Avaliação da excitabilidade do córtex motor primário e modulação da excitabilidade emparelhando a estimulação magnética transcraniana com eletromiografia

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo que descreve a metodologia para avaliar a excitabilidade do córtex motor primário e a modulação da excitabilidade usando estimulação magnética transcraniana (TMS) emparelhada com eletromiografia (EMG).

Abstract

Descrevemos um protocolo para avaliar a excitabilidade do córtex motor e sua modulação, por meio do uso pareado de eletromiografia (EMG) e estimulação magnética transcraniana repetitiva (TMS) do córtex motor primário (M1). Os registros EMG usam um sistema personalizado e os eletrodos de superfície são colocados sobre o primeiro músculo interósseo dorsal direito (FDI), com um eletrodo terra no cotovelo esquerdo. A EMT é realizada por meio de um estimulador magnético com bobina em forma de oito, guiado por um sistema de neuronavegação. O hotspot motor para o FDI é identificado pela aplicação sistemática de pulsos TMS únicos enquanto ajusta o posicionamento da bobina e é usado como alvo para todos os procedimentos TMS. O limiar motor em repouso (rMT) é definido como a intensidade mínima necessária para provocar potenciais evocados motores (MEPs) ≥ 50 μV no registro EMG, em pelo menos 5 de 10 tentativas, enquanto o limiar motor ativo (aMT) é a intensidade mínima necessária para evocar MEPs ≥ 200 μV em pelo menos 5 de 10 pulsos, enquanto o participante mantém 10-20% de sua ativação muscular voluntária máxima. A excitabilidade cortical basal é definida como a amplitude média de MEP obtida a partir de 40 pulsos únicos de TMS aplicados a 120% rMT, com pulsos entregues em intervalos aleatórios (6-10 s). A modulação da excitabilidade do córtex motor é obtida usando um protocolo de estimulação intermitente theta-burst (iTBS) (trigêmeos de pulso de 50 Hz, 80% aMT, 5 Hz por 2 s ligado/8 s desligado, repetido 20 vezes; 600 pulsos no total). A modulação da excitabilidade é avaliada através da repetição das medições da amplitude MEP em quatro momentos pós-estimulação: imediato (T0), 10 min (T10), 20 min (T20) e 30 min (T30). Este protocolo garante uma avaliação precisa e reprodutível da excitabilidade do córtex motor e capta o pico dos efeitos modulatórios resultantes da iTBS.

Introduction

A estimulação magnética transcraniana (EMT) é uma técnica de neuroestimulação não invasiva que induz um campo magnético capaz de penetrar no couro cabeludo e no crânio, provocando atividade neuronal ao atingir o tecido cortical¹. A EMT permite a avaliação in vivo da neurofisiologia do sistema nervoso central (SNC) em humanos ^2,3,4. Quando entregue em trens repetidos (EMT repetitiva ou EMTr) em regiões corticais específicas, a EMT pode induzir alterações na excitabilidade do alvo cortical que se estendem além da duração da estimulação, dependendo dos parâmetros do protocolo aplicado⁵. A EMT de pulso único é comumente empregada para medir a excitabilidade cortical e, quando aplicada pré e pós-EMTr, permite a quantificação da modulação da excitabilidade cortical induzida pela EMT2,3,4. O córtex motor primário (M1) tem sido um dos principais alvos de tais protocolos, pois seu débito funcional pode ser facilmente quantificado por meio de registros eletromiográficos (EMG^{) 6,7}. Em comparação com outras técnicas neurofisiológicas e de neuroimagem, como eletroencefalografia (EEG) e ressonância magnética funcional (fMRI), o TMS-EMG oferece mais vantagens para a implementação clínica. O EEG requer configuração extensa do eletrodo, gerenciamento cuidadoso de artefatos e processamento de sinal sofisticado⁸, enquanto o fMRI envolve custos mais altos, acessibilidade limitada e fornece menos resolução temporal⁹. O TMS-EMG depende de registros EMG de superfície relativamente simples, com análise centrada em métricas diretas e objetivas, como amplitude e latência do potencial evocado motor (MEP). Essa simplicidade na aquisição e processamento, combinada com tempos de configuração mais curtos e menores demandas de infraestrutura, torna o TMS-EMG particularmente adequado para tradução na prática clínica, onde são necessários biomarcadores rápidos, confiáveis e reprodutíveis¹⁰.

