suplementar 3, respectivamente).

  1. Abra o recipiente de silicone de 24 poços 1.step file e insira o novo projeto de molde mestre como um componente externo (navegue até Sólido | Inserir | Inserir componente).
    1. Clique com o botão direito do mouse no componente e selecione Quebrar vínculo para remover a referência vinculada ao novo projeto de molde mestre.
  2. Centralize o novo design do molde mestre com o recipiente de silicone de 24 poços 1 superfície, certificando-se de que ele esteja voltado para dentro.
    1. Clique com o botão direito do mouse no novo objeto de projeto de molde mestre no navegador e selecione a opção mover/copiar .
    2. Selecione a operação Movimento livre na seção Tipo de movimento e gire o objeto 180° no eixo x, se necessário.
    3. Selecione a operação Ponto a Ponto na seção Tipo de Movimento com o meio do novo objeto de projeto de molde mestre como o ponto de origem e o centro da superfície do recipiente de fundição de silicone de 24 poços 1 como o ponto de destino.
    4. Selecione OK para alinhar os objetos.
  3. Selecione a operação de corte com o recipiente como o corpo alvo e o molde mestre como o design do corpo da ferramenta (Figura 2Ciii). Isso cria o recipiente para a primeira etapa da moldagem de silicone (Figura 2Civ).
    NOTA: Os micropoços que foram projetados na primeira seção agora são micropilares que serão impressos em 3D conforme descrito na seção 3. A impressão SLA é um método de manufatura aditiva; portanto, a impressão de micropilares melhora a resolução de impressão em comparação com a impressão de micropoços.
  4. Salve e exporte o novo molde de silicone de 24 poços 1 resultante como um arquivo .stl e .step.

3. 3D impressão de recipientes de silicone

NOTA: Esta seção descreve as primeiras etapas realizadas durante a fase de fabricação (Figura 1), onde os novos projetos CAD com os recursos de projeto de micropoços desejados são impressos em 3D.

  1. Abra os arquivos .stl do novo molde de silicone de 24 poços 1 e do recipiente de molde de silicone de 24 poços 2 com o software de preparação de impressão 3D.
  2. Oriente a impressão com os micropilares voltados para cima e use a função de furo para criar uma abertura de 1 mm de largura (Figura 2D). Certifique-se de que este canal esteja aberto na lateral da impressão.
    NOTA: O orifício que evita os efeitos de escavação durante a impressão e pode ser preenchido após a impressão, ou o excesso de material de silicone pode ser removido após a primeira moldagem de silicone.
  3. Imprima os dois designs de recipientes com uma espessura de camada de 25 μm (Figura 3A).
    NOTA: Imprima cada modelo em triplicado para levar em conta imperfeições de impressão ou danos durante o processamento.
  4. Remova os moldes da plataforma de impressão e lave em isopropanol a 95% de acordo com as instruções do fabricante. Pulverize extensivamente a seção do micropilar com isopropanol a 95% (Figura 3B). Remova qualquer etanol restante com ar comprimido.
  5. Deixe o etanol restante evaporar por pelo menos 30 min.
    NOTA: Nesta fase, o canal de perfuração de 1 mm de largura pode ser vedado. Isso pode ser feito aplicando uma pequena gota de resina não polimerizada com uma ponta de pipeta p200 na parte externa da impressão. As forças capilares preencherão o canal.
  6. Catalise as impressões 3D a 60 °C com luz ultravioleta durante 15 min.
  7. Inspecione cada impressão usando um estereomicroscópio e descarte todas as impressões 3D com imperfeições (Figura 3C-F). Inspecione minuciosamente cada impressão visualmente, garantindo que todos os micropilares estejam separados e uniformes em tamanho e aparência (Figura 3D). Descarte os moldes mestre de defeitos com micropilares fundidos (Figura 3E).
    NOTA: Problemas comuns são micropilares ou pontes danificados devido à resina não lavada restante (Figura 3Fi, ii).
  8. Cubra a parte externa da impressão com parafilme se o canal de perfuração não estiver preenchido e guarde até uso posterior.

