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Artigo de método

Modelo de glioma circulante para investigações de terapia com células T do receptor de antígeno quimérico

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DOI:

10.3791/68881

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17 de outubro de 2025

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1School of Chemistry and Chemical Engineering, Southeast University, 2Department of Immunology, Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province, Gusu School, Nanjing Medical University, 3Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Neurosurgery, The Affiliated Brain Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Clinical Laboratory Medicine, Children's Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo estabelece um modelo de glioma circulante pela injeção do ventrículo lateral para investigar o efeito terapêutico da terapia com células T do receptor de antígeno quimérico in vivo.

Resumo

As células tumorais circulantes no líquido cefalorraquidiano (LCR) são um fator significativo na recorrência tumoral e na metástase intracraniana no glioma. Muitos estudos estão tentando identificar estratégias eficazes para direcionar e eliminar o tumor circulante no LCR. A terapia com células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) tem sido frequentemente usada para vários tumores circulantes. No entanto, a pesquisa é limitada devido à falta de um modelo de glioma circulante adequado. Aqui, um modelo de glioma circulante foi desenvolvido e aplicado em investigações de terapia com células T CAR. Este modelo foi construído utilizando a injeção do ventrículo lateral, que é amplamente utilizada no tratamento local da doença intracraniana. As células de glioma foram injetadas no ventrículo lateral para formar o tumor primário intracraniano. Os tumores que foram eliminados do ventrículo lateral foram usados para indicar o tumor circulante no LCR. O modelo é fácil de construir e pode ser aplicado em vários estudos sobre a terapia com células T CAR do glioma circulante. Como resultado, o modelo de glioma circulante fornece um modelo exclusivo de metástase de glioma para estudos eficazes de terapia com células T CAR do tumor circulante.

Introdução

O glioma é o tumor cerebral maligno primário mais comum em adultos 1,2. Os tratamentos atuais, incluindo cirurgia, radioterapia e quimioterapia, mostram eficácia limitada, com sobrevida média de apenas 14-15 meses 3,4,5. As células de glioma circulantes no LCR desempenham um papel crucial na recorrência do tumor e na metástase intracraniana 6,7. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver estratégias de tratamento mais eficazes para eliminar as células de glioma circulantes.

Pesquisas recentes sobre glioma têm se concentrado principalmente em tumores primários intracranianos 8,9. No entanto, o problema mais importante que precisa ser abordado na clínica é como direcionar e eliminar as células de glioma circulantes. Portanto, estudos sobre o glioma circulante antes ou após a cirurgia precisam de mais atenção. A terapia com células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) é a estratégia mais comum utilizada em estudos com células tumorais circulantes10,11. No entanto, devido à estrutura anatômica especial dos tumores intracranianos, é difícil desenvolver um modelo de glioma circulante adequado, o que é fundamental para o estudo do glioma circulante 12,13,14,15,16.

Este estudo gerou um modelo único de glioma circulante baseado na injeção do ventrículo lateral. Neste modelo, as células do glioma são injetadas no ventrículo lateral, e o tumor primário intracraniano e o tumor circulante no LCR são detectados por imagem bioluminescente in vivo e análise de citometria de fluxo no dia 10. A terapia CAR-T foi iniciada quando a carga tumoral nos camundongos modelo de glioma circulante atingiu aproximadamente 6,5 × 105p / s. A carga tumoral foi monitorada a cada 5 dias para avaliar o efeito terapêutico das células CAR-T. Este modelo mimetiza o estado de descamação de células tumorais de pacientes com glioma e pode ser usado em vários estudos sobre glioma circulante.

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Protocolo

Os experimentos com animais neste estudo foram todos aprovados e supervisionados pelo Conselho de Revisão Institucional e pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Médica de Nanjing (IACUC-1905048). Camundongos fêmeas C57BL/6J, com idades entre 6 e 8 semanas, foram utilizados para o presente estudo. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação animal

  1. Alojar os ratos em uma barreira, ciclo claro/escuro de 12 h/12 h, temperatura ambiente de 24 °C e umidade relativa de 50% da gaiola.
  2. Pesar os camundongos e anestesiar-os (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) com uma injeção intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico e 10 mg/kg de xilazina17.
    NOTA: A combinação de pentobarbital sódico e xilazina é amplamente utilizada em procedimentos de injeção estereotáxica em camundongos. A anestesia adequada foi confirmada pela falta de resposta a um beliscão do dedo do pé, garantindo que o animal estivesse totalmente inconsciente antes da cirurgia. Para evitar o ressecamento e danos à córnea, pomada oftálmica veterinária foi aplicada nos olhos durante a anestesia.
  3. Remova o cabelo da cabeça de um rato com um barbeador de animais de laboratório e fixe a cabeça e os membros do rato no aparelho estereotáxico.
  4. Esterilize a cabeça do camundongo usando o iodóforo com um cotonete e cubra o resto do corpo do camundongo com a toalha cirúrgica estéril.
  5. Corte o couro cabeludo cerca de 1 cm ao longo da linha média no topo da testa direita com um bisturi.
    NOTA: Todos os instrumentos cirúrgicos devem ser devidamente esterilizados antes do uso para evitar infecções. Deve-se tomar cuidado para manusear os instrumentos com cautela para evitar ferimentos, e todos os procedimentos devem ser realizados em um ambiente estéril.
  6. Ajuste o clipe nasal e a haste auricular, certificando-se de que a diferença de altura do eixo Z entre a sutura lambda e o bregma seja menor ou igual a 0,05 mm.