Medidas de modulação da excitabilidade cortical são consideradas indicadores indiretos de neuroplasticidade, definida como a capacidade do cérebro de sofrer mudanças funcionais e estruturais em resposta a estímulos intrínsecos ou extrínsecos^11,12. Alterações na neuroplasticidade têm sido implicadas em várias condições neuropsiquiátricas, como o transtorno depressivo maior (TDM)13,14,15,16. Dada a capacidade de sondar mecanismos neuroplásticos, in vivo, e aplicabilidade prática em contextos clínicos, a avaliação da modulação da excitabilidade cortical derivada da EMG-TMS tem sido estudada como um potencial biomarcador para distúrbios neuropsiquiátricos 17,18,19. Essas medidas podem ser promissoras tanto como biomarcador diagnóstico¹⁸ quanto como preditor dos resultados do tratamento^14,15. A EMT de pulso único ou emparelhado é normalmente administrada em intensidades expressas como uma porcentagem do limiar motor em repouso (rMT), ou seja, a intensidade mínima necessária para gerar uma resposta motora (rMT; comumente 110-130% rMT), com protocolos frequentemente empregando 20-40 pulsos para estimar com segurança a excitabilidade corticoespinhal e várias centenas de pulsos para avaliar a modulação pré e pós-intervenção, em diferentes momentos²⁰. Os intervalos entre pulsos (IPI) geralmente devem ser de >4 s para minimizar os efeitos de transferência e garantir a independência de sucessivos MEPs²¹. Quando usados para modulação da excitabilidade cortical, os protocolos geralmente dependem de rTMS de baixa frequência (rTMS; ≈ 1 Hz, 600-1800 pulsos) ou estimulação contínua de theta-burst (cTBS; 3 pulsos a 50 Hz, repetidos a cada 200 ms, continuamente por 40 s) para induzir efeitos posteriores inibitórios. Para facilitar a excitabilidade cortical, os protocolos geralmente dependem de EMTr de alta frequência (EMTr; ≥ 5 Hz, tipicamente 5-20 Hz, 600-2000 pulsos) ou estimulação intermitente de theta-burst (iTBS)²². O iTBS normalmente consiste em 600 pulsos entregues como rajadas de 3 estímulos a 50 Hz, repetidos a 5 Hz por 2 s, com trens aplicados intermitentemente a cada 10 s, em intensidades em torno de 80% do limiar motor ativo (aMT). Esse padrão tornou-se o mais amplamente adotado para fins experimentais e clínicos, devido à sua eficiência, menor duração e robusta facilitação da plasticidade cortical^23,24.

No entanto, a utilidade clínica permanece limitada por desafios metodológicos não resolvidos. Os esforços para enfrentar esses desafios - principalmente examinando e melhorando a confiabilidade das medições - produziram achados inconsistentes 25,26,27,28,29. Essas inconsistências podem ser atribuídas, pelo menos em parte, a armadilhas metodológicas substanciais e heterogeneidade entre os estudos, incluindo variabilidade nos parâmetros de rTMS, onde, por exemplo, os números de pulso variam de 20 a 1800 pulsos em paradigmas de baixa frequência²² e de trens iTBS de 600 pulsos a versões modificadas de 1200 pulsos³⁰. Além disso, estudos sem neuronavegação mostraram variabilidade na amplitude da PEmáx e menores efeitos modulatórios de um protocolo de EMTr quando comparado a protocolos com neuronavegação³¹. O tamanho das amostras em estudos publicados também tem sido relativamente modesto, muitas vezes entre 10 e 25 participantes, limitando o poder estatístico³². Além disso, abordagens estatísticas limitadas para avaliar a confiabilidade têm sido implementadas, com alguns estudos contando com outras medidas além do coeficiente de correlação intraclasse (CCI)^24,33, que é geralmente considerado o índice mais adequado para a confiabilidade teste-reteste26.

Protocolos para aquisição e análise de excitabilidade cortical com paradigmas TMS-EMG também podem contribuir para variabilidade adicional. Fatores metodológicos específicos, como o número de pulsos de EMT administrados, podem produzir baixa confiabilidade, com estimativas baseadas em menos de 20 MEPs, enquanto a média de ≥30 MEPs fornece uma medida estável da excitabilidade corticoespinhal. Da mesma forma, o IPI demonstrou influenciar a excitabilidade com intervalos de 2 s ou menos, induzindo alterações na excitabilidade cortical devido aos efeitos cumulativos da estimulação, enquanto intervalos mais conservadores de mais de 4 s reduzem esses fatores de confusão²¹. As técnicas de aquisição de EMG^34,35 também podem influenciar a confiabilidade da medição, por exemplo, com a configuração bipolar oferecendo melhor seletividade espacial e redução da contaminação da atividade de músculos próximos em relação a uma configuração monopolar^34,35. A padronização dos protocolos de aquisição e processamento de dados é, portanto, essencial para melhorar a avaliação da modulação da excitabilidade cortical e determinar sua estabilidade - um atributo crítico de qualquer biomarcador confiável³⁶.

Assim, para prosseguir o uso de medidas de modulação da excitabilidade cortical como marcadores candidatos para avaliação neurobiológica e estabelecer sua confiabilidade para aplicação clínica, apresentamos um protocolo resultante de uma abordagem sistemática fundamentada nas melhores evidências disponíveis na área para minimizar o impacto potencial da heterogeneidade metodológica e garantir a medição precisa e reprodutível da excitabilidade do córtex motor e sua modulação^{37, 38}. Isso incluiu a implementação de protocolos apropriados de aquisição de EMG³⁴, o uso de sistemas de neuronavegação³⁹, a coleta de um número suficiente de MEPs²⁰, o emprego de IPI adequado²¹ e relatórios abrangentes de procedimentos de aquisição e métodos de processamento de sinal³⁴. Nossos resultados demonstraram melhor estabilidade de sinal quando comparados às melhores práticas existentes na literatura, contribuindo assim para o rigor metodológico necessário para o desenvolvimento de um biomarcador neurofisiológico robusto.

