Neste estudo, apresentamos um ensaio celular in vitro para identificação de produtos químicos teratogênicos. A dinâmica da sinalização do fator de crescimento de fibroblastos (FGF)/fator de resposta sérica (SRF) foi medida em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPS), e o risco de teratogenicidade foi avaliado quantificando a interrupção química dessa via de sinalização.
Artigo de método
Ensaio de toxicidade no desenvolvimento baseado no monitoramento em tempo real da interrupção do sinal do fator de crescimento de fibroblastos em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A toxicidade para o desenvolvimento (Devtox) é tipicamente avaliada em modelos animais. No entanto, existem desafios para garantir a precisão, como falsos negativos devido a diferenças entre espécies e preocupações éticas em relação ao bem-estar animal. Portanto, há uma necessidade de novos sistemas de teste para avaliar o Devtox humano e ajudar a resolver esses problemas. Nossa hipótese é que os teratógenos interrompem as vias de sinalização relacionadas ao Devtox essenciais para a morfogênese, independentemente de seus alvos moleculares. Para testar essa hipótese, desenvolvemos um sistema repórter de fator de crescimento de fibroblastos (FGF) usando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPS). Este sistema permite a quantificação da interrupção do sinal causada por produtos químicos, alcançando uma taxa de precisão de 83% para compostos teratogênicos e não teratogênicos conhecidos. Como a atividade de sinalização Devtox muda com o tempo, é importante capturar sua dinâmica continuamente, em vez de medir em um único endpoint. O uso de um sistema de medição de luminescência em tempo real é opcional, mas melhora a resolução temporal com menos trabalho. Todo o teste pode ser concluído em 1 semana, desde a semeadura das células em uma placa de cultura até a aquisição de dados de luminescência.
Introdução
Alguns produtos químicos causam toxicidade no desenvolvimento (Devtox), incluindo atrasos no crescimento, malformações, déficits funcionais e morte1. Avaliar o Devtox é essencial para garantir a segurança de produtos farmacêuticos e pesticidas2. Os ensaios Devtox atuais geralmente dependem de vários modelos animais. No entanto, devido às diferenças entre espécies, os modelos animais têm limitações inerentes ao extrapolar os resultados para humanos3. A talidomida, um conhecido tóxico para o desenvolvimento, foi prescrita pela primeira vez para mulheres grávidas no final dos anos 1950 para aliviar os enjoos matinais. Embora a teratogenicidade não tenha sido observada em roedores, malformações graves nos membros em recém-nascidos humanos foram relatadas em todo o mundo. Essa tragédia destacou as limitações dos testes de segurança em animais e levou a esforços internacionais para introduzir e revisar as diretrizes de teste Devtox4. Além disso, existem preocupações relacionadas ao bem-estar animal, bem como ao tempo e custo substanciais necessários para testes em animais. Portanto, são necessários ensaios in vitro alternativos que possam prever com precisão o Devtox humano5.
Aqui, propomos um ensaio in vitro para avaliar tóxicos de desenvolvimento com base na interrupção das vias de sinalização que são críticas para o desenvolvimento embrionário 6,7,8. O ensaio é realizado usando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) geneticamente modificadas para expressar NanoLuc luciferase (Nluc), um gene repórter luminescente, sob o controle do elemento de resposta sérica (SRE). O SRE é o local de ligação para o fator de resposta sérica (SRF), um fator de transcrição na via de sinalização do fator de crescimento de fibroblastos (FGF). A SRF integra sinais de múltiplos ligantes e regula a expressão de mais de 200 genes que desempenham papéis essenciais em diversos processos biológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário9.
Neste ensaio, as células repórter foram expostas a um produto químico em teste e estimuladas com FGF para ativar a sinalização e amplificar qualquer interferência do produto químico. Uma característica fundamental deste ensaio é capturar a dinâmica da atividade de sinalização à medida que a intensidade da luminescência muda. Como a atividade de sinalização varia ao longo do tempo, as medições de endpoint em um único ponto de tempo podem ser imprecisas10. De fato, as medições em sete pontos de tempo durante um período de 24 horas demonstraram maior precisão preditiva, com um valor de área sob a curva (AUC) de 0,837.
Os produtos químicos em estudo podem ser aplicados em uma ampla gama de concentrações, de 0,01 ng/mL a 1000 μg/mL, dependendo da citotoxicidade e solubilidade. Aproximadamente 1,4 × 104 células são necessárias para semear uma única placa de 96 poços. Uma limitação deste ensaio é que os produtos químicos teratogênicos podem não ser detectáveis se agirem por meio de alvos não expressos em células iPS humanas indiferenciadas. Além disso, este ensaio pode não capturar metabólitos teratogênicos. Além disso, não fornece informações sobre os mecanismos detalhados subjacentes à toxicidade teratogênica ou seus resultados específicos.
