Artigo de método

Chip microfluídico para construção de modelos de lesão axonal e habilitação de análise multiômica

DOI:

10.3791/68915

⸱

14 de outubro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beijing Advanced Innovation Center for Big Data-Based Precision Medicine, Beihang University, 2Interdisciplinary Innovation Institute of Medicine and Engineering, Beihang University, 3School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 4School of Software, Beihang University, 5School of Beijing, Beihang University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um sistema microfluídico modelando a dinâmica metabólica neuronal pós-lesão axonal, permitindo imagens, análise multiômica e estudos mecanicistas de remodelação metabólica intrínseca.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os neurônios se polarizam para formar dendritos e axônios, permitindo a comunicação intercelular. A lesão axonal interrompe essas conexões e transmite sinais de dano ao soma, muitas vezes levando à degeneração neuronal. Assim, manter a homeostase axonal é essencial para promover a regeneração local do axônio e proteger contra a neurodegeneração. Esse processo depende do metabolismo celular para fornecer energia e precursores biossintéticos e é sustentado por mecanismos que regulam o equilíbrio metabólico e eliminam subprodutos. No entanto, o metabolismo neuronal é compartimentado entre o soma e o axônio e é ainda influenciado in vivo pelo microambiente circundante, como a atividade metabólica derivada do astrócitos (por exemplo, o ônibus lactato de neurônio do astrócitos). Esses fatores complicam a investigação dos mecanismos metabólicos intrínsecos dos neurônios. Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos aqui uma plataforma microfluídica para cultura de neurônios corticais primários in vitro que preserva as principais características metabólicas observadas in vivo, incluindo fluxo glicolítico fisiológico e respiração mitocondrial. Este sistema fornece um modelo simplificado para investigar a remodelação metabólica intrínseca em neurônios após lesão axonal. Os chips microfluídicos convencionais suportam modelos de lesão axonal in vitro e são compatíveis com imagens de células vivas, coloração por imunofluorescência e tratamento de hipóxia. Para acomodar análises transcriptômicas e metabolômicas em larga escala envolvendo milhões de células, projetamos e fabricamos chips microfluídicos de alto rendimento com protocolos operacionais otimizados. O dispositivo apresenta câmaras de soma e axônio dispostas alternadamente conectadas por microcanais, e a lesão axonal é induzida pela aspiração a vácuo de fluido do compartimento axonal. Essa plataforma permite a avaliação rápida da dinâmica de metabólitos e enzimas, melhorando a precisão e a reprodutibilidade de investigações multiômicas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os neurônios estabelecem dois tipos distintos de saliências com funções especializadas, axônios e dendritos, via polarização durante o desenvolvimento 1,2. A regeneração nervosa refere-se ao processo de crescimento axonal após lesão neural3, com foco de pesquisa no reparo do sistema nervoso central (SNC). Ao contrário do sistema nervoso periférico, o SNC tem capacidade regenerativa limitada 4,5,6, muitas vezes resultando em deficiências funcionais persistentes ou permanentes em pacientes com lesões medulares ou traumatismo cranioencefálico 7,8. Assim, o desenvolvimento de estratégias para melhorar o reparo do SNC e elucidar os mecanismos subjacentes à regeneração axonal são cruciais.

Dispositivos microfluídicos, funcionando como sistemas de cultura in vitro integrados, econômicos e de alto rendimento, exibiram vantagens notáveis na pesquisa de células e neurônios nos últimos anos 9,10. Em comparação com os métodos tradicionais, a tecnologia microfluídica permite a regulação precisa da tensão de cisalhamento do fluido, gradientes de concentração e estruturas espaciais, simulando assim de perto microambientes fisiológicos e patológicos autênticos para promover o crescimento, migração, diferenciação e interações celulares 11,12,13,14. Modelos de lesão axonal in vitro baseados em microfluídica permitem a cultura compartimentada de corpos celulares e processos neuronais por meio de polarização espacial, fornecendo uma ferramenta indispensável para explorar a capacidade regenerativa intrínseca dos neurônios e suas adaptações metabólicas após a lesão15,1 6,17,18. Ele fornece uma janela crítica sobre como os neurônios respondem a lesões, regulam os processos metabólicos19 e promovem a regeneração axonal20. No entanto, as plataformas microfluídicas existentes para lesão axonal e pesquisa metabólica ainda enfrentam desafios, incluindo baixos rendimentos de células neuronais, precisão reduzida nas medições metabólicas e falta de procedimentos operacionais padronizados.