Protocol

Os procedimentos aqui descritos foram desenvolvidos para coletar os dados relatados por Seybert et ^al.37 e Faro Viana et ^al.38 Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito antes da participação, explicando o objetivo do estudo, procedimentos, riscos e seu direito de desistir a qualquer momento. O protocolo foi aprovado pelas Comissões de Ética do Centro Champalimaud e conduzido de acordo com a Declaração de Helsínquia. O uso deste protocolo em outros estudos ou locais deve ocorrer somente após a obtenção da aprovação dos Comitês de Ética locais relevantes e/ou outras autoridades competentes. Uma lista de verificação de segurança padronizada deve ser aplicada antes da EMT para minimizar o risco de efeitos colaterais indesejados, usando as diretrizes internacionais^40,41 como uma estrutura de referência que pode ser adaptada a ambientes de estudo específicos. O protocolo é projetado para ~ 1 h 15 min de duração (Figura 1).

1. Requisitos de configuração e preparação

1. Certifique-se de que dois técnicos estejam disponíveis para conduzir a sessão de maneira ideal, onde um aplicará os procedimentos do TMS e o outro fornecerá suporte em etapas adicionais.
2. Certifique-se de que o seguinte equipamento esteja disponível: um sistema de neuronavegação; uma cadeira confortável; um dispositivo EMG com os respectivos contatos e eletrodos; um estimulador TMS com uma bobina em forma de 8, que permite a entrada de iTBS, protocolos de pulso único e uma conexão com o sistema de neuronavegação e EMG. Certifique-se de que um ou dois computadores estejam disponíveis para permitir a observação simultânea do software EMG e do software de neuronavegação. Certifique-se de que o computador tenha um receptor de sinal Bluetooth para receber o sinal EMG.
3. Certifique-se de que os seguintes consumíveis estejam disponíveis: compressas de álcool e gaze; lixa de água para limpar a pele onde serão colocados os eletrodos de gel; uma touca de natação para o participante; e tampões de ouvido para o participante e os técnicos.
4. Inicie a preparação da configuração cerca de 30 minutos antes da chegada do participante, para configurar adequadamente o sistema de neuronavegação, a placa EMG e a máquina TMS, bem como o software necessário para a aquisição de dados fisiológicos.
5. Prepare o sistema EMG.
   1. Certifique-se de que a placa EMG esteja totalmente carregada - se aplicável - e prepare os respectivos contatos - um como referência (unipolar - a ser colocado no cotovelo esquerdo) e o outro no músculo alvo para registro (bipolar - a ser colocado no primeiro interósseo dorsal direito). Um cabo adicional é necessário para sincronizar a saída de pulso TMS com o sinal EMG, conectando o dispositivo TMS à placa EMG.
   2. Conecte os eletrodos de prata/cloreto de prata (Ag/AgCl) de grau médico nos contatos (serão necessários 3 eletrodos). Além disso, conecte um cabo da máquina TMS à placa EMG para emitir o sinal de disparo de cada pulso TMS.
   3. Para o dispositivo EMG interno, retire o Velcro em uma superfície estável. Conecte os contatos ao dispositivo EMG nos respectivos pontos de entrada.
   4. Em um dos monitores/computadores, abra o software BONSAI⁴² e o respectivo script de aquisição de dados EMG. Pressione o botão Iniciar , somente quando estiver pronto para aquisição de dados (Para obter mais detalhes, consulte Arquivo Suplementar 1, etapa 1).
6. Prepare o dispositivo TMS.
   1. Defina o protocolo de avaliação de excitabilidade no dispositivo TMS. Este é composto por 40 pulsos únicos, a 120% rMT, com um IPI aleatório de pelo menos 6 s para evitar efeitos de transferência de estímulos anteriores.
   2. Insira um protocolo iTBS seguindo os parâmetros de estimulação fornecidos a priori no dispositivo: trigêmeos de pulso de 50 Hz, 80% aMT, 5 Hz por 2 s ligado/8 s desligado, repetido 20 vezes, 600 pulsos no total.
   3. Anexe tiras de papel em todas as partes da tela da máquina TMS onde a saída máxima de estimulação (MSO - %) seja visível para que o técnico fique cego durante a avaliação de rMT e aMT (para obter mais detalhes, consulte o Arquivo Suplementar 1, etapa 2).
7. Prepare o sistema de neuronavegação ANT Neuro para TMS.
   1. Monte os componentes de hardware necessários. Isso inclui a câmera de rastreamento infravermelho, a faixa de cabeça do participante com marcadores reflexivos, uma ferramenta de ponteiro, uma placa de calibração (para a bobina TMS) e um rastreador de bobina (um dispositivo circular que se conecta à bobina para rastreamento posicional em tempo real).
   2. Coloque a câmera no tripé e coloque-a em uma posição tal que tenha uma linha de visão clara para todos os outros componentes de neuronavegação durante toda a sessão.
   3. Coloque o rastreador de calibração da bobina e a placa na bobina TMS.
   4. Abra o software do sistema de neuronavegação, insira o ID do participante e calibre os componentes de neuronavegação (para obter mais detalhes, consulte o Arquivo Suplementar 1, etapa 3).