O uso de um sistema de monitoramento de luminescência em tempo real melhora ainda mais a resolução do tempo, reduz a mão de obra necessária para medições contínuas e minimiza os artefatos do manuseio repetido de placas de cultura. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o ensaio Devtox baseado em interrupção de sinal. Todo o procedimento pode ser concluído em uma semana. Essa abordagem pode ser automatizada, tornando-a adequada para triagem química e contribuindo para uma redução nos testes em animais.
Protocolo
Células iPS humanas (201B7) foram usadas neste estudo, com o gene Nluc sob o controle de um elemento de resposta sérica (SRE) colocado no locus Adeno-Associated Virus Integration Site 1 (AAVS1) usando o sistema CRISPR-Cas9 (Figura 1A). Os detalhes da edição de genes para células repórter (células iPS humanas knocked-in SRE-Nluc) foram relatados em outro lugar6. O protocolo é dividido principalmente em três etapas: 1) um ensaio de citotoxicidade de um produto químico para determinar sua concentração máxima de exposição, 2) teste de interrupção de sinal e 3) análise de dados.
Para minimizar a influência da evaporação do meio, realize todos os experimentos de cultura de células usando os 60 poços centrais de uma placa de 96 poços e adicione água aos poços mais externos e aos espaços entre poços. Cubra a placa com uma película de vedação permeável a gás durante a incubação para reduzir ainda mais a evaporação.
1. Preparação celular
- Células repórter de cultura por pelo menos 2 semanas após o descongelamento do estoque congelado. Mantenha as células em um cronograma de repetição de 7 dias e use células do dia 7 para o ensaio. Otimize a densidade de semeadura para ~ 80% de confluência no dia da passagem.
- Semeie células únicas a 2,0 × 105 células/poço em uma placa de seis poços revestida com ECM com 2 mL de meio de manutenção fresco suplementado com inibidor de ROCK de 10 μM.
- Após 24 h, substitua o meio por 2 mL / poço de meio de manutenção fresco.
- Em 72 h, coletar células usando um reagente de dissociação à base de enzimas para obter uma suspensão de célula única. Semear a 1,0 × 105 células/poço em uma placa de seis poços revestida com ECM com 2 mL de meio de manutenção fresco suplementado com inibidor de ROCK de 10 μM.
- Após 24 h, substitua o meio por 4 mL / poço de meio de manutenção fresco.
- Após 96 h, coletar células como uma suspensão unicelular usando um reagente de dissociação à base de enzimas. Use essas células para o ensaio repórter.
2. Ensaio de citotoxicidade
- Ensaio preliminar
- Semeie células únicas a 2,0 × 104 células/poço em uma placa de 96 poços revestida com ECM com 200 μL de meio de manutenção fresco suplementado com inibidor de ROCK de 10 μM. Sele a placa com um filme permeável a gás.
- Em 24 h, substitua o meio por 200 μL / poço de meio de manutenção fresco e feche novamente a placa com um filme permeável a gás.
- A 72 h, substitua o meio por 100 μL/poço de meio de ensaio e feche novamente a placa com um filme permeável a gás.
- A 96 h, substitua o meio por 100 μL / poço de meio de ensaio.
NOTA: Se 100% de confluência não for alcançada, interrompa o ensaio. Como a taxa de crescimento pode variar de acordo com a linhagem celular, otimize a densidade de semeadura para garantir a confluência total no dia do ensaio. - Dissolver o produto químico em estudo no meio de ensaio até à sua solubilidade máxima.
NOTA: Quando o dimetilsulfóxido (DMSO) é usado como solvente, a concentração final de DMSO não deve exceder 0.1%. - Preparar uma diluição em série de cinco pontos e cinco vezes do produto químico em estudo em meio de ensaio, utilizando a solução do passo 2.1.5.
- Adicione 11 μL / poço das soluções químicas da Etapa 2.1.6. Para o controle do veículo, adicione 11 μL/poço de meio de ensaio contendo a mesma concentração de DMSO.
- Após 48 h, incubar as placas a 25 °C durante 30 min.
- Adicione 111 μL / poço de reagente de ensaio de viabilidade de célula luminescente pré-balanceado baseado em ATP a 25 ° C. Para o branco, preparar um alvéolo contendo 111 μL de meio de ensaio e 111 μl do reagente.