Em resposta a essas limitações, este estudo desenvolveu uma nova plataforma microfluídica em larga escala que permite a indução padronizada e de alto rendimento da lesão axonal e fornece material celular suficiente para análises multiômicas compartimentadas. Este projeto integrado confronta diretamente a necessidade crítica não atendida na pesquisa de lesões neurais. Especificamente, o chip microfluídico que projetamos apresenta um arranjo alternado de câmaras somal e axonal conectadas por microranhuras, com transecção axonal alcançada por meio de aspiração controlada a vácuo. Essa abordagem é ideal para estudos que exigem modelos de lesão axonal reprodutíveis e de alto rendimento e perfis metabólicos precisos, como investigar os mecanismos metabólicos subjacentes à regeneração axonal. Em comparação com os métodos tradicionais, essa técnica oferece maior rendimento, maior precisão metabólica e a capacidade de estabelecer modelos padronizados de lesões. Por exemplo, estudos anteriores demonstraram a importância do transporte mitocondrial na regeneração axonal 20,21,22,23, enquanto nossa plataforma revela ainda mais o papel do metabolismo da glicose na regeneração axonal após lesão. Este protocolo estabelece um sistema técnico para axotomia em larga escala e análise metabólica que é visualmente verificável e operacionalmente padronizado.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética da Universidade de Beihang e foram aprovados pelo comitê (código de aprovação: BM20210060). A Figura 1 descreve a linha do tempo experimental.

1. Projeto do dispositivo microfluídico convencional e em larga escala

  1. Projete o dispositivo microfluídico usando o AutoCAD para criar esquemas bidimensionais (2D) e modelos estruturais tridimensionais (3D).
  2. Use esses projetos para fabricar um molde mestre em um wafer de silício com fotolitografia negativa SU-8.
  3. Replique o molde mestre fundindo polidimetilsiloxano (PDMS), resultando em um chip microfluídico funcional de alta precisão.
  4. Projete cada microcanal para ter 5 μm de altura, permitindo que apenas os axônios passem enquanto bloqueiam os somas.
  5. Faça os microcanais com 10 μm de largura para aumentar a capacidade axonal.
  6. Projete as câmaras para ter 120 μm de altura e 220 μm de largura, fornecendo espaço suficiente para o soma neuronal.
  7. Use esta plataforma microfluídica para simular lesão axonal in vivo , controlando o fluxo de fluido e a colocação dos neurônios.
  8. Prepare amostras metabolômicas e transcriptômicas usando o dispositivo para manipulação celular de alta precisão e permita o processamento de alto rendimento para melhorar a precisão e a validade biológica da amostra.

2. Fabricação de dispositivos microfluídicos convencionais e de grande escala

  1. Pese a base PDMS e o agente de cura na proporção de 10:1 (p/p) e coloque-os em um tubo de centrífuga.
  2. Coloque o tubo da centrífuga contendo a mistura PDMS em um misturador agitador centrífugo. Centrifugue a 2000 × g por 4 min para misturar e, em seguida, centrifugue novamente a 2000 × g por 4 min para desgaseificar.
  3. Despeje 13-15 g do PDMS desgaseificado no molde microfluídico, garantindo que o fundo do molde esteja completamente coberto.
  4. Coloque o molde em um dessecador a vácuo. Use uma bomba de vácuo para evacuar o ar por 5 a 10 minutos para remover completamente as bolhas do PDMS.
  5. Use um bulbo de borracha para bater suavemente na superfície do PDMS para quebrar quaisquer bolhas de superfície restantes.
  6. Coloque o molde em um forno de convecção e leve ao forno a 80 °C por 100 min para curar o PDMS.
  7. Quando o PDMS estiver totalmente curado, deslize suavemente a ponta de um bisturi sob a borda do PDMS para levantá-lo e separá-lo cuidadosamente do molde.
  8. Use um punção de biópsia com um diâmetro de 2,0-2,5 mm para criar orifícios no PDMS para infusão de meio de cultura e carregamento celular.
  9. Remova quaisquer impurezas da superfície do PDMS usando fita adesiva, coloque-o em um prato de vidro limpo e embrulhe-o com papel alumínio para armazenamento.
  10. (Opcional) Trate a superfície do PDMS com plasma de oxigênio (30 W, 20 s) e pressione-o contra outra superfície para uma ligação irreversível.
  11. Antes do experimento, autoclave o dispositivo microfluídico a 121 ° C e 101 kPa por 5 min para garantir a esterilidade.

3. Preparação de neurônios corticais

  1. Anestesiar 3 ratos Sprague-Dawley (SD) pós-natais (dentro de 12 h após o nascimento), colocando-os no gelo por 5 minutos e, em seguida, decapitar rapidamente.
  2. Disseque a área motora do córtex cerebral e coloque o tecido em tampão de dissecção pré-resfriado (por exemplo, 2 mL de HBSS sem cálcio e magnésio).
    NOTA: Realize todos os procedimentos de dissecção de tecido no gelo usando soluções pré-resfriadas.
  3. Pique o tecido em aproximadamente 1 mm3 pedaços usando uma tesoura estéril e transfira para um tubo de centrífuga de 15 mL.
  4. Deixe repousar durante 5 min e, em seguida, aspire cuidadosamente o sobrenadante para remover o sangue residual e o tampão.
  5. Adicionar solução de papaína pré-aquecida (1 mg/ml) em 5 ml de HBSS com cálcio e magnésio aquecidos a 37 °C.
  6. Incubar em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO2 por 40 min, invertendo suavemente o tubo 3 vezes a cada 10 min.
  7. Após a digestão, triturar suavemente a suspensão 100 vezes usando uma pipeta de 200 μL.
    NOTA: Evite introduzir bolhas de ar para evitar o estresse celular.
  8. Centrifugar a 300 × g durante 3 min e rejeitar o sobrenadante.
  9. Adicione uma solução de terminação contendo 1 mg/mL de inibidor de protease (por exemplo,., 600 μL de frasco para injetáveis de inibidor do kit de dissociação de papaína em 5 mL de HBSS com cálcio e magnésio) para ressuspender as células.
  10. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 40 μm e recolher o filtrado num novo tubo de centrifugação.
  11. Centrifugar o filtrado a 200 × g durante 10 min e rejeitar o sobrenadante.
  12. Ressuspenda o pellet em 500 μL de meio de cultura neuronal completo contendo 2% de B27 e 1% de GlutaMAX.
  13. Contar as células (aproximadamente 3 milhões/rato) e ajustar a densidade para 1 × 106 células/ml para utilização posterior.