2. Preparando o participante

1. Uma vez que o participante chegue, avaliar a segurança para aplicação da EMT por meio do uso de questionário e/ou entrevista estruturada com base nas diretrizes publicadas^40,41. Inclua itens referentes à história de distúrbios psiquiátricos e neurológicos, perda de consciência, deficiência auditiva, bem como a presença de implantes metálicos ou magnéticos, medicação em andamento e estado de gravidez. Prossiga com o protocolo somente se nenhuma preocupação de segurança for levantada.
2. Sente o participante em uma cadeira confortável, onde ambos os antebraços possam ser posicionados em uma posição de descanso. Certifique-se de que o participante esteja em um ângulo apropriado para que a bobina seja posicionada confortavelmente em sua cabeça.
3. Peça ao paciente que remova todos os óculos, grampos de cabelo ou alfinetes, bem como brincos ou outros dispositivos metálicos e/ou eletrônicos. Forneça tampões para os ouvidos e certifique-se de que estejam posicionados de maneira adequada e estável. Instrua o participante a permanecer acordado, silencioso e relaxado. Certifique-se de que o participante esteja sempre acordado para reduzir, tanto quanto possível, as flutuações no sinal fisiológico.
4. Para melhorar a qualidade da interface eletrodo-pele e melhorar a condutância do sinal elétrico, limpe a pele sobre o FDI esfregando suavemente a área com lixa de água seguida de um enxágue rápido com gaze embebida em álcool³⁵. Repita este procedimento sobre o cotovelo contralateral. Quando a pele estiver seca, coloque o eletrodo terra sobre o cotovelo para fornecer um ponto de referência de voltagem zero e o eletrodo de registro na mão contralateral sobre o FDI, com seu centro a aproximadamente 2,5 cm na direção do tendão muscular (ver Figura 2).
5. Coloque uma touca de natação na cabeça dos participantes para desenhar referências para a localização do local de estimulação da EMT:
   1. Coloque uma touca de natação na cabeça do participante com orientação ântero-posterior. Certifique-se de que a touca esteja alinhada com a linha da sobrancelha do participante na frente e na raiz da hélice das orelhas de cada lado. Coloque-o sobre o couro cabeludo, deixando as orelhas livres e descobertas.
   2. Desenhe a linha sagital medial, bem como a linha intertragus na tampa para obter o ponto de interceptação no vértice (Figura 3A, B).
   3. A partir do ponto de interceptação, medir 5 cm para a esquerda na linha intertragus e anteriormente na linha sagital, para definir 2 pontos adicionais (Figura 3C, D).
   4. Desenhe uma linha diagonal para conectar o ponto lateral ao ponto anterior medial (Figura 3E).
   5. Começando no ponto lateral, meça 2,5 cm no sentido ântero-medial na linha diagonal para marcar a estimativa inicial do hotspot motor (Figura 3F).
   6. Marque 4 pontos em um raio de 0,5 cm em torno dessa estimativa inicial, para fornecer pontos de teste adicionais para o ponto de acesso do motor. Marque a região considerada para o hotspot motor (linha vermelha) (Figura 3E, F).
6. Configure o sistema de neuronavegação para o participante.
   1. Coloque a faixa elástica na cabeça do participante, garantindo que a tira do marcador esteja voltada para a câmera e confortável, pois deve permanecer no lugar durante toda a sessão.
   2. Use o ponteiro para definir os principais pontos de referência anatômicos na cabeça do participante (násio, tragus esquerdo e direito e pontos de formato da cabeça), o que permitirá que o sistema alinhe e rastreie os alvos de estimulação em relação à anatomia da cabeça do participante (násio, tragus, pontos de referência do couro cabeludo e formato da cabeça), se estiver usando um espaço MNI padrão e outros aspectos da anatomia, incluindo anatomia cerebral, se estiver usando exames de ressonância magnética individualizados. Isso garante que o posicionamento da bobina seja preciso em relação à anatomia individual durante o procedimento TMS (para obter mais detalhes, consulte o Arquivo Suplementar 1, etapa 3).