4. Fabricação de moldes de silicone

NOTA: Esta seção descreve as etapas finais da fase de fabricação (Figura 1), onde ocorrerão duas etapas de moldagem de silicone. Isso é necessário para evitar a liberação de lixiviados tóxicos por peças impressas em 3D.

  1. Prepare o silicone de acordo com as instruções do fabricante, em resumo:
    1. Misture bem o conteúdo dos recipientes das Partes A e B , coloque um copo em uma balança e despeje no recipiente na proporção de 1A:1B em peso. Certifique-se de ter excesso de material.
    2. Misture bem por 3 min, certificando-se de raspar as laterais e o fundo.
    3. Coloque o material em um dessecador a vácuo e deixe por 5 min para eliminar as bolhas de ar presas. Repita a desgaseificação até 2x se as bolhas de ar permanecerem.
  2. Despeje a mistura com um fluxo uniforme no recipiente do molde de silicone 1. Certifique-se de que o nível da mistura esteja no mesmo nível da impressão 3D ou ligeiramente abaixo para garantir o nivelamento do molde de silicone (Figura 4Ai, ii).
    1. Remova qualquer ar preso usando uma ponta de pipeta p200 e use desgaseificação a vácuo, se necessário.
  3. Catalise o silicone à temperatura ambiente durante pelo menos 5 h e de preferência durante a noite antes de desenformar.
  4. Remova o silicone do molde impresso em 3D e confirme visualmente a integridade dos micromoldes usando um estereomicroscópio (Figura 4Aiii,B). Remova o excesso de material do canal de perfuração, se necessário (Figura 4Aiv). Descarte os moldes com pontes ou micropoços comprometidos (Figura 4C).
  5. Coloque o molde de silicone no recipiente do molde de silicone 2 para a segunda etapa de moldagem de silicone (Figura 4Av). O recipiente de silicone 2 tem uma abertura de 1 mm na parede lateral que será coberta assim que o molde de silicone for colocado.
  6. Pulverize levemente o molde de silicone com óleo mineral seguro para embriões e remova qualquer excesso de óleo dos micropoços. Isso atuará como um agente desmoldante para separar as duas partes de silicone após a cura.
  7. Repita as etapas de mistura descritas na etapa 4.1 e despeje a mistura no recipiente do molde de silicone 2. Certifique-se de que o nível da mistura esteja abaixo ou na mesma altura da impressão 3D para garantir o nivelamento do molde de silicone (Figura 4Avi).
  8. Deixe o silicone curar à temperatura ambiente durante pelo menos 5 h, de preferência durante a noite, antes de desmoldar.
  9. Remova o silicone do molde impresso em 3D e separe os moldes de silicone 1 e 2 um do outro (Figura 4Avii). Confirme visualmente a integridade dos micropilares usando um estereomicroscópio (Figura 4D). Descarte o molde se houver bolhas ou excesso de óleo nos micropoços (Figura 4E).
  10. Lave o molde de silicone com etanol 70% e deixe secar ao ar por 30 min em uma capela de fluxo laminar.
  11. Coloque em uma bolsa de esterilização e autoclave usando um ciclo seco para esterilizar (pressão da jaqueta: 20 psi, temperatura da câmara: 250 ° F, tempo de esterilização: 15 min).

5. Preparação de meios de cultura

NOTA: A digestão do tecido ovariano para isolamento e cultura de folículos, maturação in vitro de oócitos e luteinização requer seis tipos de meios: meios de dissecção (DM), meios enzimáticos (EM), meios de manutenção (MM), meios de crescimento (GM), meios de maturação (IVM) e meios de luteinização (LM). A preparação desses meios pode ser encontrada conforme descrito anteriormente por Converse et al.38 com uma explicação da importância dos diferentes componentes dos meios analisados por Simon et al.33, e sua finalidade é brevemente mencionada na Tabela 1.