- Agite a placa a 300 rpm por 2 min usando um agitador de microplacas.
- Transfira 200 μL da mistura para uma placa preta para medição de luminescência. Incubar as placas a 25 °C durante 10 min.
- Meça a intensidade da luminescência para estimar a contagem de células.
- Calcule a viabilidade celular usando a seguinte fórmula:
Viabilidade celular (%) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100
NOTA: Determine as etapas subsequentes com base na viabilidade celular. Se a viabilidade for >50% em todas as concentrações testadas, prossiga para a Etapa 2.2 com a concentração máxima de solubilidade. Se a viabilidade ultrapassar 50% dentro do intervalo de ensaio, proceder ao ensaio de determinação utilizando a concentração mais elevada com viabilidade >50%. Se a viabilidade for <50% em todas as concentrações, repetir o ensaio preliminar a partir de uma concentração mais baixa.
- Teste de determinação
- Semeie células únicas a 2,0 × 104 células/poço em uma placa de 96 poços revestida com ECM com 200 μL de meio de manutenção fresco suplementado com inibidor de ROCK de 10 μM. Sele a placa com um filme permeável a gás.
- Em 24 h, substitua o meio por 200 μL / poço de meio de manutenção fresco e feche novamente a placa com um filme permeável a gás.
- A 72 h, substitua o meio por 100 μL/poço de meio de ensaio e feche novamente a placa com um filme permeável a gás.
- A 96 h, substitua o meio por 100 μL / poço de meio de ensaio.
NOTA: Se 100% de confluência não for alcançada, interrompa o ensaio. Otimize a densidade de semeadura para garantir a confluência total no dia 4. - Dissolver o produto químico em estudo no meio de ensaio de acordo com os resultados do ensaio preliminar (etapa 2.1).
- Preparar uma diluição seriada de nove pontos e duas vezes do produto químico em estudo em meio de ensaio, utilizando a solução do passo 2.2.5.
- Adicionar 11 μL/alvéolo das soluções químicas do Passo 2.2.6. Para o controle do veículo, adicione 11 μL/poço de meio de ensaio contendo a mesma concentração de DMSO.
- Após 48 h, incubar as placas a 25 °C durante 30 min.
- Adicione 111 μL / poço de reagente de ensaio de viabilidade de célula luminescente pré-balanceado baseado em ATP a 25 ° C. Para o branco, preparar um alvéolo contendo 111 μL de meio de ensaio e 111 μl do reagente.
- Agite a placa a 300 rpm por 2 min usando um agitador de microplacas.
- Transfira 200 μL da mistura para uma placa preta para medição de luminescência. Incubar as placas a 25 °C durante 10 min.
- Meça a intensidade da luminescência para estimar a contagem de células.
- Calcule a viabilidade celular usando a seguinte fórmula:
Viabilidade celular (%) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100 - Gere uma curva dose-resposta usando dados de nove concentrações e calcule o IC50 a partir da curva.
3. Ensaio repórter em tempo real (Figura 1B)
- Semeie células únicas a 2,0 × 104 células/poço em uma placa de 96 poços revestida com ECM com 200 μL de meio de manutenção fresco suplementado com inibidor de ROCK de 10 μM. Sele a placa com um filme permeável a gás.
- Em 24 h, substitua o meio por 200 μL / poço de meio de manutenção fresco e feche novamente a placa com um filme permeável a gás.
- A 72 h, substitua o meio por 100 μL/poço de meio de ensaio e feche novamente a placa com um filme permeável a gás.
- A 96 h, substitua o meio por 100 μL / poço de meio de ensaio contendo 1% de substrato luminescente.
NOTA: Se 100% de confluência não for alcançada, interrompa o ensaio. Como a taxa de crescimento pode variar de acordo com a linhagem celular, otimize a densidade de semeadura para garantir a confluência total no dia 4. - Dissolver o produto químico em estudo no meio de ensaio na concentração determinada no ponto 2.
- Preparar uma diluição seriada de oito pontos e duas vezes do produto químico em estudo em meio de ensaio, a partir da solução preparada na etapa 3.5.
- Duas horas após a troca do meio na Etapa 3.4, adicione 11 μL / alvéolo das soluções químicas da Etapa 3.6. Para o controle do veículo, adicione 11 μL/poço de meio de ensaio contendo a mesma concentração de DMSO.
- Uma hora após o início da exposição química (Etapa 3.7), adicione 12 μL / poço de meio de ensaio contendo bFGF a uma concentração final de 2 ng / mL.