3. Avaliação da fisiologia TMS-EMG

1. Comece a executar o script BONSAI⁴² para aquisição de dados EMG. Durante a gravação, monitore o participante quanto a sinais de contração facial, movimento dos membros, reposicionamento inadvertido da touca ou outros comportamentos que possam afetar a fisiologia do participante e a aquisição de dados fisiológicos.
2. Meça o ponto de acesso do motor.
   1. Coloque a bobina de EMT tangencialmente ao couro cabeludo do participante com a alça apontando posteriormente em um ângulo de 45° em relação à linha sagital mediana e seu centro sobre o local marcado na etapa 2.5 - esta posição será usada para todos os procedimentos de EMT.
   2. Aplique pulsos a 30% do MSO sobre a estimativa inicial do hotspot motor.
   3. Incremente a intensidade da estimulação em passos de 5-10% de MSO até que uma resposta motora consistente seja observada.
   4. Aplique pulsos únicos na estimativa inicial e em vários locais ao seu redor para determinar o local que resulta de forma mais consistente em MEPs de maior amplitude e, quando possível, onde a contração visível foi limitada ao FDI - este é o hotspot motor para o FDI (MH).
   5. No software do sistema de neuronavegação, selecione o pulso que determinou o MH para guiar a estimulação adicional.
3. Estabeleça o rMT.
   1. Use o sistema de neuronavegação para guiar a bobina para o MH encontrado na etapa 3.2 - o rMT é a % mínima de MSO necessária para obter MEPs de pelo menos 50 μV no FDI contralateral em pelo menos 5 de 10 pulsos únicos de TMS fornecidos aqui, separados aproximadamente por um intervalo interestímulo de 5 s.
   2. Começando na % MSO usada para definir o MH, reduza a intensidade em etapas de 2% até que menos de 5 em cada 10 pulsos únicos de TMS provoquem uma resposta de pelo menos 50 μV no FDI contralateral.
   3. Incremente o MSO em etapas de 1% até que pelo menos 5 em cada 10 pulsos únicos de TMS provoquem uma resposta de pelo menos 50 μV no FDI contralateral.
   4. Registre a % MSO para o rMT.
4. Determine a ativação muscular voluntária máxima.
   1. Instrua o paciente a produzir a ativação muscular voluntária máxima do primeiro músculo interósseo dorsal (FDI) por meio da produção da forma de um círculo, empurrando a unha indicadora contra a barriga do polegar com força máxima.
   2. Aproximadamente 2 s após o participante iniciar a contração muscular, registre o ponto de tempo correspondente pressionando a barra de espaço no computador executando o script BONSAI, pulando o aumento inicial da atividade e os picos resultantes do movimento do eletrodo.
   3. Repita o processo três vezes, com cada contração separada por um período de descanso de 1 minuto para evitar a fadiga e garantir a recuperação.
5. Estabeleça o aMT.
   1. Use o sistema de neuronavegação para guiar a bobina para o MH encontrado na etapa 3.2 - o aMT é a % MSO mínima que produz MEPs de pelo menos 200 μV amplitude pico a pico em pelo menos 5 de 10 pulsos únicos TMS fornecidos aqui, durante uma leve contração voluntária.
   2. Peça ao participante para manter uma contração submáxima, entre 10% a 20% da CIVM, usando o EMG para monitorar a contração em andamento e fornecer feedback em tempo real (para mais detalhes, consulte o Arquivo Suplementar 1, etapa 1).
   3. Começando na % de MSO para o rMT, diminua a intensidade em etapas de 2% até que MEPs de pelo menos 200 μV sejam produzidos em menos de 5 de 10 pulsos únicos de TMS.
   4. Incremente o MSO em etapas de 1% até que MEPs de pelo menos 200 μV sejam produzidos em pelo menos 5 de 10 pulsos únicos de TMS.
   5. Registre a % MSO para o aMT.
6. Defina a excitabilidade cortical basal.
   NOTA: Esta fase tem como objetivo estabelecer a amplitude do PEmáx basal do participante, servindo de referência para comparações posteriores.
   1. Use o sistema de neuronavegação para posicionar com precisão a bobina sobre o ponto de acesso do motor, conforme definido na etapa 3.2.
   2. Confirme se os eletrodos EMG de superfície estão posicionados corretamente sobre o músculo alvo (por exemplo, primeiro interósseo dorsal) e verifique a qualidade do sinal (ruído mínimo e MEPs claros)
   3. Carregue o protocolo de estimulação de pulso único no dispositivo TMS.
   4. Insira o rMT previamente definido e inicie o protocolo (parâmetros de estimulação descritos no passo 1.6.1).
   5. Avalie a excitabilidade cortical basal calculando a média das amplitudes pico a pico de 40 MEPs.
      NOTA: A amplitude pico a pico é definida como a diferença de tensão entre os pontos mínimo e máximo de cada forma de onda MEP individual. Para análises posteriores, as amplitudes da PEmáx podem ser normalizadas para valores basais para controlar a variabilidade interindividual, seguindo procedimentos descritos na literatura anterior³².
7. Aplique o protocolo de modulação de excitabilidade cortical .
   NOTA: Esta etapa envolve a entrega de um protocolo iTBS para modular a excitabilidade cortical.
   1. Carregue o protocolo iTBS no dispositivo TMS.
   2. Insira o aMT previamente definido e inicie o protocolo (parâmetros de estimulação descritos no passo 1.6.2).
   3. Imediatamente após o término do protocolo iTBS, inicie um cronômetro para monitorar os intervalos pós-estimulação.
8. Avalie a modulação da excitabilidade cortical.
   1. T0, ou seja, imediatamente após o término do protocolo de modulação da excitabilidade cortical, reaplicar o protocolo de estimulação de pulso único usando rMT de 120%, conforme descrito na etapa 3.6.
   2. Valide a precisão da neuronavegação colocando o ponteiro no násio e verificando o alinhamento no software do sistema de neuronavegação. Certifique-se de que o desvio espacial seja < 5 mm. Registre o valor.
   3. T10, T20 e T30, ou seja, 10, 20 e 30 min após o protocolo de modulação da excitabilidade cortical - repita o protocolo de estimulação de pulso único como na etapa 3.8.1. Revalidar a precisão da neuronavegação como na etapa 3.8.2.
   4. Após a conclusão do bloco de estimulação final, pare o script BONSAI. Finalize a sessão de neuronavegação no software. Um arquivo "bin." é gerado a partir da aquisição de dados de bonsai.
   5. Avalie a excitabilidade cortical nos pontos de tempo pós-modulação (T0, T10, T20 e T30) usando o mesmo procedimento da linha de base, ou seja, calculando a média das amplitudes pico a pico de 40 MEPs registrados em cada ponto de tempo. Isso permite a comparação das mudanças de excitabilidade em relação à linha de base após o protocolo de modulação.
   6. Cálculo da modulação da excitabilidade cortical: Quantificar a modulação da excitabilidade cortical induzida pelo protocolo de estimulação calculando o delta MEP (ΔMEP), definido como a diferença entre a amplitude média dos MEPs registrados em cada ponto de tempo pós-intervenção (T0, T10, T20, T30) e a amplitude média dos MEPs registrados no início do estudo, normalizada pela amplitude média dos MEPs registrados no início do estudo. Essa medida permite avaliar a magnitude e a duração das alterações de excitabilidade cortical induzidas pelo protocolo iTBS.
       