4. Revestimento

NOTA: Trate as lamínulas ou placas de cultura com solução de poli-D-lisina (PDL) para melhorar a adesão dos neurônios e criar um ambiente ideal para o crescimento neuronal.

  1. Revestimento de lamínulas
    1. Coloque uma lamínula destinada a dispositivos microfluídicos convencionais (Φ25 mm, espessura 0,17 mm) em uma placa de cultura de 35 mm e adicione 2 mL de solução de PDL 0,1 mg / mL.
    2. Incubar a 37 °C durante 6 h ou durante a noite.
    3. Após a incubação, recupere cuidadosamente a solução PDL para reutilização ou descarte adequado.
    4. Adicione 2 mL de água ultrapura estéril ao prato e gire-o 50 vezes no sentido horário, seguido de 50 vezes no sentido anti-horário (para vários pratos, gire-os simultaneamente em um prato maior).
    5. Aspire a água usando uma bomba de vácuo conectada a uma ponteira de pipeta estéril, coletando os resíduos em um recipiente de resíduos líquidos.
    6. Repita o procedimento de lavagem (etapas 4.1.4-4.1.5) três vezes no total.
    7. Deixe as lamínulas secarem naturalmente em um gabinete de biossegurança antes de usar.
  2. Revestimento de pratos de cultura
    1. Adicione uma quantidade apropriada de solução de PDL de 0,1 mg / mL à placa de cultura ou placa de poço (por exemplo, adicione 2 mL a uma placa de 35 mm para microfluídica convencional e 5 mL a uma placa de 10 cm para microfluídica em grande escala).
      NOTA: Certifique-se de que o gabinete de biossegurança esteja em operação adequada com fluxo de ar estéril para evitar contaminação.
    2. Certifique-se de que a solução cobre completamente o fundo e incube-a a 37 °C por 6 h ou durante a noite.
    3. Depois de recuperar a solução de PDL, lave a placa de cultura três vezes com uma quantidade adequada de água ultrapura estéril, conforme descrito na etapa 4.1.4.
    4. Remova qualquer água ultrapura residual e seque ao ar a placa de cultura em uma capela de fluxo laminar para uso posterior.

5. Preparação do meio neuronal

  1. Prepare o meio completo para a cultura de neurônios de rotina.
    1. Remova o êmbolo de uma seringa descartável de 50 mL. Coloque a seringa com a cabeça de borracha voltada para cima em uma bancada limpa dentro de um armário de biossegurança.
    2. Adicione 500 μL de estreptomicina de penicilina (PS), 1 mL de B27, 125 μL de GlutaMAX e 500 μL de soro fetal bovino (FBS) na seringa em sequência. Troque a ponta da pipeta para cada componente para evitar contaminação cruzada.
      NOTA: Adicione cada componente na ordem especificada para manter a consistência.
    3. Pegue um novo tubo de centrífuga estéril de 50 mL. Rotule-o como "Neurobasal-A (NBA) + 2% B27 + 0,25% GlutaMAX + 1% FBS + 1% PS".
      NOTA: Use NBA se não neurônios embrionários; usar neurobasal (NB) para neurônios embrionários.
    4. Encaixe um filtro de seringa de 0,22 μm na extremidade da seringa.
      NOTA: Certifique-se de que o filtro esteja firmemente conectado à seringa para evitar vazamentos.
    5. Use NBA para encher a seringa com líquido até 50 mL, incluindo o volume de aditivos. Reinstale o êmbolo.
    6. Empurre lentamente o êmbolo a aproximadamente 2 mL/s para filtrar o líquido no tubo de centrífuga rotulado.
    7. Aperte a tampa do tubo da centrífuga. Inverta o tubo 3-5 vezes para misturar o meio.
  2. Meio completo contendo [U-13C6]-glicose (para análise do fluxo metabólico): Para análise do fluxo metabólico do metabolismo da glicose em neurônios danificados, use NBA sem açúcar para preparar um meio completo contendo [U-13C6]-glicose.
    1. Utilizar NBA sem glicose como solução de base e adicionar [U-13C6]-glicose a uma concentração final de 25 mM antes da filtração (se a [U-13C6]-glicose for sólida, calculá-la e pesá-la antecipadamente). Siga a mesma sequência para adicionar outros componentes, bem como as etapas de filtração e mistura, conforme descrito na seção 5.1.

