Avaliação quantitativa da fagocitose de eritrócitos alogênicos e xenogênicos por macrófagos de ratos in vitro

Resumo

Este trabalho descreve um protocolo in vitro padronizado para quantificar e comparar as taxas de fagocitose de hemácias xenogênicas (humanas) e alogênicas (de ratos) por macrófagos isolados de ratos.

Resumo

O transplante de células xenogênicas geralmente enfrenta rejeição imunológica significativa, mesmo em modelos animais imunodeficientes. Entre os componentes imunológicos residuais, os macrófagos podem fagocitar ativamente células humanas transplantadas, representando um desafio para o enxerto de longo prazo. Para resolver isso, desenvolvemos um ensaio in vitro padronizado para quantificar a fagocitose mediada por macrófagos de glóbulos vermelhos (hemácias) humanos versus ratos. Os macrófagos peritoneais de ratos foram isolados, cultivados e expostos a hemácias humanas ou de ratos. As hemácias humanas foram identificadas usando CD235a, enquanto as hemácias de ratos foram pré-marcadas com DeepRed. A análise por citometria de fluxo foi realizada usando CD163 para identificar macrófagos e exclusão de iodo propídio (PI) para células vivas. Os resultados mostraram uma diferença substancial na atividade fagocítica: 5,08% dos macrófagos engolfaram hemácias humanas, enquanto apenas 1,59% fagocitaram hemácias de ratos, produzindo um índice relativo de fagocitose de 3,21. Este protocolo permite a avaliação quantitativa da compatibilidade imunológica e oferece um método reprodutível para avaliar as respostas imunes inatas no xenotransplante. Ele tem potencial para refinar a seleção doador-receptor e orientar estratégias imunossupressoras na pesquisa translacional.

Introdução

O uso de transplante de células xenogênicas, particularmente o enxerto de células humanas em modelos animais, é uma estratégia essencial na pesquisa biomédica¹. Permite a avaliação da sobrevivência celular, enxerto e respostas imunes em um ambiente in vivo controlado. Embora os modelos de camundongos tenham historicamente dominado esse campo devido à sua genética bem caracterizada e facilidade de manipulação, seu pequeno tamanho apresenta uma limitação significativa em estudos que exigem grandes volumes de sangue ou altos rendimentos de células. Em contraste, os ratos oferecem várias vantagens, incluindo maior massa corporal, maior relevância fisiológica para os sistemas humanos e maior rendimento de amostras biológicas, como sangue ou macrófagos peritoneais². Consequentemente, os modelos de ratos são cada vez mais utilizados em estudos envolvendo pesquisas hematopoiéticas e do sistema imunológico³.

Um dos principais desafios no transplante xenogênico é a rejeição imunológica. Mesmo em modelos imunodeficientes em que as células T, B ou NK são geneticamente ablacionadas, as células imunes inatas residuais, particularmente os macrófagos, permanecem funcionalmente ativas⁴. Os macrófagos servem como defensores de primeira linha do sistema imunológico do hospedeiro, reconhecendo e eliminando células estranhas por meio da fagocitose⁵. Este processo é parcialmente regulado pela interação entre a proteína reguladora de sinal alfa (SIRPα) em macrófagos e CD47, um sinal "não me coma" expresso na maioria dos tipos de células. Quando o CD47 de células humanas não é reconhecido pelo SIRPα de roedores, essa incompatibilidade pode resultar em fagocitose aumentada. Mesmo nesses animais imunodeficientes permissivos, esse fenômeno também existe ^6,7.

Quantificar a fagocitose mediada por macrófagos nesse contexto é fundamental para avaliar a probabilidade de sobrevivência celular e otimizar as estratégias de transplante⁸. Embora vários métodos in vivo e ex vivo tenham sido desenvolvidos para avaliar a rejeição imunológica, os ensaios in vitro padronizados para fagocitose de macrófagos permanecem limitados. Os métodos tradicionais baseados em microscopia costumam ser trabalhosos e carecem de rigor quantitativo. A citometria de fluxo, por outro lado, oferece um ensaio baseado em célula única e uma plataforma quantitativa capaz de distinguir com precisão os tipos de células e medir a captação fagocítica por meio da detecção de marcadores de superfície.