9. Questione o participante sobre qualquer desconforto e forneça meios de contato caso surja alguma necessidade ou dúvida após a sessão.

Results

Este protocolo foi projetado para fornecer uma avaliação confiável e reprodutível da excitabilidade corticoespinhal, mantendo-se generalizável em diferentes sistemas EMG e configurações de EMS. Optamos pelo procedimento convencional de busca de limiares por ser amplamente validado, reprodutível e comparável entre os estudos, embora reconheçamos que métodos alternativos também estão bem estabelecidos (por exemplo, métodos de busca de limiares baseados na estimativa de parâmetros por testes sequenciais) ^{43 , 44} . A coleta de um total de 40 estímulos TMS de pulso único garante que MEPs suficientes sejam registrados para uma estimativa confiável da amplitude do MEP, mesmo quando alguns pulsos não conseguem obter uma resposta²⁰. Os intervalos entre os pulsos são randomizados com um mínimo de 6 s para evitar efeitos de carry-over de estímulos anteriores²¹ e para tornar a sequência de pulso imprevisível, reduzindo a pré-ativação muscular antecipatória. O uso de uma intensidade de TMS de pulso único de 120% rMT é um padrão bem estabelecido que provoca MEPs mensuráveis enquanto captura mudanças de plasticidade induzidas por iTBS de forma consistente entre os participantes. O processamento EMG offline, incluindo filtragem, remoção de artefatos e monitoramento da atividade muscular de fundo, garante que os MEPs medidos reflitam a verdadeira excitabilidade corticoespinhal em vez de ruído e não sejam influenciados pela pré-ativação muscular (consulte o Arquivo Suplementar 1, etapa 4 para obter detalhes). Embora seja possível adquirir MEPs pós-iTBS por mais de 30 min usando este protocolo, optamos por encerrar a aquisição de dados em T30 pós-iTBS, o que é consistente com as evidências de que a plasticidade semelhante à LTP resultante deste protocolo ocorre predominantemente dentro desta janela³². No geral, o protocolo enfatiza a reprodutibilidade, confiabilidade e generalização conceitual, independentemente de dispositivos ou softwares específicos.

Todo o pessoal envolvido nas sessões de TMS deve ser treinado em protocolos de segurança institucionais para garantir o bem-estar do participante. Durante a sessão, se um participante relatar sintomas leves, como tontura, a sessão deve ser pausada, o participante deve receber água e/ou deitar com as pernas elevadas, se necessário. Uma enfermeira ou médico deve ser contatado conforme apropriado. Dores de cabeça podem ocorrer durante ou logo após a sessão. Os participantes devem ser informados de que isso é esperado e podem tomar analgésicos simples de venda livre, se necessário. Se as dores de cabeça persistirem, a equipe de pesquisa deve ser contatada. No caso raro de uma convulsão, a sessão deve ser interrompida imediatamente e os procedimentos de emergência devem ser iniciados de acordo com os protocolos institucionais.

Os dados de 47 voluntários saudáveis foram coletados usando o protocolo estruturado e padronizado aqui descrito. Essa metodologia, projetada para aumentar a confiabilidade das avaliações de excitabilidade cortical, de fato produziu resultados consistentes em duas avaliações realizadas com 6 semanas de intervalo³⁷. Uma modulação significativa da excitabilidade do córtex motor esquerdo, avaliada pela mudança pós-iTBS da amplitude dos MEPs (ΔMEP) foi observada em T0, T10 e T20 na primeira avaliação, enquanto o efeito em T30 não atingiu significância (T0: W = 259, p < 0,01, r = 0,42; T10: W = 320, p < 0,01, r = 0,51; T20: W = 291, p < 0,01, r = 0,46; T30: W = 190, p = 0,06, r = 0,32) e em todos os momentos 6 semanas depois (T0: W = 293, p < 0,01, r = 0,48; T10: W = 278, p < 0,01, r = 0,46; T20: W = 315, p < 0,01, r = 0,52; T30: W = 275, p < 0,01, r = 0,45), indicando modulação robusta da excitabilidade ao longo do tempo (Figura 4A). A estabilidade da modulação da excitabilidade em T0 foi ainda apoiada por um CCI de 0,67 (IC 95% = 0,31-0,85; p < 0,01), demonstrando confiabilidade teste-reteste moderada a boa nos momentos mais precoces após a iTBS (Figura 4B). No entanto, a confiabilidade temporal da excitabilidade cortical em T10, T20 e T30 não foi observada, sugerindo limitações da aplicação deste protocolo para avaliar fenômenos semelhantes à plasticidade em momentos posteriores. Além disso, os principais parâmetros neurofisiológicos, incluindo aMT, rMT e amplitude MEP basal, permaneceram estáveis durante todo o período do estudo, ressaltando ainda mais a consistência interna e a confiabilidade do procedimento do protocolo. Finalmente, a influência de potenciais fatores de confusão - incluindo lateralidade, ansiedade de estado, expectativa em relação aos efeitos da EMT, sexo e idade - foi sistematicamente avaliada. Não foram encontradas associações significativas entre essas variáveis e a modulação da excitabilidade cortical, apoiando a robustez dos efeitos observados e do protocolo em todas as características individuais, conforme relatado em Seybert et ^al.37.