6. Contagem de células

  1. Limpe bem o hemocitômetro com etanol a 75%. Certifique-se de que todas as superfícies estejam completamente secas antes de prosseguir.
  2. Adicione 90 μL de tampão salino tamponada com fosfato estéril (PBS) a um tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL.
  3. Ressuspenda suavemente a suspensão de células neuronais coletadas, pipetando para cima e para baixo 3-5 vezes para garantir uma mistura completa.
  4. Usando uma pipeta de 10 μL, transfira 10 μL da suspensão de células mistas para o tubo de centrífuga contendo 90 μL de PBS (diluição 1:10).
  5. Use uma pipeta de 200 μL para misturar suavemente a solução 10 vezes, garantindo que não se formem bolhas.
  6. Substitua a ponteira da pipeta por uma nova ponteira de 10 μL. Retire 10 μL da mistura e adicione-os à câmara de amostra do hemocitômetro.
  7. Coloque o hemocitômetro no microscópio stage e foque usando a objetiva de 20x. Localize a grade central 4 × 4 e conte as células em todos os 16 quadrados seguindo as regras padrão do hemocitômetro.
  8. Registre a contagem total de células de todos os 16 quadrados. Calcule a concentração celular usando a fórmula: (Contagem total × 10) × 104 células/mL.
    NOTA: Trabalhe sempre em um gabinete de biossegurança com equipamento de proteção individual adequado.

7. Cultura in vitro de neurônios corticais em dispositivos microfluídicos convencionais ou de grande escala

  1. Protocolo A (Dispositivos microfluídicos convencionais).
    1. Verifique se a superfície de vidro da placa de cultura de 35 mm está completamente seca.
    2. Usando uma pinça de ponta fina estéril, coloque o chip microfluídico autoclavado no centro da superfície do vidro com os microcanais voltados para baixo.
    3. Pressione suavemente o chip na superfície do vidro usando uma ponta de pipeta de 200 μL para garantir a adesão completa.
    4. Marque a câmara esquerda com um ponto (·) usando um marcador permanente para designar o compartimento do soma.
    5. Aspirar 10 μL de suspensão neuronal (10 milhões de células/mL) usando uma pipeta de 10 μL.
    6. Dispense lentamente a suspensão na porta de carregamento acima do compartimento de soma marcado.
    7. Confirme o fluxo de fluido adequado no reservatório inferior da câmara esquerda.
    8. Transfira a placa de cultura para uma incubadora umidificada (37 °C, 5% CO2) por 20 min.
    9. Remova a placa de cultura da incubadora.
    10. Usando um microscópio de contraste de fase de 20 ×, confirme a perfusão do meio do compartimento do soma para o compartimento axonal através dos microcanais.
    11. Adicione 150 μL de meio basal neuronal à porta superior do compartimento axonal (câmara direita), permitindo o fluxo impulsionado pela gravidade para o reservatório inferior.
    12. Da mesma forma, adicione 15 μL de meio neuronal completo à porta superior do compartimento do soma (câmara esquerda).
      NOTA: Nesta fase, os neurônios devem aderir visivelmente, com a maioria dos detritos celulares liberados para o poço inferior. Não substitua o meio durante a cultura; Use uma única adição de meio neuronal completo, conforme descrito na etapa 5.1.3.
    13. Despeje 20 mL de água ultrapura em uma placa de cultura de 150 mm para criar uma câmara de umidade. Coloque a placa de cultura de 35 mm dentro da placa grande.
    14. Transfira todo o sistema de cultura para a incubadora e mantenha pelo tempo necessário (por exemplo, 7 dias).
      NOTA: Realize todos os procedimentos de cultura de células em condições estéreis em um gabinete de biossegurança. Use equipamento de proteção individual adequado (jaleco e luvas). Descontamine as superfícies de trabalho antes e depois dos procedimentos.
  2. Protocolo B (chips microfluídicos em grande escala).
    NOTA: O protocolo padrão de especificações convencionais foi seguido com duas modificações.
    1. Use uma placa de Petri de 10 cm para a colocação do dispositivo.
    2. Escolha a semeadura de canal completo ou de canal de intervalo com base nas necessidades experimentais, pois cada método requer diferentes protocolos de lesão axonal.
    3. Após a conclusão da semeadura, adicione 5 mL de meio de cultura de neurônios completo à placa de Petri de 10 cm para manter o crescimento dos neurônios.
    4. Adicione 20 mL de água ultrapura a um prato grande de 150 mm para criar uma câmara de umidade. Em seguida, coloque o prato de 10 cm dentro do prato grande.
    5. O mesmo que a etapa 7.1.14.