Neste artigo, desenvolvemos um ensaio in vitro padronizado para avaliar a fagocitose diferencial de hemácias humanas e de ratos por macrófagos peritoneais de ratos. As hemácias servem como um modelo ideal para ensaios de fagocitose devido à sua estrutura simples e expressão de CD47, que atua como um sinal "próprio" para inibir a depuração mediada por macrófagos⁹. Neste protocolo, os macrófagos peritoneais de ratos são colhidos por meio de lavagem peritoneal, cultivados in vitro e expostos a hemácias humanas ou hemácias alogênicas de ratos marcadas com DeepRed. Após a co-incubação, a citometria de fluxo é usada para avaliar a internalização das hemácias pelos macrófagos. Os macrófagos são identificados pela expressão de CD163, os eritrócitos humanos por CD235a e os eritrócitos de ratos por fluorescência DeepRed. As células mortas são excluídas por meio da coloração PI, garantindo que apenas macrófagos viáveis sejam analisados.

Essa abordagem permite uma avaliação precisa e quantitativa da atividade fagocítica alogênica e xenogênica das hemácias in vitro, fornecendo informações sobre a extensão da depuração imunológica mediada por macrófagos. Em nossos experimentos, macrófagos de ratos demonstraram fagocitose significativamente maior de hemácias humanas (5,08%) em comparação com hemácias de ratos (1,59%), produzindo um índice relativo de fagocitose de 3,21. Esses resultados ressaltam a importância dos mecanismos imunológicos inatos em ambientes xenogênicos e destacam o valor desse ensaio na validação do modelo pré-clínico.

Em conclusão, o protocolo aqui apresentado oferece um método reprodutível e eficiente para medir a fagocitose de macrófagos in vitro. É particularmente útil para pesquisadores que trabalham nas áreas de xenotransplante, pesquisa com células-tronco hematopoiéticas e testes de compatibilidade imunológica. Ao fornecer uma estrutura padronizada para quantificação de fagocitose, este ensaio pode contribuir para melhorar a reprodutibilidade experimental e melhorar a compreensão das respostas imunes inatas em modelos de transplante entre espécies.

Protocolo

Todos os experimentos envolvendo animais foram conduzidos de acordo com as políticas e procedimentos éticos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Jiangsu (UJS-IACUC) (Aprovação nº. UJS-IACUC-2021090102). Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Hospital Afiliado da Universidade de Jiangsu. Todas as amostras foram coletadas de pacientes que assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. O sobrenadante removido deve ser colocado em um tanque de resíduos de líquido dedicado e entregue ao departamento de doenças infecciosas do hospital.

