Procedimento simples e eficaz para hemostasia em artérias de camundongos

Resumo

Este estudo tem como objetivo desenvolver um método eficaz para alcançar a hemostasia nas artérias de camundongo.

Resumo

Durante a punção arterial ou canulação em camundongos, a ligadura permanente da artéria é frequentemente necessária devido à dificuldade para alcançar a hemostásia após a retirada da agulha. Isso leva a lesão isquêmica permanente na região do tecido irrigado. Essa isquemia localizada frequentemente induz complicações secundárias, comprometendo os resultados experimentais em modelos animais. O método atual visa selar o local da perfuração após o procedimento, mantendo o fluxo sanguíneo normal, prevenindo assim a isquemia pós-operatória. Esse método envolve a colheita de um fragmento de tecido adiposo do próprio animal experimental, a realização de punção arterial usando técnicas padrão e, em seguida, a envolvimento do local da perfuração com a almofada adiposa para alcançar a hemostasia mantendo o fluxo sanguíneo. Neste estudo, foi realizada punção bilateral da artéria carótida comum em camundongos, seguida de hemostasia usando uma técnica de enrolamento de gordura. A imagem de contraste a laser de speckles (LSCI) não revelou diferenças nas alterações do fluxo sanguíneo cerebral entre os grupos simulado e operado, e nenhuma alteração significativa foi observada nas medições pré-operatórias versus pós-operatórias do fluxo sanguíneo no grupo operado. A avaliação histológica realizada em 7, 14 e 28 dias após a cirurgia revelou que: (1) preservação da arquitetura cerebral (coloração H&E), (2) morfologia neuronal intacta sem alterações degenerativas (coloração de Nissl) e (3) ausência de alterações patológicas nas seções cerebrais. Essa técnica de hemostasia arterial aproveita a natureza flexível do tecido adiposo e os mecanismos fisiológicos de coagulação. O procedimento envolve: (1) enrolar gordura autóloga ao redor do local da perfuração, (2) fixá-la com pontos para garantir contato ótimo com a adventição arterial, e (3) permitir que o sangue que escapa permeie a interface grefa-artéria, onde passa por coagulação. Esse mecanismo de tripla ação alcança uma hemostasia confiável enquanto preserva a permeabilidade arterial e previne complicações isquêmicas após a cirurgia. O método demonstra notável simplicidade procedimental, eficácia clínica e excelente potencial translacional.

Introdução

Em modelos animais, a criação de lesão arterial é uma abordagem experimental amplamente utilizada para modelar diversas condições patológicas, incluindo modelos de isquemia e reperfusão cerebral, modelos de aterosclerose carotídea (CCA) ou aórtica (AO), e modelos de isquemia da medula espinhal.

Tomando como exemplo o modelo de isquemia e reperfusão cerebral (MCAO) de camundongos, a abordagem atual de modelagem^{padrão 1,2,3} envolve: isolar a artéria carótida externa (ECA), ligar sua extremidade distal, prender a ECA proximal com um clipe arterial enquanto se coloca um sudo de estaio, criar um orifício de perfuração entre esses pontos, inserir um filamento retrogradamente através da CCA, fixando o vaso e o filamento com a sutura de estaio, transectendo a ECA entre o local da punção e a ligadura distal, liberando o clipe arterial, redirecionando o filamento para a artéria carótida interna (ICA) para ocluir a artéria cerebral média e, após a retirada do filamento, ligando a ECA proximal.

Embora esse procedimento alcance reperfusão, ele apenas restaura o fluxo sanguíneo entre o comum e o ACI, deixando o ECA permanentemente desconectado. Essa transeção ECA causa danos isquêmicos nas regiões faciais ipsilaterais, uma lesão não intencional que não só complica o procedimento cirúrgico, mas também introduz traumas confundidores em animais experimentais, comprometendo potencialmente os resultados do estudo. Mais preocupante ainda, em alguns protocolos experimentais ^4,5, os pesquisadores realizam uma punção CCA direta, uma sutura é inserida para estabelecer o MCAO e, em seguida, removida imediatamente, seguida por uma ligadura permanente em ambas as extremidades do local da punção para hemostasia. No entanto, esse método aumenta diretamente a pressão vascular, elevando assim a pós-carga cardíaca e potencialmente levando à insuficiência cardíaca⁶.

Usando o modelo de lesão endotelial CCA ou AA do camundongo com dieta rica em gordura para estabelecer aterosclerose como exemplo, a metodologia^convencional 7,8,9,10 envolve a realização de punção arterial na ACC, aorta abdominal (AA) ou artéria femoral (CFA), a inserção de um cateter balão para induzir a denudação endotelial e a realização da hemostasia ligando permanentemente ambas as extremidades do local da punção. Essa abordagem padrão apresenta várias limitações críticas: a ligadura obrigatória cria isquemia localizada distal ao local da oclusão. Mais prejudicial ainda, ocorre acúmulo de lipídios nos locais de ligadura. A validade do modelo de compromisso é alterada pela afetação da hemodinâmica local, o que interfere na administração do medicamento para lesões-alvo e distorce os resultados da avaliação farmacológica.