  1. Prepare o meio com até 1 semana de antecedência e armazene a 4 °C.

6. Fundição e armazenamento de molde de agarose personalizado e cultura de folículos

NOTA: Esta seção descreve como fundir moldes de agarose personalizados para cultura de folículos a partir dos moldes de silício gerados na seção 4. Os moldes de agarose podem ser feitos e armazenados a 4 °C até 2 semanas antes da cultura folicular.

  1. Coloque os moldes em uma bolsa de esterilização e autoclave usando um ciclo seco, conforme descrito na seção 4.11. Deixe os moldes esfriarem antes de usar.
  2. Faça a solução de agarose dissolvendo a solução estéril de agarose a 1,5% (p / v) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um micro-ondas ou placa quente. Utilize um tubo cônico estéril que é colocado em um béquer com água para permitir um aquecimento mais uniforme da agarose e retardar a solidificação da solução líquida de agarose.
  3. Pipetar a solução estéril de agarose para moldes de silício numa coifa de fluxo laminar. Pipete lenta e suavemente para minimizar a formação de bolhas e garantir que a parte superior do molde seja plana e não convexa ou côncava. A parte superior durante a fundição será a parte inferior do molde durante a cultura e deve ficar plana. Use aproximadamente 600 μL de agarose para um micromolde de placa de 24 poços e 85 μL para um micromolde que se encaixa em uma placa de 96 poços.
  4. Deixe os micromoldes esfriarem por ~ 3 min até solidificar. Inverter o molde de silicone para expelir os micromoldes para uma placa de Petri de 100 mm.
  5. Avalie os micromoldes ao microscópio quanto a deformidades, incluindo rachaduras, fusão de micropoços ou bordas incompletas. Coloque os micromoldes em PBS estéril + 1% de penicilina-estreptomicina e armazene a 4 °C por até 2 semanas antes do uso.
    NOTA: Faça mais moldes do que o necessário para levar em conta a degradação ao longo do tempo ou danos aos micromoldes ao transferir entre placas.
  6. Equilibre os micromoldes em 750 μL de Meio de Manutenção 2x por pelo menos 1 h (total de duas incubações) no dia do isolamento folicular.
  7. Remova todos os meios de manutenção, adicione 750 μL de meio de crescimento e coloque na incubadora por 1 h.
  8. Substitua por meios de crescimento frescos e equilibrados antes da semeadura.

7. Isolamento e cultura de folículos secundários tardios

NOTA: Esta seção explica como isolar e semear folículos nos micromoldes de agarose para cultura de folículos. As secundárias multicamadas são cultivadas por 8 dias, devem ter mais de 80% de viabilidade e produzir oócitos maduros. O isolamento e a cultura de folículos secundários foram descritos em detalhes significativos em outro lugar38. O isolamento e a seleção de folículos para encapsulamento de alginato estabelecido e para semeadura em bolores de agarose são consistentes.