- Meça a luminescência continuamente por 48 h usando um sistema de medição de luminescência em tempo real sob uma atmosfera umidificada, 5% de CO2 a 37 °C.
NOTA: Defina o tempo 0 no ponto de adição do FGF (consulte a Figura 1B).
4. Análise dos dados (Figura 1C)
- Calcule a mudança de log2 vezes (LogFC) da intensidade de luminescência normalizando o grupo de teste para o controle do veículo:
LogFC = log2(Luc_sample / Luc_vehicle) - Integre o LogFC ao longo da série temporal de 48 horas para estimar a área entre as curvas (ABC) para os grupos de teste e controle do veículo.
- Soma dos valores ABC em todas as concentrações para quantificar a extensão global da perturbação do sinal causada pelo produto químico em estudo.
- Execute a análise da curva ROC (característica de operação do receptor) para determinar o limite para a classificação Devtox.
Resultados
Em nossa experiência, a morfologia celular é útil para determinar se um ensaio foi realizado corretamente. A Figura 2A mostra imagens típicas de microscopia confocal de células imediatamente antes e depois da exposição química. No final do ensaio, quase toda a superfície dos poços é coberta por células. A Figura 2B mostra imagens de coloração de células vivas/mortas. O número de células mortas coradas com iodeto de propídio (PI) aumenta após a exposição química; no entanto, a viabilidade celular é de pelo menos 50%, e quase todas as células são coradas com calceína-AM.
O quadro 1 enumera os produtos químicos utilizados nos nossos estudos anteriores 7,8. Esses estudos demonstram que os produtos químicos Devtox podem ser distinguidos com maior precisão com base na interrupção do sinal FGF em células iPS humanas. Uma descoberta importante é que o monitoramento contínuo da atividade de sinalização é fundamental porque muda dinamicamente ao longo do tempo. O uso de um sistema de medição de luminescência em tempo real fornece resolução de tempo consideravelmente maior com menos trabalho de medição. Aqui, descrevemos um protocolo que usa um sistema de monitoramento em tempo real.
A figura 3A mostra as alterações na intensidade de luminescência ao longo de 48 h em seis poços replicados nas mesmas condições sem o produto químico em estudo. As seis curvas estão quase alinhadas, indicando boa reprodutibilidade poço a poço. Embora não sejam claramente identificados em medições manuais de 24 horas em nossos estudos anteriores, dois picos distintos - um pico inicial imediatamente após a adição do ligante FGF e um segundo pico em aproximadamente 24 horas - aparecem em medições em tempo real de 48 horas. A Figura 3B mostra mudanças na intensidade da luminescência após a exposição ao ácido valpróico (VPA), um tóxico de desenvolvimento bem conhecido. O VPA é um inibidor da histona desacetilase que causa defeitos no tubo neural, coração e membros¹¹. O VPA interrompe a sinalização do FGF de maneira dependente da concentração. O sistema automatizado de medição em tempo real capturou a dinâmica do sinal com mais precisão do que as medições manuais.
Figura 1: Ensaio de interrupção de sinal FGF/SRF. (A) Engenharia genética de células iPS humanas para gerar células repórter de sinal FGF / SRF. Um plasmídeo foi construído contendo Nluc a jusante do elemento de resposta sérica, braços homólogos para knock-in direcionado e o gene de resistência à puromicina sob o controle do promotor da fosfoglicerato quinase humana. Após a seleção de puromicina, células repórter SRE-Nluc foram estabelecidas. (B) Cronograma do ensaio. As células repórter foram semeadas em uma placa de 96 poços e cultivadas por 4 dias para cobrir toda a superfície. O substrato luminescente e o produto químico em estudo foram adicionados 3 e 1 h antes do início da medição, respetivamente. O tempo de adição do ligante FGF foi definido como 0 h e a intensidade de luminescência foi medida continuamente nas 48 h seguintes. (C) Análise de dados. A dinâmica do sinal foi registrada em células expostas e não expostas a produtos químicos em teste e normalizadas para o controle do veículo para estimar a área entre as curvas como o grau de interrupção do sinal causada por um produto químico. Os valores de ABC foram obtidos para cada produto químico em diferentes concentrações e sua soma foi calculada. A análise da curva característica de operação do receptor foi realizada usando todos os tóxicos de desenvolvimento conhecidos testados para determinar o limiar. Abreviaturas: iPS = células-tronco pluripotentes induzidas; RLU = Unidade de Luz Relativa; AUC = Área sob a curva; FGF = fator de crescimento de fibroblastos; SRF = fator de resposta sérica; SRE = elemento de resposta sérica; HA = braço homólogo; L = esquerda; R = direita; PuroR = gene de resistência à puromicina; hPGK = fosfoglicerato quinase humano; Nluc = NanoLuc luciferase; ROC = característica de funcionamento do receptor; ABC = área entre as curvas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Morfologia celular e coloração de células vivas / mortas. A) Imagens microscópicas confocais das células antes (dia 4) e depois (dia 6) da exposição a um produto químico em estudo. As células restantes cobrindo quase toda a superfície dos poços após o teste são um indicador de um teste bem-sucedido. A cobertura quase completa do poço no final do ensaio indica uma execução bem-sucedida. B) Coloração de células vivas/mortas antes e depois da exposição a um produto químico em estudo. As células vivas foram coradas de verde com Calceína-AM, e as células mortas foram coradas de vermelho com iodeto de propídio (PI). foram corados com calceína-AM (verde) e células mortas com iodeto de propídio (PI, vermelho). A proporção de células mortas deve ser menor do que deveria ser < 50% do total de células. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplos típicos de dinâmica de intensidade de luminescência. (A) A luminescência do curso do tempo altera o curso do tempo da luminescência após a estimulação do ligante FGF, medido usando um sistema de medição de luminescência em tempo real. A intensidade da luminescência foi monitorada a cada 22 min por 48 h. As seis linhas coloridas representam sinais de diferentes poços. (B) Comparação de medições de luminescência manuais e em tempo real com ácido valpróico. A interrupção do sinal foi observada com ambos os métodos de medição, enquanto o monitoramento em tempo real capturou mais claramente o sinal aprimorado no segundo pico. Abreviaturas: RLU = Unidade de Luz Relativa; VPA = ácido valpróico; FGF = fator de crescimento de fibroblastos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Clique aqui para baixar esta tabela.
| Produto químico em estudo | Abreviação | Cas NÃO. | Estudo em animais (estudo anterior) | Estudo in vitro (este estudo) | Soma dos valores ABC | Concentração Máxima (μg/mL) |
| ácido totalmente trans-retinóico | ATRA | 302-79-4 | P | P | 65.9 | 0.0100 |
| Hidroxiuréia | HU | 127-07-1 | P | P | 63.3 | 149 |
| Ácido metoxiacético | MAA | 625-45-6 | P | P | 225 | 683 |
| Cloreto de metilmercúrio | MeHg | 115-09-3 | P | P | 77.7 | 1.20 |
| Hidrato de metotrexato | MTX | 133073-73-1 | P | P | 80.5 | 5.00 |
| Salicilato de sódio | SA | 54-21-7 | P | P | 38.7 | 666 |
| ácido valpróico | VPA | 99-66-1 | P | P | 63.3 | 100 |
| 6-Aminonicotinamida | 6-AN | 329-89-5 | P | N | 24.9 | 1.00 |
| Ácido bórico | BA | 10043-35-3 | P | N | 24.2 | 250 |
| 5-Bromo-2'-desoxiuridina | BrdU | 59-14-3 | P | P | 83.9 | 50.0 |
| 5,5-Dimetil-2,4-oxazolidinediona | DMO | 695-53-4 | P | P | 50.3 | 840 |
| Cloreto de lítio | LiCl | 7447-41-8 | P | N | 29.8 | 250 |
| 5-Fluorouracil | 5-FU | 51-21-8 | P | P | 92.4 | 2.65 |
| Ciclofosfamida monohidratada | CPA | 6055-19-2 | P | N | 19.1 | 400 |
| Mesilato de imatinibe | IMA | 220127-57-1 | P | P | 42.4 | 12.5 |
| Lenalidomida | LEN | 191732-72-6 | P | P | 94.7 | 35.0 |
| Pomalidomida | POM | 19171-19-8 | P | P | 50.9 | 2.50 |
| Talidomida | THA | 50-35-1 | P | P | 53.3 | 12.0 |
| Acrilamida | AcA | 79-06-01 | N | N | 37.1 | 454 |
| D-Cânfora | CAME | 464-49-3 | N | N | 27.5 | 50.0 |
| Cloridrato de difenidramina | DHM | 147-24-0 | N | P | 68.2 | 262 |
| ftalato de dimetilo | DMP | 131-11-3 | N | N | 24.4 | 100 |
| Penicilina G sal de sódio | Peng | 69-57-8 | N | N | 22.1 | 1000 |
| Sacarina sódica | SAC | 82385-42-0 | N | N | 34.0 | 1000 |
| Paracetamol | APAP | 103-90-2 | N | N | 22.3 | 20.0 |
| Trihidrato de amoxicilina | AMX | 61336-70-7 | N | N | 28.4 | 25.0 |
| Cimetidina | CENTÍMETRO | 51481-61-9 | N | N | 25.3 | 30.0 |
| Eritromicina | ERY | 114-07-8 | N | N | 20.0 | 15.0 |
| Hidroclorotiazida | HCTZ | 58-93-5 | N | N | 21.9 | 20.0 |
| Sulfassalazina | SSZ | 599-79-1 | N | N | 30.8 | 100 |
| Químico | AUC | Limiar | Sensibilidade | Especificidade | Exatidão | |
| 30 substâncias | 0.819 | 37.9 | 0.778 | 0.917 | 0.833 |
Tabela 1: Produtos químicos Devtox e não Devtox classificados em experimentos com animais e resultados estimados com e sem interrupção do sinal de FGF. Abreviaturas: P = positivo (Devtox); N = negativo (não Devtox).