No modelo de isquemia da medula espinhal murina, o procedimento envolve punção arterial (via acesso CCA, AA ou CFA) seguida da inserção de um cateter balão para induzir isquemia nos^{locais-alvo 11}. Após a retirada do balão, a hemostasia convencional é alcançada ligando permanentemente o local da perfuração bilateralmente.

Nos três modelos mencionados acima, a hemostasia pós-punção é alcançada uniformemente por meio da ligadura bilateral do local da percução. Embora eficaz para o controle do sangramento, essa abordagem inevitavelmente induz isquemia localizada, levando a complicações secundárias que, em última análise, comprometem a validade do modelo. A manutenção da permeabilidade vascular durante procedimentos hemostáticos é, portanto, fisiológica e experimentalmente crítica. Portanto, este artigo apresenta um método inovador, simples e eficaz de hemostásia arterial para experimentos com camundongos. O procedimento envolve primeiro a fixação das duas extremidades do local da perfuração com clipes vasculares arteriais, depois a envolvimento da artéria com uma almofada de gordura de 3 mm × 3 mm × 1 mm para cobrir a perfuração. A almofada de gordura é fixada no lugar com um ponto de ligadura ao redor da artéria. Os clipes arteriais são liberados gradualmente, e a rigidez da ligadura é ajustada com base no sangramento até que a hemostasia completa seja alcançada. Essa abordagem restaura o fluxo sanguíneo, mantém a hemodinâmica normal e previne danos isquêmicos aos tecidos ao redor causados pela ligadura permanente dos vasos. É particularmente vantajoso para a observação pós-modelagem de longo prazo de condições em camundongos e para avaliar intervenções farmacológicas, aumentando significativamente o rigor experimental dos estudos pré-clínicos.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos em estrita conformidade com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Aprovação do Protocolo nº SNLL25040501; Licença de Uso de Animais Nº SYXK(Liao)2021 - 0010) foi estabelecida pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Agrícola de Shenyang. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação experimental

1. Detalhes e documentação animal: Documente todos os dados de pesquisa animal seguindo as diretrizes ARRIVE (Pesquisa com Animais: Relato de Experimentos In Vivo). Use camundongos machos Balb/C de 6 a 8 semanas, pesando 22 g ± 4 g. Mantenha as condições de moradia em 24 ± 2 °C com 55% ± 5% de umidade relativa sob um ciclo de 12 horas de luz/escuro.
2. Preparação animal
   1. Anestesie os camundongos usando um vaporizador de isoflurano (seguindo protocolos institucionalmente aprovados). Induza anestesia com isoflurano a 4% e depois mantenha com isoflurano a 2%.
   2. Após a anestesia, depilar as regiões cervical e craniana e desinfetar a pele exposta com povidona-iodo, seguido de 75% de etanol para remover o resíduo.
   3. Coloque os camundongos em uma almofada térmica de 37 °C para todos os procedimentos experimentais subsequentes.
3. Medindo o fluxo sanguíneo cerebral de base em camundongos
   1. Posicione os ratos em posição prona. Faça uma incisão no couro cabeludo médio para expor os ossos parietales. Dissecar cuidadosamente e remover a camada fascial sobrejacente da superfície do crânio.
   2. Ajuste o sistema LSCI para escanear o osso parietal exposto do camundongo com ampliação 10x e registre os dados iniciais do fluxo sanguíneo cerebral.
4. Colhe a almofada adiposa e a realização da punção arterial
   1. Reposicione os camundongos em posição supina. Faça uma incisão cervical na linha média. Colhe um enxerto de tecido adiposo subcutâneo de 3 mm × 3 mm × 1 mm para uso posterior.
   2. Realize dissecação contundente da glândula submandibular, músculo esternohioideo e músculo esternocleidomastoideo. Expor ambos os CCA.
   3. Libere a CCA para expor a ICA e a ECA.
   4. Aplique a pinça vascular 1 na extremidade distal da CCA e coloque a pinça vascular 2 na extremidade proximal.
   5. Perfure o CCA entre as duas pinças usando uma agulha de 23 G.
5. Aplicando a almofada de gordura
   1. Após a remoção da agulha, enrole a CCA no local da perfuração com a superfície cortada (lado não serosa) da almofada adiposa.
   2. Coloque um ponto 4-0 sob a área enrolada com gordura; em seguida, amarre um único movimento suavemente sobre a superfície da gordura para aplicar pressão e garantir contato seguro entre a almofada de gordura e a parede do vaso; Por fim, ajuste a ligadura gradualmente para alcançar equilíbrio de pressão para a hemostasia.
   3. Eleve o CCA distal com um cotonete úmido. Solte a pinça vascular 1 e retire lentamente o swab para permitir o fluxo gradual de sangue em direção ao local da perfuração.
   4. Verifique o fluxo sanguíneo; se foi observado sangramento ativo, retirar o CCA distal com pinça vascular 1.
   5. Espere 1 minuto, depois solte lentamente a pinça vascular 1; Se ocorrer sangramento, reposicione a almofada adiposa ou aperte levemente o único movimento da ligadura para aumentar a pressão; Continue com esses ajustes até que a hemostasie completa seja alcançada.
   6. Eleve a CCA proximal com um cotonete umedecido. Solte a pinça vascular 2 e retire gradualmente o swab para permitir o fluxo sanguíneo controlado em direção ao local da perfuração.
   7. Se ocorrer sangramento, recuar a CCA distal com uma pinça vascular 2.
   8. Aperte levemente o único desvio da sutura para aumentar a pressão; espere 1 minuto, depois eleve o CCA proximal e libere a pinça vascular 2; Rolando lentamente o cotonete umedecido em direção ao local da perfuração.
   9. Se o sangramento persistir, repita os dois passos anteriores até atingir a hemostasia completa.
   10. Faça um movimento adicional com o ponto para formar um nó duplo sobre o inicial, fixando melhor a almofada adiposa à parede do vaso e alcançando a hemostasia por meio de pressões intravasculares e externas equilibradas.
   11. Confirme que as artérias carótidas comuns em ambos os lados da almofada adiposa estavam preenchidas e apresentam diâmetro consistente do vaso; Considere isso como restauração bem-sucedida do fluxo sanguíneo e hemostasia.
   12. Repita o mesmo procedimento para realizar a hemostasia por punção na artéria carótida comum contralateral.
   13. Expor as artérias carótidas comuns bilaterais em camundongos simulados sem realizar punção arterial ou enrolamento de almofada adiposa, mantendo todos os outros procedimentos idênticos ao grupo operado.
   14. Suture a incisão cirúrgica cervical e aplique um antisséptico.
6. Realização da avaliação do fluxo sanguíneo cerebral pós-operatório
   1. Após a conclusão da hemostase bilateral por punção CCA nos camundongos, ajusta o sistema LSCI para escanear o osso parietal exposto e adquirir imagens ampliadas 10x; Depois, registre as mudanças no fluxo sanguíneo cerebral.
   2. Suture a incisão no couro cabeludo e aplique antisséptico, permitindo que os camundongos se recuperem em uma bolsa térmica de 37 °C antes de devolvê-los à gaiola para cuidados contínuos.
7. Realização de monitoramento pós-operatório e coleta de tecidos
   1. Monitore e registre diariamente o status de sobrevivência, a atividade motora e quaisquer sinais de sangramento na região cervicomandibular dos camundongos durante o período pós-operatório.
   2. Nos dias pós-operatórios 7, 14 e 28, eutanasie os camundongos com dióxido de carbono (seguindo os protocolos institucionalmente aprovados) e fixe os tecidos cerebrais com 4% de paraformaldeído.