8. Estabelecimento de um modelo de lesão axonal in vitro em dispositivos microfluídicos convencionais

  1. Marque o lado esquerdo do dispositivo microfluídico como o compartimento somal (conforme indicado pela marca "·") e o lado direito como o compartimento terminal axonal.
  2. Semeie neurônios corticais no compartimento somal.
  3. Cultive os neurônios in vitro até o dia 7 (DIV7), permitindo que os axônios se estendam através dos microcanais até o compartimento terminal axonal.
  4. No DIV7, execute procedimentos de lesão axonal no compartimento terminal axonal para estabelecer um modelo de lesão axonal in vitro .
  5. Pegue uma quantidade adequada de meio NBA e transfira-o para um novo tubo de centrífuga de 15 mL para uso posterior.
  6. Cultura de neurônios corticais no dispositivo microfluídico pelo período especificado. Em seguida, transfira o dispositivo para uma bancada limpa.
  7. Use papel sem fiapos para secar o fundo da placa de cultura de 35 mm. Use uma pipeta de 200 μL para aspirar o meio dos dois orifícios do lado direito do dispositivo microfluídico.
  8. Conecte a tubulação da bomba de vácuo a uma ponta de pipeta estéril e sem filtro de 200 μL, ligue a bomba de vácuo (taxa de sucção de 60 L/min) e aponte a ponta para o ponto de conexão entre o orifício inferior da câmara terminal do axônio e a câmara para aspirar o meio antigo (neste ponto, os axônios quebram devido à pressão negativa).
  9. Recoloque a ponta da pipeta de 200 μL e retire 150 μL de NBA, adicionando-a lentamente através do orifício inferior da câmara direita.
    NOTA: Se o fluxo de líquido for muito lento e formarem bolhas, expulse rapidamente o líquido da ponta para encher rapidamente a câmara.
  10. Alterne usando os dois orifícios do lado direito para adição de líquido: após cada adição de NBA, use imediatamente a bomba de vácuo para aspirar o líquido do outro orifício para cortar os axônios. Repita esta operação 4 vezes e, após a última aspiração, substitua por meio neuronal completo fresco.
  11. Aspire o meio antigo do orifício lateral do corpo celular e adicione um meio neuronal completo e fresco contendo drogas (se necessário).
  12. Coloque o dispositivo microfluídico junto com a placa de cultura em uma placa de cultura de 150 mm e continue a cultura pelo tempo especificado (por exemplo, 24 h).
    NOTA: A operação de dano do axônio requer meio NBA, pois o meio neuronal completo produzirá bolhas que afetam o efeito de corte.

9. Lesão axonal do dispositivo microfluídico em grande escala

  1. Método 1: Lesão axonal manual.
    1. Semeie neurônios em todas as câmaras do dispositivo microfluídico.
    2. Incube o dispositivo a 37 ° C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 por três dias e, em seguida, remova todo o dispositivo microfluídico.
      NOTA: Para evitar estresse mecânico ou ruptura de axônios crescidos nos microcanais, remova o dispositivo microfluídico em DIV3 em vez de DIV7. Isso é particularmente importante se o projeto experimental incluir um grupo de controle não danificado.
    3. No DIV7, remova a placa de cultura contendo o dispositivo microfluídico da incubadora e coloque-a em um estágio estéril.
    4. Prepare um microscópio com ampliação de 20x e esterilize a área de trabalho com etanol a 75%.
    5. Segure uma ponta de pipeta filtrada estéril de 10 μL e identifique feixes de axônios nos microcanais originais sob orientação do microscópio.
    6. Faça arranhões longitudinais ao longo de cada feixe de axônios usando a ponta da pipeta.
    7. Observe a quebra do axônio sob o microscópio em tempo real após a coceira.
      NOTA: Ao manusear neurônios vivos, use luvas de nitrilo e trabalhe em um ambiente de laboratório esterilizado por UV
  2. Método 2: Lesão axonal assistida por vácuo.
    1. Semeiam neurônios corticais alternadamente no dispositivo microfluídico de grande formato.
    2. Ligue a bomba de vácuo e ajuste-a para 60 L/min.
    3. Conecte a extremidade do tubo da bomba de vácuo à porta da câmara do axônio usando uma ponta de pipeta estéril.
    4. Separação completa do axônio aplicando pressão de vácuo por meio de protocolos microfluídicos convencionais.
    5. (Opcional) Para coletar especificamente os axônios lesados, em um ponto de tempo definido após a axotomia, aspire rapidamente o conteúdo do compartimento do corpo celular usando uma bomba de vácuo (com uma taxa de sucção de 60 L / min) para remover os corpos celulares, deixando apenas os axônios dentro dos microcanais.

10. Tratamento hipóxico de dispositivos microfluídicos convencionais ou de grande escala

  1. Semeie neurônios primários no dispositivo microfluídico e cultive até DIV7 sob condições normóxicas (37 ° C, 5% CO2).
  2. Coloque o dispositivo microfluídico em uma câmara incubadora de hipóxia e forneça-o com uma mistura de gases consistindo de 1% de O2, 5% de CO2 e N2 balanceado.
  3. Use um rotâmetro para controlar a vazão de gás e ajuste-a para 25 L/min.
  4. Lave a câmara por 5 min para deslocar o ar.
  5. Enquanto aperta a entrada da câmara hipóxica, feche a válvula redutora de pressão de saída.
  6. Prenda a tubulação de saída da câmara hipóxica e, finalmente, feche bem a válvula do cilindro de gás.
  7. Incubar o dispositivo microfluídico na câmara hipóxica a 3 °C durante 1 h.