2. Construção do modelo de glioma circulante

  1. Marque o ponto 1,5 mm para o lado direito da linha média e 1,1 mm para o lado posterior do bregma usando um cotonete embebido em violeta de genciana (coordenadas: AP -1,1 mm, ML -1,5 mm de bregma).
  2. Usando uma broca craniana em miniatura com um diâmetro de 0,5 mm, faça furos nas coordenadas do alvo para expor a dura-máter.
  3. Enxágüe com soro fisiológico para remover os detritos ósseos.
  4. Retire 5 μL de suspensão de células tumorais usando uma microsseringa com rolha limitadora de profundidade (GL261-Luc-Gfp, 1×105 células/μL em PBS contendo 0,1% de BSA).
  5. Insira a agulha a uma taxa de 0.2 mm/s a uma profundidade de 3.0 mm e retorne a agulha em 0.5 mm, faça uma pausa de 10 s para estabilizar a pressão do tecido.
  6. Injete células a 1 μL/min usando uma bomba de microinjeção calibrada, com um tempo de permanência de 10 minutos após a injeção para minimizar o refluxo.
  7. Retire a microsseringa lentamente, aplique pressão no local da injeção com um cotonete estéril por 30-60 s.
  8. Suturar o couro cabeludo com sutura cirúrgica absorvível (6-0) e desinfetar novamente a incisão com iodóforo.
  9. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento de 37 °C controlada com precisão para reaquecer e monitorar seu estado de saúde.
  10. Retorne o mouse a uma gaiola limpa depois de demonstrar reflexo de endireitamento sustentado e locomoção espontânea.
  11. Visualize o camundongo com um sistema de imagem bioluminescente in vivo (IVIS Spectrum) para detectar o tumor transplantado no 10º dia após a apresentação do tumor.
  12. Injete no camundongo por via intraperitoneal sal de D-luciferina potássica (150 mg / kg).
    NOTA: Dilua o sal de potássio de D-luciferina usando D-PBS estéril.
  13. Induzir a anestesia com isoflurano a 2% em 1 L/min O2 durante o período de espera de 10 min.
    NOTA: O isoflurano deve ser usado em uma coifa química ventilada para minimizar a exposição aos vapores anestésicos. Isso é para garantir a segurança dos animais e dos pesquisadores durante o procedimento.
  14. Mantenha a anestesia com isoflurano a 1,5% via cone nasal.
  15. Realize imagens bioluminescentes usando o IVIS Spectrum.
  16. Realize a coleta de LCR perfurando a cisterna cerebelomedular no mouse.
    NOTA: O LCR foi coletado por punção da cisterna cerebelar-medular em camundongos sob anestesia com isoflurano. Todos os procedimentos, incluindo anestesia, exposição cirúrgica e coleta de amostras, foram realizados em condições de FPS para minimizar o risco de contaminação e infecção. Os camundongos foram colocados em decúbito ventral em uma estrutura estereotáxica, e a cisterna magna foi cuidadosamente exposta sob um microscópio de dissecação. Uma agulha de seringa Hamilton 27 G foi usada para perfurar a cisterna e coletar o LCR usando uma técnica de mão livre. Aproximadamente 5-10 μL de LCR claro foram obtidos de cada camundongo. Para reduzir ainda mais o risco de infecção, o sítio cirúrgico foi esterilizado com Iodophor antes da punção, e todos os instrumentos cirúrgicos foram autoclavados. Após a coleta do LCR, o local da punção foi suavemente comprimido com algodão estéril para impedir qualquer vazamento de fluido. Os camundongos foram então colocados em uma almofada de aquecimento e monitorados continuamente até a recuperação total da anestesia. Analgésicos pós-operatórios foram administrados para aliviar o desconforto. Os animais foram observados diariamente por pelo menos três dias consecutivos para garantir a ausência de sintomas neurológicos ou sinais de infecção.
  17. Realize citometria de fluxo para detectar células tumorais no LCR. A população GFP+ representa células tumorais.
    NOTA: A linha celular de glioma murino GL261 foi projetada para transportar a luciferase (Luc). Quando o valor de fluorescência atinge ~ 5 × 105células tumorais p / areia são detectadas no LCR, o procedimento é bem-sucedido. O software de imagem utilizado foi o Living Image 4.5.2, e os parâmetros de imagem foram definidos como Luminescente.
  18. Selecione os camundongos com tumor bem-sucedido para avaliar a eficácia terapêutica das células CAR-T.