2. Exame patológico

1. Após fixação de 24 horas, desidrate os tecidos cerebrais através de um gradiente de etanol, limpe com xileno e insome em parafina para secção.
2. Realize a coloração H&E em seções do hipocampo e examine a morfologia do tecido cerebral ao microscópio.
3. Realize a coloração de Nissl em seções do hipocampo e examine a arquitetura neuronal ao microscópio.

Resultados

A análise dos dados de imagem de contraste de speckle a laser pré e pós-operatória e as medições de perfusão relativa tanto nos grupos simulados quanto operados não revelaram alterações significativas, demonstrando que essa técnica de hemostasia arterial selou com sucesso o local comum de punção da artéria carótida sem comprometer o fluxo sanguíneo cerebral (Figura 1).

Os camundongos do grupo operado foram monitorados continuament...

Discussão

Nos modelos MCAO, preservar a ECA recapitula melhor a patologia clínica ao prevenir danos isquêmicos faciais associados à ligadura e transseção da ECA. Embora a abordagem convencional de inserção de filamento via perfuração CCA ofereça simplicidade técnica, ela exige a ligação bilateral do local da punção, resultando em perfusão cerebral que depende da circulação colateral do Círculo de Willis, uma representação subótima da verdadeira fisiopatologia do AVC. A técnica de hemostas...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4-0 com agulha de costura de linha	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd
Mouse Balb/C	Beijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd		6-8w, macho
Forno de Aquecimento e Secagem Série DHG	Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd	DHG-9123A
Hematoxilina e Eosina (H&; E) Kit de Coloração em Alta Definição	Servicebio	G1076-500ML
Isoflurano	Shenzhen Ruiwode Life Technology Co., Ltd	R510-22
Analisador de speckles a laser	Shenzhen Ruiwode Life Technology Co., Ltd	RFLSI ZW
Solução de corante Nissl	Servicebio	G1036-100ML
Máquina de incorporação organizacional	Leica	HistoCore Arcadia H
Sistema de imagem por varredura de lâminas	Shenzhen Shengqiang Technology Co., Ltd	SQS-40R
Máquina de anestesia para pequenos animais	Shenzhen Ruiwode Life Technology Co., Ltd	R500
Desidratador de tecidos	Leica	Pérola HistoCore
Sistema de Água Ultrapura	Termodinâmica	50132370
Microtomo Semiautomático Ultra-Fino	Leica	HistoCore MULTICUT