11. Preparação de amostras de neurônios cultivados in vitro usando dispositivos microfluídicos de grande escala para análise ômica

  1. Amostra para transcriptômica.
    1. Transfira o dispositivo microfluídico com os axônios danificados para uma capela de fluxo laminar 6 h após a conclusão da lesão axonal.
    2. Depois de descartar o meio antigo, lave as células neuronais 2-3 vezes com PBS estéril.
    3. Use um kit de extração de RNA padrão para isolar e purificar o RNA de acordo com as instruções do fabricante.
    4. Realize o sequenciamento de RNA. Realize análises de bioinformática de acompanhamento nos dados de sequenciamento adquiridos.
  2. Amostra para análise do fluxo metabólico.
    NOTA: Para monitorar as mudanças no fluxo metabólico da glicose nos neurônios após a lesão usando um dispositivo microfluídico de grande escala, empregamos a análise do fluxo metabólico de rastreamento de glicose [U-13C6]24. O protocolo para preparação de amostras para análise de LC-MS é o seguinte:
    1. Use filhotes de ratos P0 SD para os experimentos. Dissecar neurônios corticais e cultivá-los in vitro a curto prazo (DIV5-DIV7) ou a longo prazo (DIV15-DIV30).
    2. Para neurônios jovens (DIV5-DIV7) e maduros (DIV15-DIV30), estabeleça grupos de lesão e grupos de controle não lesionados.
    3. Substitua o meio por um contendo 25 mM [U-13C6] -glicose (Neurobasal-A sem glicose, 1% FBS, 2% B27, 25 mM [U-13C6] -glicose) e incube por 4 h a 37 ° C.
      NOTA: Para evitar estresse neuronal e apoptose causados por alterações osmóticas ou de pH durante a troca do meio, prepare neurônios adicionais cultivados em meio contendo 25 mM [U-13C6] de glicose no momento da semeadura e use este meio para a troca.
    4. Depois de enxaguar suavemente duas vezes com 5 ml de HBSS pré-aquecido (contendo cálcio e magnésio), congelar rapidamente as amostras em azoto líquido e conservá-las a -80 °C.
      NOTA: Use luvas de nitrilo e jaleco ao manusear nitrogênio líquido.

12. Coloração de imunofluorescência neuronal baseada em dispositivos microfluídicos convencionais e de grande escala

NOTA: Ao cultivar neurônios in vitro usando dispositivos microfluídicos, deve-se considerar o dano potencial aos axônios neuronais dentro dos microcanais que podem ocorrer durante a desmontagem desses dispositivos para fixação de células vivas.

  1. Use uma bomba de vácuo de microresíduos para remover o meio de cultura dos quatro poços do dispositivo microfluídico.
    NOTA: Mantenha o líquido em duas câmaras durante todo o processo de coloração por imunofluorescência. Os parâmetros de sucção não devem ser muito altos (2,5 L/min é o ideal) para evitar danos ou aspiração de corpos celulares neuronais e axônios.
  2. Adicione 100 μL de 1x PBS a cada um dos dois poços superiores do dispositivo microfluídico (o PBS fluirá naturalmente para os poços inferiores).
  3. Substitua a ponta sem filtro na extremidade da bomba de vácuo, aspire o PBS dos poços inferiores e repita o processo três vezes. Na iteração final, aspire todo o PBS dos quatro poços.
  4. Adicione 150 μL de solução de paraformaldeído (PFA) a 4% em cada um dos dois poços superiores e fixe em temperatura ambiente por 10-15 min.
    NOTA: Evite a desmontagem do dispositivo durante a fixação de células vivas para manter a integridade estrutural neuronal. Essa abordagem ajuda a distinguir as localizações dos somas e axônios neuronais com mais clareza.
  5. Lave três vezes com 1x PBS e, em seguida, incube os neurônios com tampão de bloqueio contendo 5% de soro de cabra, 0,3 M de glicina, 2% de albumina de soro bovino (BSA), PBS e 0,1% (ou 0,5%) de Triton X-100 por 1 h.
  6. Dilua o anticorpo primário (por exemplo, βIII-tubulina, camundongo, 1:2000) no tampão de bloqueio, adicione 100 μL ao poço superior esquerdo e 50 μL ao poço superior direito e incube com neurônios durante a noite a 4 ° C.
  7. Após aspirar o anticorpo primário, lave três vezes com 1x PBS conforme descrito nas etapas 12.2-12.3. Em seguida, adicione o anticorpo secundário preparado com tampão de bloqueio nos poços superiores do dispositivo microfluídico, conforme descrito na etapa 12.6, e incube no escuro por 30 min (cubra com papel alumínio, se necessário).
  8. Depois de lavar três vezes com 1x PBS, enxágue uma vez com água ultrapura. Use cuidadosamente uma pinça curva para segurar e remover o dispositivo do canto superior direito da configuração microfluídica.
  9. Adicione 1 mL de PBS ao prato de cultura para separar a lamínula grande do prato.
  10. Use uma pipeta para extrair 15 μL de meio de montagem e solte-a na lamínula no local designado para as lamínulas.
  11. Abaixe suavemente o lado da célula no meio de montagem, coloque a lamínula e remova o excesso de líquido.
  12. Deixe o meio de montagem secar completamente à temperatura ambiente.
  13. Depois que o meio de montagem secar à temperatura ambiente, use um microscópio confocal de disco giratório para realizar a imagem.
  14. Selecione uma objetiva de ar de 20x, defina o tempo de exposição para 100-200 ms por quadro e defina a potência do laser para 5-10% do máximo com excitação de 488 nm para Proteína Fluorescente Verde (GFP) e/ou 561 nm para Proteína Fluorescente Vermelha (RFP).