1. Isolamento de macrófagos

1. Preparação: Prepare os materiais necessários, incluindo ratos experimentais, recipientes de anestesia, béqueres e isoflurano como anestésico, e pré-resfrie a centrífuga a 4 °C.
2. Anestesiologia e sacrifício dos ratos: Seguindo as diretrizes institucionais de cuidados com os animais, eutanasiar os ratos após inalar anestesia excessiva com isoflurano.
3. Desinfecção com álcool: Coloque o rato sacrificado em um béquer e adicione uma quantidade suficiente de etanol a 75% para cobrir totalmente o rato. Deixe de molho por 10 min.
4. Injeção e mistura de fluido abdominal: Desinfete o abdômen do rato e injete 50 mL de PBS estéril gelado na cavidade abdominal ao longo da linha média usando uma seringa.
   1. Agite suavemente o rato e massageie a parede abdominal com os dedos para garantir uma mistura completa do fluido na cavidade abdominal. Massageie por 2-3 minutos.
5. Coleta do líquido abdominal: Faça uma pequena incisão na parede abdominal do rato, incline ligeiramente o corpo e aspire o líquido abdominal com uma seringa.
6. Centrifugação: Centrifugar o líquido recolhido a 500 x g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
7. Lise de hemácias: Adicione 3-5 vezes o volume de pellets celulares do tampão de lise de hemácias e misture suavemente por 1-2 min.
   NOTA: Por exemplo, se o volume do pellet da célula for de 1 mL, adicione 3-5 mL de tampão de lise. Esta etapa pode ser realizada à temperatura ambiente ou a 4 °C, seguida de centrifugação a 400-500 x g por 5 min. A centrifugação a 4 °C é mais eficaz. Devido à pressão osmótica, as hemácias se lisarão e a solução ficará vermelha. Após centrifugação, remova o sobrenadante vermelho.
   1. Receita de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC): Dissolva 8,3 g de NH4Cl, 1,0 g de KHCO3 e 1,8 mL de EDTA a 5% em 800 mL de H₂O destilado e esterilize por filtro através de um filtro de 0,2 μm, qs a 1000 mL com H₂O destilado e ajuste o pH 7,2 ~ 7,4. Se o precipitado vermelho ainda estiver visível, repita esta etapa até que a solução se torne clara e transparente. Normalmente, uma pequena quantidade de hemácias residuais não afeta os ensaios subsequentes (se houver poucas hemácias no pellet, esta etapa pode ser omitida).
8. Lavagem de células: Lave as células duas vezes com aproximadamente 10 mL de meio RPMI 1640 pré-resfriado. Centrifugar a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C de cada vez e rejeitar o sobrenadante.
9. Ressuspensão e contagem celular: Ressuspenda as células em meio pré-resfriado consistindo de RPMI 1640 + 1% FBS + 1% PS, conte as células usando a coloração com azul de tripano e avalie a viabilidade celular.
10. Cultura celular: Se a cultura for necessária, semeie as células a uma densidade de 1 × 10⁶ / mL em uma placa de cultura de 24 poços, com 1 mL de meio RPMI 1640-10% FBS-1% PS por poço. Após 2 h de incubação, substitua o meio e lave os poços 1-2 vezes com meio RPMI 1640 para remover as células não aderentes.
    NOTA: As células aderentes formarão uma monocamada de macrófagos. Se for necessária a extração de RNA, adicione 1 mL de Trizol ao pellet celular, pipete várias vezes para romper as células e transfira a mistura para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para extração imediata de RNA ou armazene a -80 ° C. Para análise FACS, ajuste a contagem de células para 1 × 10⁶ por tubo, adicione 20 μL de tampão FACS e prossiga com a coloração FACS. Tampão FACS: DPBS + 2% FBS, esterilizar o filtro através de um filtro de 0,22 μm, armazenado a 4 °C).

2. Colheita de eritrócitos de rato ou humanos

1. Preparação: Pré-enxágue tubos de centrífuga de 15 mL e seringas de 10 mL com heparina.
2. Coleta de sangue do coração do rato: Depois de anestesiar e sacrificar o rato, corte cuidadosamente uma pequena seção da cauda do rato com uma tesoura e colete o sangue da veia da cauda.
3. Coleta de sangue humano: Colete sangue humano usando a técnica de punção venosa.
4. Mistura de amostras de sangue: Misture 1 mL de PBS com 1 mL de sangue venoso humano ou sangue de rato.
5. Separação do gradiente de densidade de Ficoll: Adicionar 1,5 mL de solução de Ficoll com densidade de 1,077 a um tubo de centrífuga de 15 mL para sangue periférico humano; adicionar 1,5 ml de solução de Ficoll com uma densidade de 1,084 a um tubo de centrifugação de 15 ml para sangue de rato.
6. Estratificação de amostras de sangue: Coloque lentamente as amostras de sangue diluídas ao longo da parede do tubo de centrífuga na solução de gradiente de densidade correspondente.
7. Centrifugação: Centrifugue a 400 x g por 30 min a uma temperatura de 18-20 °C.
8. Remoção das camadas de plasma e linfócitos: Remova a camada superior de plasma, a camada de linfócitos e a camada de solução de Ficoll, deixando apenas a camada inferior de glóbulos vermelhos.
9. Lavagem de glóbulos vermelhos: Lave as hemácias uma vez com 10 mL de PBS.
10. Centrifugação e remoção do sobrenadante: Centrifugue a 400 x g por 5 min e descarte o sobrenadante.
11. Ressuspensão e contagem de células: Adicione 1 mL de meio RPMI 1640 a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, misture com uma quantidade adequada de glóbulos vermelhos e realize a contagem de células.