  1. Dissecar ovários de camundongos e remover do tecido adiposo periovariano e da bursa. Coloque os ovários em 2,5 mL de meio enzimático e incube em um agitador orbital a 37 ° C por 20 min, conforme descrito anteriormente57.
  2. Pipete 2 mL de meio de manutenção em um prato de fertilização in vitro e coloque em uma incubadora (37 ° C, 5% CO2) antes do isolamento do folículo.
  3. Reação de têmpera com 250 μL de FBS. Selecione folículos secundários tardios após o isolamento enzimático e transfira-os para uma placa de fertilização in vitro com DM.
  4. Transfira os folículos para uma placa de fertilização in vitro com meios de manutenção pré-equilibrados e coloque em uma incubadora (37 ° C, 5% CO2) por 1 h.
    NOTA: O tamanho inicial dos folículos secundários tardios é de 150-180 μm com mais de duas camadas de células da granulosa presentes.
  5. Adicione 750 μL de GM fresco aos micromoldes de agarose e armazene na incubadora para preparar a semeadura. Adicione PBS estéril aos poços adjacentes ao redor dos micromoldes de agarose para manter a umidade e minimizar a evaporação do meio durante todo o período de cultura.
  6. Semeie folículos em moldes de agarose que foram pré-equilibrados e estão submersos em GM. Transfira folículos secundários multicamadas de alta qualidade para micromoldes de agarose sob um microscópio utilizando uma ponta de decapagem de 200 μm. Certifique-se de que 10 folículos sejam transferidos para cada micromolde em uma placa de 24 poços e que cada folículo esteja em um micropoço separado, mas adjacente.
    1. Dobre a ponta do stripper para permitir uma manipulação e transferência mais precisas dos folículos para os micropoços.
    2. Transfira os folículos rapidamente para minimizar as mudanças de temperatura e pH, pois MM e GM são tamponados com CO2 .
    3. Certifique-se de que os folículos dentro de um micromolde tenham um tamanho inicial semelhante depois que todos os 10 folículos forem transferidos.
  7. Coloque os micromoldes semeados de volta na incubadora por pelo menos 1 h para permitir que os folículos se recuperem antes da imagem.
  8. Imagem dos folículos com ampliação de 4x e 10x em dias alternados para quantificar a sobrevivência do folículo e os resultados do crescimento.
    NOTA: A imagem de lapso de tempo também pode ser configurada para realizar medições morfocinéticas e é descrita com mais detalhes na seção 9.
  9. Troque 50% dos meios de cultura a cada dois dias.
  10. Congele rapidamente os suportes usados com gelo seco e conserve a -80 °C. Use este meio condicionado para avaliar a produção hormonal por meio de ELISAs de estradiol.
    NOTA: Se o GM for produzido no dia da semeadura (início do período de cultivo), o meio pode ser armazenado a 4 °C e utilizado durante todo o período de cultivo.
  11. Remova e congele todos os meios de cultura (750 μL) no dia 8 da cultura.
  12. Substitua o meio de crescimento por meio IVM para permitir a ovulação in vitro .
    NOTA: A ovulação também pode ocorrer sob imagens de lapso de tempo para avaliar o tempo e as características de ruptura.
  13. Remova os complexos cumulus-oócitos (COCs) 14-16 h após a adição do meio IVM e pontue o status de maturação.
    1. Definir o estado de maturação da seguinte forma: identificar MII por extrusão do primeiro corpo polar (resultado esperado para oócitos saudáveis), GVBD/IM pela falta de corpo polar ou vesícula germinativa (maturação retardada), GV pelo núcleo esférico visível no centro do oócito (falta de progressão meiótica) ou oócito achatado degenerado e/ou escurecido.
  14. Opcional: Como os parâmetros do fuso dos oócitos MII, incluindo alinhamento, forma e volume cromossômicos, estão fortemente correlacionados com a qualidade do oócito e os resultados do embrião58,59, use-os para avaliar o sucesso da oogênese in vitro. Para avaliar a morfologia do fuso, fixe e core os ovos MII por meio de imunocitoquímica de montagem inteira.
    1. Fixação: Fixar os ovos em PFA a 3,8% com Triton X-100 a 0,1% a 37 °C por 20 min. Lave os ovos 3x em tampão bloqueador (PBS com cálcio e magnésio (PBS +/+) com 10% de Tween-20 e 0,3% de BSA).
    2. Coloração do fuso:
      1. Incubar os ovos em tampão de permeabilização (PBS +/+ com 0,1% de Triton X-100 e 0,3% de BSA) por 15 min em temperatura ambiente
      2. Enxágue 2x no tampão de bloqueio.
      3. Incube os ovos em anti-alfa-tubulina conjugada com Alexa Fluor 488 a uma concentração de 1 μg/mL em um balancim envolto em papel alumínio por 2 h em temperatura ambiente.
      4. Lave os ovos por 3 x 20 min em tampão de bloqueio antes da montagem em lâminas de microscópio com meio de montagem contendo DAPI.
      5. Para observar o citoesqueleto do oócito, inclua rodamina faloidina 1:50 durante a coloração.
    3. Amostras de imagens em um microscópio confocal usando uma objetiva de 63x com uma pilha z a uma largura de 1,0 μm em todo o fuso.