13. Imagem de células vivas em dispositivos microfluídicos convencionais

  1. Cultura de neurônios corticais no dispositivo microfluídico até DIV7.
  2. Prepare o corante de células vivas (por exemplo, uma sonda para o potencial de membrana mitocondrial) de acordo com as instruções do fabricante.
  3. Diluir o corante em meio de manutenção neuronal pré-aquecido (37 °C).
  4. Carregue a solução de corante no compartimento somático do dispositivo microfluídico.
  5. Incubar durante 30 min numa incubadora a 37 °C, 5% de CO2 .
  6. Lave suavemente os compartimentos 3 vezes com 3 mL de HBSS pré-aquecido (37 ° C) contendo cálcio e magnésio.
  7. Adicione a solução de imagem de células vivas sem vermelho de fenol ao chip microfluídico.
  8. (Opcional) Inclua GlutaMAX (0,25%) e B27 (2%) para imagens prolongadas.
  9. Coloque o chip microfluídico no estágio do microscópio com a câmara somática à esquerda e a câmara terminal axonal à direita.
  10. Adicione uma gota de óleo de imersão à lente objetiva, garantindo que o óleo entre em contato com a lamínula abaixo do chip.
  11. Use uma objetiva de 40x com exposição de 150 ms e potência máxima do laser de 10 a 15% para geração de imagens.
    NOTA: Ajuste esses parâmetros com base na fotoestabilidade do corante.

14. Análise dos dados

  1. Use o software ImageJ para analisar imagens de microscopia. Avalie a qualidade do RNA com um bioanalisador. Execute e analise RNA-seq usando uma plataforma apropriada.
  2. Para estudos metabolômicos, extraia dados brutos de espectrometria de massa usando o programa MRMPROBS (versão 2.60) e colete informações sobre os metabólitos identificados, incluindo detalhes isotópicos e áreas de pico.
  3. Use o GraphPad Prism (versão 8.4.3) para todas as análises estatísticas. Apresentar os dados como média ± EPM. Use testes t bicaudais não pareados ou testes de Mann-Whitney para comparações de grupos e aplique ANOVA de duas vias para comparações entre vários pontos de tempo dentro dos grupos (Significância: ns, não significativo; *p < 0,05; **p < 0,01; *** p < 0,001).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para estabelecer uma plataforma de pesquisa abrangente para estudar os mecanismos de regulação metabólica em neurônios corticais, primeiro cultivamos neurônios corticais em um dispositivo microfluídico convencional, controlando com precisão o crescimento do axônio ao longo dos microcanais (Figura 2A). Com um design adequado, os microcanais foram construídos com uma altura baixa (5 μm) e uma largura maior (10 μm), permitindo que cada canal hospedasse mais axôn...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O estabelecimento de modelos in vitro avançados para o estudo da lesão e regeneração axonal é essencial para a descoberta dos mecanismos moleculares e metabólicos envolvidos no reparo neuronal16,19. Neste estudo, apresentamos um fluxo de trabalho padronizado que integra dispositivos microfluídicos, culturas neuronais em larga escala e protocolos precisos de lesão axonal, permitindo uma análise multiômica robusta de neurô...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais de Pequim (Grant Nos. L222080, F251031, Z240011, 7192103) e pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant Nos. 82271513)