Figura 1: Excitabilidade M1 esquerda e sua avaliação de modulação - visão geral do protocolo experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Posicionamento do eletrodo para registro EMG sobre o músculo Primeiro Interósseo Dorsal (FDI). (a) dedo indicador; (b) região do tendão; (c) Barriga muscular FDI; (d) polegar. O eletrodo ativo é colocado na barriga do FDI e o segundo eletrodo é posicionado cerca de 2,5 cm distalmente em direção ao tendão. O eletrodo de referência deve estar localizado no cotovelo oposto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Procedimento de marcação da tampa. (A, B) Identificação das linhas de referência anatômicas: a linha sagital medial e a linha intertragus e determinar o vértice; (C, D) A partir do vértice, dois pontos de referência são marcados medindo cm lateralmente ao longo da linha intertragus (esquerda) e 5 cm anteriormente ao longo da linha sagital; (E) Construção de uma linha diagonal conectando o ponto lateral ao ponto anterior. Ao longo da diagonal, um ponto é marcado 2,5 cm no sentido ântero-medial a partir do ponto lateral, representando a estimativa inicial do hotspot motor. Refinamento da estimativa do hotspot marcando quatro pontos adicionais dentro de um raio de 0,5 cm da estimativa inicial, criando um conjunto de locais de estimulação para determinação do limiar motor; (F) Estabelecimento do hotspot motor e respectiva marcação na tampa (linha vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Resultados representativos do estudo. (A) Modulação da excitabilidade do córtex motor esquerdo após iTBS, refletida por mudanças na amplitude MEP (ΔMEP) em T0, T10 e T20 durante a linha de base e sessão de acompanhamento; (B) Confiabilidade teste-reteste em T0 indicada por um coeficiente de correlação intraclasse (CCI) de 0,67 (IC 95%: 0,31-0,85; p < 0,01), apoiando consistência moderada a boa na modulação da excitabilidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Detalhes adicionais do protocolo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Aqui, apresentamos um protocolo abrangente e rigorosamente estruturado descrevendo uma metodologia para avaliar a excitabilidade cortical e a modulação da excitabilidade do M1 usando TMS combinado com EMG. Ele descreve, em detalhes, todas as etapas necessárias para a condução ideal da sessão experimental, incluindo a preparação da configuração experimental e calibração do sistema de neuronavegação, configuração do equipamento TMS e EMG e procedimentos padronizados para identificar o MH, rMT e aMT. Essas etapas preparatórias do protocolo são necessárias para a sequência final de etapas, incluindo avaliação inicial da excitabilidade cortical, neuromodulação por meio da aplicação de iTBS e reavaliação da excitabilidade cortical para quantificar a modulação resultante.

Um ponto forte dessa metodologia é seu alto grau de padronização e rigor, que aborda muitas das limitações encontradas em estudos anteriores. Trabalhos anteriores na área muitas vezes sofreram de inconsistência metodológica, descrição limitada de métodos e alta variabilidade intra e intersujeito³⁵. A variabilidade metodológica inclui o número de MEPs²⁰ coletados, IPI²¹ e métodos de filtragem EMG que podem ter comprometido a reprodutibilidade dos achados³⁴. O protocolo descrito aqui evita armadilhas metodológicas ao incorporar a neuronavegação para garantir o posicionamento preciso da bobina³⁹, usando procedimentos EMG validados³⁴ e adotando as melhores práticas estabelecidas para estimulação e aquisição de sinal⁴⁵. Embora a contribuição específica de cada um desses procedimentos não tenha sido quantificada, a aplicação coletiva desses elementos resultou em maior estabilidade e confiabilidade dos efeitos observados quando comparada com estudos anteriores 25,26,27,28,29,30.

Embora o rigor metodológico e a padronização sejam a base para medições confiáveis, os aspectos práticos da preparação dos participantes e do gerenciamento da sessão são algumas das etapas mais importantes do protocolo que influenciam a qualidade dos dados adquiridos. A limpeza adequada da pele para a colocação do eletrodo, garantindo que os eletrodos sejam colocados adjacentes e com segurança e confirmando que a faixa de neuronavegação se encaixa confortavelmente, mas com firmeza, são essenciais para minimizar a variabilidade de sessão para sessão. Ao longo da sessão, o monitoramento contínuo do estado do participante - incluindo estado de alerta, movimento da mão e estabilidade do eletrodo - é necessário para evitar artefatos e manter gravações de alta qualidade. Quando na presença de problemas na aquisição de dados de EMG-TMS, é importante solicitar ajustes no posicionamento da bobina ou nos parâmetros de estimulação. A verificação regular da qualidade do sinal EMG é essencial para resolver problemas técnicos comuns, como queda de sinal, desprendimento do eletrodo ou pequeno desvio de navegação. O reposicionamento sutil da bobina, garantindo um contato estável do eletrodo ou recalibrando o sistema de neuronavegação pode restaurar a qualidade do sinal e manter a consistência. Também é importante reconhecer que algumas flutuações no sinal ou na variabilidade relacionada ao participante podem ser inevitáveis, apesar dos melhores esforços. Nesses casos, em vez de comprometer a integridade dos dados, pode ser preferível pausar a sessão, repetir medições críticas ou até mesmo reagendar para garantir que resultados confiáveis e interpretáveis sejam obtidos.