3. Ensaio de fagocitose in vitro

1. Isolamento e cultura de macrófagos: Isole os macrófagos e semeie-os a uma densidade de 1 × 10⁶ células/poço em uma placa de cultura de 12 poços. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ durante 2 h para permitir a adesão das células.
2. Remoção de células não aderentes: Após 2 h de incubação, remova cuidadosamente as células não aderentes e lave suavemente com meio RPMI 1640.
3. Cultura continuada: Continue a cultivar os macrófagos aderentes por até 2 h para garantir a adesão completa ao fundo da placa de cultura.
4. Tratamento de fome: Após 2 h, substitua o meio por RPMI 1640 sem soro e incube em condições de fome por 2 h para aumentar a atividade fagocítica dos macrófagos.
5. Adição de células humanas: Adicione células humanas pré-coradas com DeepRed à placa de cultura e incube a 37 °C com 5% de CO₂ por 2 h para permitir que os macrófagos fagocitem as células humanas.
6. Conclusão e análise: Após o ensaio de fagocitose, observe a atividade fagocítica ao microscópio ou quantifique usando citometria de fluxo (FACS).

4. Citometria de fluxo

1. Preparação celular: Digerir as células com 0,05% de tripsina-EDTA e interromper a digestão usando o meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS. Centrifugue as células, descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em tampão FACS e conte-as. Prepare 1 × 10⁶ células por tubo em dois tubos. Além disso, prepare um tubo de hemácias humanas e um tubo de hemácias de rato.
2. Preparação do tubo de coloração única: Adicione o anticorpo CD163 anti-rato de camundongo a um tubo de amostra, o anticorpo CD235a anti-humano de camundongo ao tubo de glóbulos vermelhos humanos e o DeepRed ao tubo de glóbulos vermelhos de rato.
   1. Incube esses tubos no gelo, protegidos da luz, por 30 min, com mistura a cada 10 min. Adicione 1 mL de tampão FACS para lavar quaisquer anticorpos não ligados, centrifugue e descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células em 500 μL de tampão FACS.
3. Preparação da amostra: Adicione CD163 anti-rato de camundongo, anticorpos CD235a anti-humano de camundongo e DeepRed aos tubos de amostra. Incubar em gelo, protegido da luz, por 30 min, com mistura a cada 10 min. Adicione 1 mL de tampão FACS a cada tubo de amostra para lavar quaisquer anticorpos não ligados, centrifugue e remova o sobrenadante. Ressuspenda as células em 500 μL de tampão FACS.
4. Análise: Exclua a adesão celular por gating em FSC-H versus FSC-A. Use os tubos de coloração simples para ajustar as configurações apropriadas de tensão e compensação antes de analisar as amostras (Figura 1). Analise os dados usando o software FlowJo v10.8.1.
   NOTA: CD163-FITC e PI

Resultados

Por meio da análise por citometria de fluxo, podemos inferir a taxa de fagocitose de macrófagos de ratos em relação a hemácias humanas e hemácias de rato. As células mortas são primeiro excluídas usando PI. Macrófagos CD163-positivos que expressam CD235a-positivo indicam a fagocitose de hemácias humanas. A proporção de macrófagos que fagocitaram hRBCs é definida como a taxa de fagocitose de macrófagos de rato em relação às hemácias humanas. A proporção de fagocitose de hemácias de ratos ...

Discussão

Este estudo estabeleceu um ensaio in vitro robusto e reprodutível para avaliar a fagocitose mediada por macrófagos de hemácias xenógenas e alogênicas. Neste estudo, as hemácias humanas foram marcadas com CD235a-BV421, enquanto as hemácias de ratos foram coradas com o corante DeepRed. Quando os macrófagos fagocitam as hemácias marcadas, os anticorpos conjugados (CD235a-BV421) ou corante (DeepRed) são internalizados juntos. Como resultado, os próprios macrófagos exibem fluorescênc...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,05% Tripsina-EDTA	ThermoFisher	25300062
Rastreador de Células Vermelhas Profundas	ThermoFisher	C34565	O pó (15 & mu; g) foi dissolvido no DMSO (20 & mu; L)
Dimetil Sulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650
Soro Tamponado com Fosfato de Dulbecco (DPBS)	ThermoFisher	C10010500BT
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva	17144002
Ficoll-Paque PREMIUM	Cytiva	17544602
Anticorpo Anti-Humano CD235a BV421 do camundongo	BD em Biociências	562938
Anticorpo FITC do Anti-Rato de Camundongos CD163	BIO-RAD	MCA342F
Proteína K	Sigma	P2308
RPMI 1640	ThermoFisher	11875093