Discussão
O desenvolvimento embrionário-fetal é rigidamente regulado por redes de sinalização12. Embora o feedback dentro dessas redes forneça robustez contra ruídos internos e externos, levantamos a hipótese de que os produtos químicos Devtox podem exercer efeitos além desse buffer. Aqui, apresentamos um protocolo para estimar produtos químicos Devtox com base na interrupção excessiva da sinalização FGF / SRF. Essa abordagem não fornece nenhuma informação sobre os mecanismos moleculares responsáveis pelo Devtox, como as proteínas-alvo de um produto químico, e se concentra apenas na sinalização de FGF / SRF. No entanto, foi possível classificar os produtos químicos Devtox de forma eficiente, com uma precisão de 83% e uma AUC de 0,819 (Tabela 1). Isso provavelmente ocorre porque cada via de sinalização está intimamente associada a outras e forma redes de sinalização densas, e a interrupção dentro dessas redes resulta na interrupção do sinal FGF/SRF.
Vários desafios técnicos devem ser abordados ao gerar células repórteres. O Nluc é aproximadamente 100 vezes mais brilhante do que as luciferases convencionais derivadas de vaga-lumes ou Renilla, permitindo o monitoramento contínuo de longo prazo das mudanças de sinal13. Nluc contendo a sequência PEST foi usado para capturar com mais precisão a dinâmica da atividade de sinalização. A sequência PEST promove a degradação da proteína. Enquanto a proteína Nluc é estável com uma meia-vida de mais de 6 h, a etiqueta PEST acelera a degradação através da via ubiquitina-proteassoma, reduzindo sua meia-vida para 10-30 min. Além disso, o gene repórter foi colocado no locus AAVS1, um "porto seguro" genômico, garantindo que a expressão não seja silenciada e que os genes essenciais não sejam interrompidos acidentalmente14.
Na avaliação dos métodos de ensaio, é crucial selecionar produtos químicos de referência para Devtox e não Devtox. Selecionamos produtos químicos de referência das listas do estudo de validação internacional do ECVAM, diretrizes ICH S5 (incluindo talidomida) e estudos em animais7. Listamos 30 produtos químicos Devtox e não Devtox, mas mais produtos químicos de fontes confiáveis precisam ser adicionados e testados. Portanto, o limite ROC (Soma ABC = 37,9) relatado aqui deve ser considerado preliminar e exigirá validação com um conjunto maior e independente de compostos para garantir a robustez estatística. A ciclofosfamida (CPA) foi um dos três produtos químicos com resultados falso-negativos. O CPA é hidroxilado no fígado em 4-hidroperoxiciclofosfamida, e o CPA e seus produtos de degradação são teratogênicos15. Os ensaios in vitro, incluindo nossa abordagem, normalmente não consideram o metabolismo e não podem detectar produtos químicos que induzem o Devtox via metabolismo. Esta é uma limitação da abordagem proposta. Além dos falsos negativos dependentes do metabolismo (por exemplo, CPA), também observamos um falso positivo com cloridrato de difenidramina (DHM). As evidências epidemiológicas não apóiam fortemente uma associação causal entre DHM e malformações congênitas, mas vários estudos in vitro o classificaram como um tóxico para o desenvolvimento; isso provavelmente contribuiu para sua classificação incorreta em nosso ensaio. Por outro lado, a 6-aminonicotinamida (6-AN) não interrompeu a sinalização FGF / SRF e, portanto, foi classificada incorretamente, sugerindo que seu mecanismo de toxicidade no desenvolvimento pode prosseguir por vias não capturadas por este repórter. Juntos, esses exemplos suportam a expansão do painel de ensaio para incluir vias de sinalização de desenvolvimento adicionais para reduzir falsos positivos e falsos negativos.