Os resultados obtidos com esse protocolo mostraram que a excitabilidade cortical no M1 esquerdo foi significativamente modulada após a aplicação do iTBS. Essa modulação foi igualmente evidente 6 semanas depois, com a medida da modulação da excitabilidade revelando estabilidade dentro do indivíduo apenas quando foi avaliada imediatamente após o iTBS, sugerindo uma janela de estabilidade temporalmente específica. Notavelmente, os efeitos da excitabilidade não foram mantidos de forma consistente em pontos de tempo posteriores, uma limitação possivelmente impulsionada pelo aumento da variabilidade ao longo do tempo^25,27. Essa observação reforça a ideia de que o momento das medições de excitabilidade cortical é crítico, particularmente quando se considera seu papel potencial como biomarcador para fins diagnósticos ou preditivos. De fato, apesar do interesse de longa data em usar a excitabilidade do córtex motor e a modulação da excitabilidade do córtex (ΔMEP) como marcador clínico, sua aplicação tem sido limitada pela baixa confiabilidade e alta variabilidade. Enquanto alguns estudos relataram reprodutibilidade moderada, muitos outros encontraram a ΔMEP sem a estabilidade necessária para uso clínico^18,19. O protocolo atual confronta diretamente esse problema, fornecendo uma estrutura replicável para medir a excitabilidade com consistência. Uma metodologia robusta de TMS-EMG também fornece informações valiosas sobre os mecanismos neurobiológicos subjacentes na saúde e na doença, facilitando a avaliação confiável de fenômenos semelhantes à neuroplasticidade no córtex motor humano. Especificamente, acredita-se que o iTBS envolva processos semelhantes à potenciação de longo prazo, induzindo aumentos dependentes do receptor NMDA na eficácia sináptica, modulando interneurônios inibitórios e promovendo a desinibição cortical, que coletivamente aumentam as amplitudes do MEP pós-estimulação²⁴. Essa interpretação é consistente com evidências de modelos animais. Em roedores e primatas não humanos, a TBS demonstrou induzir a potencialização duradoura da excitabilidade corticoespinhal e da força sináptica, demonstrando mecanismos semelhantes à plasticidade homóloga entre as espécies¹². Assim, as mudanças observadas em MEPs após iTBS em humanos provavelmente refletem processos neurais relacionados à plasticidade com forte base translacional.

Além de avaliar protocolos neuromoduladores como o iTBS, a metodologia padronizada TMS-EMG detalhada aqui é promissora para diversas aplicações. Nos paradigmas de aprendizagem motora, alterações na excitabilidade corticoespinhal podem servir como biomarcadores para aquisição de habilidades e neuroplasticidade. Por exemplo, estudos mostraram que a aprendizagem visuomotora aumenta a excitabilidade corticoespinhal, refletindo adaptações neurais subjacentes⁴⁶. Na reabilitação do AVC, a avaliação da excitabilidade corticoespinhal pode informar estratégias terapêuticas, com o neurofeedback TMS usado para regular positivamente a excitabilidade no córtex motor afetado, potencialmente auxiliando na recuperação⁴⁷. Farmacologicamente, as avaliações de TMS-EMG podem detectar alterações induzidas por substâncias da excitabilidade cortical, fornecendo informações sobre seus efeitos no SNC⁴⁸. Além disso, diferenças relacionadas à idade na excitabilidade corticoespinhal foram documentadas, com adultos mais velhos frequentemente exibindo excitabilidade reduzida, o que pode influenciar o desempenho motor e o aprendizado⁴⁹. Ao estender a aplicação deste protocolo padronizado a essas áreas, os pesquisadores podem obter uma compreensão mais abrangente da dinâmica corticoespinhal em diferentes contextos e populações.

Assim, propomos que este protocolo oferece uma base valiosa para pesquisas futuras com o objetivo de estabelecer biomarcadores confiáveis de plasticidade cortical. Em particular, os estudos devem procurar replicar esses efeitos em populações maiores e mais diversas, incluindo grupos clínicos. Pesquisas futuras devem avaliar se a excitabilidade cortical medida imediatamente após a iTBS pode distinguir consistentemente entre perfis saudáveis e clínicos, para entender a sensibilidade diagnóstica, bem como as propriedades prognósticas, por exemplo, na previsão da resposta ao tratamento. Em conclusão, a metodologia aqui descrita representa um avanço significativo na padronização da avaliação da excitabilidade cortical. Ao mitigar fontes comuns de variabilidade e enfatizar a precisão no projeto experimental, este protocolo fornece uma abordagem robusta e reprodutível para estudar fenômenos semelhantes à plasticidade cortical e suas potenciais aplicações clínicas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software BONSAI para aquisição de dados fisiológicos ("MT_ACQ.bonsai" scipt)	Bonsai	https://bonsai-rx.org/
Eletromiografia (EMG) desenvolvida pela Plataforma de Desenvolvimento de Hardware Científico da Fundação Champalimaud	Pesquisa Champalimaud	https://www.cf-hw.org/home	Site da Plataforma de Desenvolvimento de Hardware e Software Científico: https://www.cf-hw.org/home
Estimulador MagPro X100 com uma bobina Cool-B65 em forma de oito	Magventure	Estimulador: 9016E0731;   bobina:9016E0491
Sistema de neuronavegação Visor2	ANT Neuro		Software e hardware da mesma empresa