8. Aplicações a jusante de moldes de agarose personalizados

NOTA: Os micromoldes de agarose podem ser utilizados para análise histológica, permitindo a quantificação e localização de diferentes genes ou proteínas de interesse. Os micromoldes criam um microarray folicular que permite que vários folículos sejam corados em paralelo. A tomografia de coerência óptica (OCT) também pode ser realizada sem a necessidade de transferência de folículos (Figura 1, Aplicação). A Tomografia de Coerência Óptica é uma técnica de imagem que permite a reconstrução 3D de amostras e possui maior profundidade de penetração e resolução em comparação com a microscopia confocal, permitindo imagens aprimoradas de amostras 3D, como folículos cultivados in vitro60.

  1. Para aplicações histológicas, faça uma solução de agarose (1,5% p / v) conforme descrito na etapa 6.2.
    1. Remova todos os meios ao redor dos micromoldes de agarose no poço e remova cuidadosamente os meios na cavidade do micromolde utilizando uma pipeta p200 nos cantos da cavidade.
    2. Pipetar cuidadosamente 100 μL de solução líquida de agarose para encher e selar os micropoços e a cavidade sem agitar os folículos; Certifique-se de que a parte superior esteja plana. Remova todas as bolhas com uma ponta de pipeta P10 estéril.
    3. Deixe a agarose solidificar em temperatura ambiente por 2 min. Certifique-se de que o micromolde esteja totalmente selado.
    4. Fixe os micromoldes durante a noite a 4 °C com balanço suave em 750 μL de fixador (solução de Davidson modificada ou paraformaldeído a 3,8%).
    5. Aspirar o fixador e lavar os micromoldes selados em concentrações ascendentes de etanol, começando com 50% e finalmente 70% de EtOH.
    6. Processe usando um processador de tecido automatizado utilizando protocolos de processamento padrão (Tabela 2) e incorpore em cera de parafina. Ao incorporar, anote a orientação dos micromoldes. Certifique-se de que haja cera antes e depois da amostra durante o processo de incorporação para minimizar a perda de tecido durante o seccionamento.
    7. Corte em série amostras embutidas com 5 μm de espessura e coloque em lâminas de microscópio carregadas.
    8. Realize a coloração H&E por um corante automático e sele com meio de montagem antes da imagem.
  2. Ao realizar a OCT, coloque o micromolde com folículos em uma placa de 50 mm contendo meio IVM.
    1. Para seguir o procedimento utilizado para gerar as imagens OCT representativas, obter imagens utilizando um sistema OCT personalizado que funcione dentro da gama espectral da luz visível com uma resolução axial de 1,3 μm e uma resolução lateral de 9,4 μm61,62.
    2. Escaneie os folículos em um campo de visão de 1,58 x 1,58 mm2 , consistindo em 512 linhas A e 512 varreduras B, repetidas 2x por varredura B e 3x por volume.
    3. Processe imagens de OCT usando o ImageJ para visualizar a estrutura 3D dos folículos e quantificar os volumes.
      1. Carregue imagens no ImageJ como uma pilha Z arrastando arquivos para o aplicativo aberto.
      2. Visualize o z-stack como uma imagem 3D acessando Plugins|3D|Visualizador de volume. Gire a imagem 3D para visualizar diferentes ângulos em diferentes pontos de tempo.
      3. Navegue até Arquivo| Salvar como |Tiff para salvar a imagem no local desejado.

9. Análise de timelapse da cultura folicular

NOTA: Os folículos cultivados no sistema de cultura sem andaime residem no mesmo plano focal e são compatíveis com a imagem de lapso de tempo na incubadora. A imagem de lapso de tempo pode ser iniciada após a semeadura dos folículos na etapa 7.7 (Figura 1, Aplicação).