Vários fatores têm uma grande influência neste ensaio. Um desses fatores é a preparação celular antes do ensaio. Para minimizar isso, as células foram mantidas em um cronograma de repetição de 7 dias para garantir que as células usadas no ensaio fossem coletadas nas mesmas condições de crescimento. As células são semeadas na segunda-feira, passadas na quinta-feira e uma parte é usada para o ensaio e semeada para a próxima passagem. Outro fator é a densidade celular no momento da exposição a um produto químico em estudo. O ensaio foi realizado apenas quando as células atingiram 100% de confluência no dia da exposição química. Os efeitos de borda em placas de 96 poços são bem conhecidos. Neste ensaio, apenas os 60 poços internos da placa de 96 poços foram usados para evitar efeitos de borda. Além das considerações gerais, a variabilidade técnica pode ocorrer durante um ensaio. Um problema comum foi a intensidade de luminescência inconsistente entre os poços do grupo de controle do veículo, que pode ter resultado de semeadura celular irregular ou qualidade celular abaixo do ideal. Recomendamos manter as células em aproximadamente 80% de confluência para minimizar essa variabilidade e verificar o crescimento uniforme nos poços no dia seguinte à semeadura. O ajuste da densidade de semeadura do iPSC também pode aumentar a reprodutibilidade do ensaio. Além disso, a morte celular excessiva pode levar a flutuações de luminescência não específicas não relacionadas ao sinal experimental. Portanto, avalie a morfologia celular no final do ensaio para garantir que as células estejam em condições adequadas durante a medição. Em ensaios manuais, a remoção da placa da incubadora em cada ponto de tempo expõe as células a breves mudanças na temperatura e nos níveis de CO2. Para limitar essas flutuações ambientais, as medições devem ser realizadas de forma rápida e consistente.
Este ensaio pode ser realizado manualmente ou usando um sistema de medição em tempo real. A abordagem manual não requer equipamento especializado, mas um sistema de medição em tempo real permite uma detecção mais precisa da dinâmica do sinal. Embora não tenha sido identificado nas medições manuais, o sistema de medição em tempo real capturou claramente dois picos do sinal de luminescência. Nas medições manuais, ocorreu um intervalo de 12 h na aquisição de dados durante a noite, o que pode ter levado à subestimação ou perda do segundo pico. Esses dois picos podem ser causados por feedback negativo da sinalização de FGF e pela presença de um ligante de FGF termicamente estável. Notavelmente, a interrupção do sinal FGF por um produto químico às vezes parecia ser maior no segundo pico do que no primeiro pico (Figura 3B).
Este protocolo representa uma abordagem promissora para a triagem química Devtox usando um ensaio repórter baseado em iPSC humano para avaliar quantitativamente a interrupção do sinal FGF. Vários ensaios in vitro alternativos para toxicidade no desenvolvimento foram desenvolvidos nas últimas décadas, incluindo o teste de células-tronco embrionárias de camundongo (mEST) 16 , teste de células-tronco embrionárias baseado em Hand1 (Hand1-EST) 17 e ReProGlo18 . Comparado com esses ensaios convencionais, esse método demonstrou precisão preditiva superior. Nos últimos anos, estratégias alternativas, como as que empregam células-tronco embrionárias humanas ou embriões de peixe-zebra, foram introduzidas como parte dos esforços internacionais para estabelecer sistemas de testes sem animais. Essas abordagens também relataram alta precisão preditiva para avaliações de toxicidade no desenvolvimento. Para melhorar ainda mais o desempenho deste ensaio, a incorporação de vias de sinalização adicionais envolvidas no desenvolvimento embrionário pode ser benéfica. Existem várias outras vias de sinalização importantes na morfogênese do desenvolvimento, como sinalização Wnt / β-catenina, BMP / SMAD e sinalização Hedgehog / GLI19. Diferentes combinações de células repórter usadas para avaliar essas vias de sinalização podem fornecer uma avaliação mais abrangente de vários produtos químicos. O efeito do estágio de diferenciação das células iPS, por exemplo, o estágio inicial em que as três camadas germinativas são formadas - na sensibilidade de detecção deste ensaio será nosso tópico de pesquisa futura. Estudos futuros também podem explorar a validação entre espécies usando sistemas de células-tronco de roedores ou coelhos para permitir a comparação direta com conjuntos de dados in vivo nessas espécies, enquanto nosso foco principal permanece nas células iPS humanas para maximizar a relevância humana.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela JSPS, Japão [KAKENHI grant numbers 23K25021 e 25K03278]; MHLW, Japão [números de concessão do programa 23KD1003 e 24KD1003]; KISTEC, Japão; e AMED, Japão [números de concessão JP23mk0101252 e 25mk0121314].