3. Tratamento do glioma circulante por injeção de células CAR-T no ventrículo lateral

  1. Quando o tamanho do tumor nos camundongos modelo de glioma circulante se tornar ~ 6,5 × 105 p / s, selecione esses camundongos para tratamento CAR-T.
  2. Pese os camundongos modelo de glioma circulante e anestesie os camundongos com uma injeção intraperitoneal de 50 mg / kg de pentobarbital sódico e 50 mg / kg de xilazina.
  3. Repita o processo das etapas 1.3 a 1.5.
  4. Separe o couro cabeludo e o crânio e identifique com precisão o orifício feito durante a construção do modelo de glioma circulante e siga o procedimento mencionado nas etapas 2.2-2.3.
  5. Aspire 10 μL de suspensão de células CAR-T com uma microseringa, insira cuidadosamente a agulha no ventrículo lateral do camundongo, ajuste a profundidade da injeção usando o aparelho estereotáxico e administre lentamente a solução de células CAR-T.
    NOTA: Consistente com a injeção de células GL261, as células CAR-T foram injetadas no ventrículo lateral direito (coordenadas: AP -1,1 mm, ML -1,5 mm do bregma), com uma profundidade de injeção de 2,5 mm.
  6. Guarde a agulha por 10 min, depois remova lentamente a agulha e pressione levemente o ponto de injeção com gaze estéril para evitar qualquer sangramento após a conclusão da injeção. Suturar o couro cabeludo com sutura cirúrgica absorvível (6-0) e desinfetar a incisão.
  7. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento de 37 °C controlada com precisão para reaquecer e monitorar seu estado de saúde.
  8. Retorne o mouse a uma gaiola limpa depois de demonstrar reflexo de endireitamento sustentado e locomoção espontânea.
  9. Realizar imagens bioluminescentes in vivo para monitorar o crescimento de tumores em camundongos. A imagem óptica permite a avaliação da eficácia terapêutica das células CAR-T.
  10. Pese os camundongos em dias alternados e realize imagens BLI a cada 5 dias para rastrear com mais precisão o crescimento do tumor até que o ponto final terminal seja alcançado.
  11. Eutanásia do camundongo e fixe o tecido cerebral em paraformaldeído a 4% por 24-48 h.
  12. Incorporar os tecidos em parafina e seccioná-los em fatias de 5 μm de espessura.
  13. Desparafinize as seções, reidratar com álcoois graduados, corar com hematoxilina, contra-manchar com eosina e montar as seções com uma lamínula.
    NOTA: Para o presente estudo, o desfecho terminal foi o dia 30, e os camundongos foram sacrificados por uma overdose de pentobarbital sódico com uma injeção intraperitoneal. As carcaças de camundongos foram entregues ao Centro de Animais Experimentais Médicos da Universidade Médica de Nanjing para descarte. As agulhas descartadas foram colocadas em um recipiente para perfurocortantes e entregues ao Departamento de Gerenciamento de Laboratórios e Equipamentos da Universidade Médica de Nanjing para descarte centralizado.

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Resultados

O diagrama esquemático do modelo de glioma circulante para terapia CAR-T é mostrado na Figura 1. As células CAR-T foram injetadas no ventrículo lateral usando uma microsseringa para demonstrar seu efeito terapêutico. Este método permite a entrega direta das células CAR-T ao cérebro, visando as células de glioma circulantes. O procedimento de injeção foi realizado no dia 11, após a implantação de células GL261 no ventrículo lateral do camundongo. Em vários mom...

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Discussão

O modelo de glioma circulante estabelecido neste estudo utilizando injeção de ventrículo lateral proporciona um avanço significativo, oferecendo várias vantagens em relação aos modelos existentes. A técnica de injeção do ventrículo lateral é altamente reprodutível, permitindo uma modelagem consistente do tumor em um período de tempo relativamente curto. Isso o torna uma ferramenta valiosa para pesquisadores que buscam investigar a disseminação de células tumorais no LCR e avaliar a eficá...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82230059), o Programa de Desenvolvimento de Pesquisa Chave da Província de Jiangsu da China (BE2022770).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sutura cirúrgica absorvívelXangai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdR611
CAR-TBiolabs criativos
D-Luciferina sal de potássioMCEHY-12591B
GL261-Luc-GFPXangai Zhong Qiao Xin Zhou Biotecnologia Co., Ltd.ZQ0932
Sistema de imagem bioluminescente in vivoTanonTanon ABL X6
Máquina de barbear para animais de laboratórioBeyotime BiotecnologiaFS600
MousesInstalação Animal Core da Universidade Médica de Nanjing
Bomba de microinjeçãoRWDR462
MicrosseringaHamilton87943
Mini broca cranianaRWD78001
Pentobarbital sódico ChemSrc57-33-0
Aparelhos estereotáxicosRWD68043
xilazinaChemSrc7361-61-7

Referências

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