Certifique-se de que todas as alterações sejam precisas durante todo o lapso de tempo. Portanto, passe por toda a pilha após cada etapa para garantir que não haja discrepâncias nas medições.

  1. Configuração de lapso de tempo:
    1. Coloque uma tampa do focalizador/concentrador de luz no microscópio portátil.
    2. Coloque o microscópio portátil com suporte de montagem na incubadora e conecte-o a um laptop com software instalado.
    3. Coloque e alinhe bem a cultura sob o microscópio e ajuste a altura e o foco do microscópio para que todos os folículos fiquem em foco. Usando o Balanço de Branco Automático (AWB), escolha as condições ideais de iluminação usando o Controle de LED, desative a Exposição Automática (AE) e selecione o tempo de exposição ideal.
      NOTA: Certifique-se de que o alinhamento do molde seja o mesmo antes e depois de cada troca de mídia; caso contrário, a análise terá que ser feita separadamente para cada 2 dias de cultura.
    4. Inicie a imagem em timelapse, selecionando uma duração de 8 dias e intervalo de 30 min. Selecione a foto e desligue o LED quando não estiver tirando fotos.
  2. Especifique quais medidas serão registradas na caixa de diálogo definir medidas (clique em Analisar | definir medidas) antes da análise do ImageJ.
    NOTA: Para obter mais informações sobre possíveis medições incorporadas ao software ImageJ, consulte a subseção 30.763 do guia do usuário.
  3. Coloque todas as imagens em uma pasta de análise separada para iniciar a análise.
  4. Arraste e solte a pasta de análise no software ImageJ para abrir o lapso de tempo como uma pilha. Certifique-se de que os nomes de classificação numericamente estejam selecionados e, se as sequências de imagens não couberem na RAM do computador, selecione a pilha virtual.
  5. Use a ferramenta de seleção retangular para selecionar uma área onde todos os folículos ao longo do lapso de tempo estejam presentes. Para isso, use a última imagem primeiro e percorra a pilha para garantir que nenhum dos folículos seja cortado. Em seguida, corte a seleção (navegue até Imagem | Cortar ou Ctrl+Shift+X, Figura 5Ai,ii).
  6. Defina a barra de escala para a pilha de lapso de tempo (Analisar | Definir escala). Utilize a imagem do dia 0 feita com o gerador de imagens e meça três características identificáveis, como folículos ou micropoços. Use a mesma imagem do dia 0 da pilha de lapso de tempo e defina a escala para uma das medições; Use as outras duas medições para confirmar se a escala precisa está definida.
  7. Alinhe todas as imagens usando o plug-in SIFT (navegue até Plug-ins | Inscrição | Alinhamento de pilha linear com SIFT, (Figura 5Bi, ii). Use as seguintes configurações padrão, que podem ser ajustadas caso a caso: Alinhamento de pilha linear com SIFT, initial_gaussian_blur = 1,60 steps_per_scale_octave = 3 minimum_image_size = 64 maximum_image_size = 1024 feature_descriptor_size = 4 feature_descriptor_orientation_bins = 8 mais próximo/next_closest_ratio = 0,92 maximal_alignment_error = 25 inlier_ratio = 0,05 expected_transformation = Interpolar rígido.
  8. Converta a pilha em tons de cinza de 8 bits (Imagem | Tipo | 8 bits).
  9. Remova o plano de fundo utilizando a subtração de fundo da bola rolante (clique em Processar | Subtrair fundo, Figura 5Ci,ii) usando as seguintes configurações, que podem ser ajustadas caso a caso: Raio da bola rolante = 70,0 pixels; Selecione Desativar suavização.
  10. Limite da imagem (navegue até Imagem | Ajustar | Threshold) para dividir as imagens de lapso de tempo em duas classes de pixels, usando as seguintes configurações: setThreshold(35, 255, "raw"); run("Aplicar LUT", "stack"); setOption("BlackBackground", true); run("Converter em máscara", "method=Intermodes background=Dark calculate black").
  11. Meça cada folículo individualmente usando a seleção de retângulo e selecione a função de análise de partículas (clique em Analisar | Analisar partículas). Use as seguintes configurações: Analisar partículas...", "size= 8000-Infinity display exclude include summarize overlay add composite stack (Figura 5Di,ii).
    1. Antes de salvar os resultados, confirme se o ROI de cada imagem é preciso (Figura 5Ei,ii). Salve o resumo e os resultados no arquivo . CSV.
    2. Repita isso para todos os outros folículos.