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL | FastGene | FG-MCT015C | Preparação de produtos químicos de teste |
| Tubo centrífugo de 15mL | VIOLAMO | 1-3500-21 | Cultura celular |
| Tubo PCR de 8 tiras | Watson | 137-333C | Preparação de produtos químicos de teste |
| Placa inferior branca/transparente de 96 poços, superfície TC | Thermo Fisher Scientific | 165306 | Medições de cultura celular e luminescência |
| Microplaca preta Fundo Plano, 96Well | ASONE | 3-3321-04 | Para medição de luminescência em ensaios de citotoxicidade |
| Respire MAIS FÁCIL | TOHO | BERM-2000 | Filme de vedação permeável ao gás |
| Ensaio de Viabilidade de Células Luminescentes CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Ensaio de citotoxicidade |
| Centrífuga 5702 R | Eppendorf | Centrifugação | |
| ClipTip 300, Filtrado, Estéril, Rack | Thermo Fisher Scientific | 94420513 | |
| ClipTip 50, Filtrado, Estéril, Rack | Thermo Fisher Scientific | 94420253 | |
| Condessa 3 FL Contador Automático de Células | Invitrogen | Contagem de células | |
| Slides da Câmara de Contagem de Células da Condessa | Invitrogen | C10312 | Contagem de células |
| Cultura Claro DMSO | FUJIFILM Wako | 031-24051 | Solvente para produtos químicos |
| CultureSure Y-27632 | FUJIFILM Wako | 036-24023 | Inibidor de ROCK para semeadura de iPSC |
| DMEM/F12 HEPES, sem fenol vermelho | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | Revestimento para cultura celular iPS |
| F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 a 300 & micro; L | Thermo Fisher Scientific | 4661180N | |
| F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 5 a 50 & micro; L | Thermo Fisher Scientific | 4661160N | |
| Chip de filtro | Watson | ||
| Matriz de membrana basal Geltrex Reduzida de Fator de Crescimento Reduzido | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | Revestimento para cultura celular iPS |
| HIENAI Mat 01R | COSMO BIO | HMAT01R | Para manter a estabilidade da temperatura da placa durante o manuseio em cultura celular |
| Aquecedor de Tubo HIENAI GX01 | COSMO BIO | TWGX013 | Para manter o meio quente durante manuseio experimental |
| Proteína recombinante bFGF estável ao calor humano | Thermo Fisher Scientific | PHG0367 | Estimulação FGF para ensaio repórter |
| Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas (iPS) | 201B7 (Cat³ RCB HPS0063, RRID: CVCL_A324) | Banco de Células RIKEN BRC | |
| Agitador de microplacas | TAITEC | 0089532-000 | Tremor de placa para teste de citocitocicidade |
| Leitor multiplate | PerkinElmer | ARVO X4 | Medição de luminescência |
| Substrato de Célula Viva de Endurazina Nano-Glo | Promega | N2571 | Substrato de luminescência |
| PBS (-) | FUJIFILM Wako | 166-23555 | Culutre celular |
| Parafilim | COMO UM | 65-1681-93 | Armazenado para revestimento de placa |
| Pipetto | eppendorf | ||
| WSL-1563 KronosHT | ATTO | 3510140 | Sistema de medição de luminescência em tempo real |
| Reservatório | BMBio | BM-0850-1 | |
| STEMdif APEL2 Médio | Tecnologias STEMCELL | ST-05275 | Meio de ensaio |
| StemFlex Medium | Thermo Fisher Scientific | A3349401 | Meio de manutenção |
| Água Estéril, Livre de Endotoxinas | FUJIFILM Wako | 196-15645 | Controle de umidade para cultura celular iPS |
| Placa de Cultura de Tecidos VTC-P6 | VIOLAMO | 2-8588-01 | Cultura celular |
| TrypL Select Enzima (1X), sem fenol vermelho | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | Cultura celular |
| Ácido valproico | FUJIFILM Wako | 227-01071 | Produto químico de teste |
Referências
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Reimpressões e permissões