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Resultados

Para determinar se a sobrevivência e o crescimento dos folículos foram suportados usando essa nova tecnologia, conforme descrito na seção 7 do protocolo, os folículos dos mesmos camundongos foram isolados e cultivados em paralelo em micromoldes de agarose ou encapsulados em alginato a 0,5%. Imagens representativas de folículos de todos os dias de cultura demonstraram desenvolvimento, crescimento e formação normais de uma cavidade antral durante todo o período de cultura (

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Discussão

A gametogênese e a maturação in vitro são tecnologias-chave para a compreensão fundamental da biologia do oócito, com aplicações potenciais em tecnologia de reprodução assistida, preservação da fertilidade e conservação de espécies. Os métodos para apoiar a IVG geralmente dependem da co-cultura com células somáticas para criar ovários reconstruídos30. A importância dessas células de suporte é bem conhecida in vivo, onde o microambiente somático f...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (R01HD105752 para F.E.D e T32HD094699 para E.J.Z) e pelo programa SenNet do NIH Common Fund (U54AG075932 e UH3CA268105 para F.E.D.) e pela Bolsa da Fundação Bill & Melinda Gates (INV-003385 para F.E.D.). Sob as condições de concessão da Fundação Bill & Melinda Gates, uma Licença Genérica Creative Commons Atribuição 4.0 já foi atribuída à versão do Manuscrito Aceito pelo Autor que pode surgir desta submissão.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Materiais e Produtos Químicos
  Tubos de centrífuga de poliestireno de 50 mLGlobe Scientific941-11017-CS
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mLFisher ScientificMCT-150Para congelar e armazenar mídia
Placa de 100 mm, não tratadaFisher Scientific08-757-100D Para fabricar e armazenar micromoldes de agarose
100% etanolMercedes Scientific1200Processamento de tecidos
1000 & micro; L  Ponteiras de pipeta, baixa retençãoMIDSCIPR-1000BKDicas de cultura  
200 & micro; L  Ponteiras de pipeta, baixa retençãoMIDSCIPR-200BKDicas de cultura  
Placa de 24 poçosCorning353047Cultura
Antenas de 35 mmFalcon351008Isolar ovários e incubar em meios enizmáticos
95% de etanolMercedes Scientific1210Processamento de tecidos
AgaroseHoeferGR140Micromoldes
Óleo Mineral BioXtra, Óleo Leve, Adequado para cultura de células embrionárias de camundongosSigma-AldrichM5310-500MLUsado como agente biocompatível de desmoldagem
Albumina Sérica Bovina  MP Biomédicos103700Meios de Crescimento
Espanadores de limpeza, 10 oz., pacote de 6Office Depot 110284Ar comprimido
Resina V4 Transparente 1 LFormlabs, IncRS-F2-GPCL-04Resina para impressão 3D
Béquer plástico reutilizável Corning de baixa forma de 100 mL, polipropileno graduadoCorning1000P-100Béquer para misturar componentes de silicone  
DNAse IQiagen79254Mídia Enzimática
Ecoflex 00-45 Quase LivreSmooth-On, IncB09M8Y9PTVMaterial de silicone
F-12 + GlutaMAXGibco31765-035Meios de Crescimento
Feto Bovino FetalSigmaF-3385Meios de Crescimento
Soro Bovino Fetal (FBS)Soro de picoPS-FB2Dissecação de Mídia, Mídia Enzimática,   Mídia de Manutenção & Mídia de Maturação
Fisherbrand  Bolsas de EsterilizaçãoFisher Scientific01-812-50 Bolsas de Esterilização
Hormônio folículo-estimulante (FSH)EMD Serono, Inc.Apenas Gonal-F Rx  Mídia de Crescimento & Mídia de Maturação
Gibco  DPBS, cálcio, magnésioFisher Scientific14-040-182 Soro tampão fosfatado de Dulbecco
Gonadotrofina coriônica humana (hCG)Sigma AldrichC1063-1VLMídia de Maturação
Insulina-transferrina-selênio (ITS)ThermoFisher41400045Meios de Crescimento
Sondas Moleculares de Invitrogen Rhodamine PhaloidinFisher ScientificR415Mancha do citoesqueleto do ovo
Pratos de FIVTermo Científica150260Para isolar, selecionar e pré-equilibrar os folículos
Leibovit'z 15 (L15)Gibco11415-064Dissecação e Mídia Mídia Enzimática
LiberaseSigma Aldrich5401119001Mídia Enzimática
MEM? + GlutaMAXGibco32561-037Mídia de Manutenção,   Mídia de Crescimento & Mídia de Maturação
Fator de crescimento epidérmico do camundongo (EGF)BD em Biociências354010Mídia de Maturação
Dessecador Nalgene Transparente de Policarbonato ClássicoTermo Científica5311-0250Dessecador a vácuo  
ParafinaFisher Scientific83-30Processamento de Tecidos e Processamento de Tecidos Incorporação
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-122Meios de Dissecação, Meios Enzimáticos e Mídia de Manutenção
Ponteiras de stripperOrigioMXL3-200Cultura
Médio de montagem antifade VECTASHIELD PLUS com DAPILaboratórios VectorH-2000Coloração do núcleo do ovo
XyleneMercedes Scientific9840Processamento de tecidos
α-Tubulina (11H10) Coelho mAb (Alexa Fluor 488 Conjugado)Tecnologia de Sinalização Celular5063SColoração de ovo com tubulina
Equipamento
Build Platform 2Formlabs, IncBP-F3-02-01 Componente de impressora 3D
Dino-Lite Edge AF4915ZTL, USB 2.0Dino-LiteAF4915ZTLImager para configuração de timelapse
Forma 3 Tanque de Resina V2.1 Formlabs, IncRT-F3-02-01Componente de impressora 3D
Impressora 3D Formulário 3B+Formlabs, IncF3B-P-IMPRESSORAImpressora 3D de estereolitografia (SLA) da Formlabs
Cura da forma Formlabs, IncFH--01Plataforma de cura  
Lavagem de formaFormlabs, IncFH-WA-01Plataforma de lavagem
Borrifador com vaporizador de bombaVWR0309-3005Para aplicar o agente de desmoldagem
Capacitor de focalizador/concentrador de luz para a série Edge (excluindo os modelos T5, T8)Dino-LiteN3C-RComponente do imager para configuração de timelapse
Conjunto Suporte de Montagem que combina o rack RK-10 e a extensão de braço RK-10-EXDino-LiteRK-10AComponente do imager para configuração de timelapse
Embedder de tecidoLeicaHistoCore ArcadiaPara incorporar micromoldes
Processador de tecidosLeicaTP1020Para processar micromoldes
Incubadora de Sacudição 211DS (Sacudidor Orbital)Labnet InternationalI-5211-DSIncubar ovários em meios enzimáticos para liberação de folículos
Software 
Autodesk FusionAutodesk, IncSoftware de design assistido por computador (CAD). A Autodesk oferece acesso educacional gratuito por meio do programa Autodesk Education.
DinoCapture 3.0 versão 1.1.1.3 Dino-Lite
ImageJInstitutos Nacionais de SaúdeAnalisar imagens de OCT e medir folículos
Pré-formaFormlabs, IncSoftware gratuito de preparação de impressão projetado para funcionar com impressoras de estereolitografia (SLA) da Formlabs. 

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