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio Neurobasal-AGibco10888022Meio de cultura
Alexa Fluor 488 cabra anti-mouseInvitrogenA-21042Imunofluorescência
Balança analíticaShanghai Shunyu Hengping Scientific Instrument Co., Ltd.FA1004Pesagem precisa de reagentes/amostras
B27 (50x)Gibco17504044Meio de cultura
Ensaio de proteína BCABosterAR1189Concentrações de proteínas
BioanalisadorAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Albumina de soro bovinoGenviewFA016Imunofluorescência
Misturador agitador centrífugoPENSARSÃO-310Misture PDMS e desgaseificação
Analisador CLARIOstarPlus-ACUBMG LABTECHCLARIOstar PlusConcentrações de proteínas
Incubadora CO2Thermo Fisher Scientific (Asheville) LLC3111Incubação de cultura de células a 37 > C, 5% CO?
Bomba de vácuo de diafragma resistente à corrosãoShanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.LC-85DLCAspire o líquido residual e forneça sucção para axotomia
D-GLICOSE (U-13C6, 99%)Laboratórios de Isótopos de CambridgeCLM-1396Fluxo metabólico
DNase IRoche11284932001Cultura neuronal
Plataforma Dr.TOM2Genômica BGIExecutar e analisar RNA-seq;
Forno elétrico de secagem de ar quenteBIOM Huahong Bonn / Huaying BosiDHG-9070ACura PDMS
Balança EletrônicaXangai Huachao Industrial Co., Ltd.HC313Pesagem de rotina de materiais
Meio de montagem aquoso FluoromountSigma-AldrichRolamento F4680Imunofluorescência
GlutaMAXGibco35050061Meio de cultura
GlicinaSolarbioG8200Imunofluorescência
HBSSGibco14025092Cultura neuronal
HBSS, sem cálcio, sem magnésioGibco14175095Cultura neuronal
Esterilizador a vapor de alta pressãoSTIK Instrument (Shanghai) Co., Ltd.HMJ-54AEsterilização de equipamentos e meios de laboratório
Câmara hipóxicaTecnologias STEMCELL27310Tratamento hipóxico
ImagemJNIHUsado para analisar imagens de microscopia
Microscópio LeicaLeica Microsystems CMS GmbHDMIL LED FluoObservação ao vivo e fluorescência
Solução de imagem de células vivasInvitrogenA14291DJImagem de células vivas
Caixa de armazenamento médica de baixa temperatura (-80 ° C)Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.DW-86L388JArmazenamento de amostras de longo prazo a -80 > C
Mini bomba de vácuo de mesaHaimen Qilin-Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.GL-805Aplicações de vácuo em pequena escala
MitoTracker Laranja CMTMRosInvitrogenM7510Coloração do potencial da membrana mitocondrial
Programa MRMPROBSVersão 2.60Para extrair dados brutos de espectrometria de massa 
Meio NeurobasalGibco21103049Meio de cultura
Neurobasal-A sem glicoseGibcoA2477501Meio de cultura
PapaínaWorthingtonLS003127Cultura neuronal
ParaformaldeídoSigma-AldrichPág. 6148Fixação celular
PDMSDow CorningDC184Fabricação de dispositivos
Frasco Inibidor do Kit PDSWorthingtonLK003182Cultura neuronal
Penicilina estreptomicinaGibco15140122Meio de cultura
Solução salina tamponada com fosfatoBiosharpBL302ADiluir as substâncias e limpar os recipientes das células
Limpador de plasmaHarrick PlasmaODC-32G-2Ativação
Poli-D-lisinaSigma-AldrichPág. 6407Cultura neuronal
Prisma GraphPadVersão 8.4.3Análises estatísticas
Centrífuga refrigeradaEppendorf AG (Alemanha)5430RSeparação de amostras em temperaturas controladas
Kit de extração de RNA total de células / bactérias puras RNArepTiangendp430Transcriptômica
RotâmetroDwyerRMA-23-SSVControle o baixo fluxo de oxigênio
Microscópio estéreoCorporação OlympusSZ2-ILSTObservação e dissecção da amostra
Agitador Orbital StuartKylin-BellTS-200Mistura de culturas/soluções de células em velocidades ajustáveis
Tritão X-100Sigma-Aldrich100 XImunofluorescência
Bomba de vácuo de palhetas rotativas ULVACFornecedor:ULVAC (Ningbo) Co., Ltd.GLD-N202Criação de vácuo para filtração/secagem
β III-tubulinaPromegaG7121Imunofluorescência

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Namba, T., et al. Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex. Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).
  2. Donato, A., Kagias, K., Zhang, Y., Hilliard, M. A. Neuronal sub-compartmentalization: a strategy to optimize neuronal function. Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (3), 1023-1037 (2019).
  3. Anderson, M. A., et al. Required growth facilitators propel axon regeneration across complete spinal cord injury. Nature. 561 (7723), 396-400 (2018).
  4. Hilton, B. J., Bradke, F. Can injured adult CNS axons regenerate by recapitulating development. Development. 144 (19), 3417-3429 (2017).
  5. Li, Y., et al. Microglia-organized scar-free spinal cord repair in neonatal mice. Nature. 587 (7835), 613-618 (2020).
  6. Hilton, B. J., et al. An active vesicle priming machinery suppresses axon regeneration upon adult CNS injury. Neuron. 110 (1), 51-69 (2022).
  7. Alizadeh, A., Dyck, S. M., Karimi Abdolrezaee, S. Traumatic spinal cord injury: An overview of pathophysiology, models and acute injury mechanisms. Front Neurol. 10, 441408(2019).
  8. Anjum, A., et al. Spinal cord injury: Pathophysiology, multimolecular interactions, and underlying recovery mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 7533(2020).
  9. Zhao, P., et al. Microfluidic model to mimic initial event of neovascularization. J Vis Exp. (170), e62003(2021).
  10. Li, N., Sip, C., Folch, A. Microfluidic chips controlled with elastomeric microvalve arrays. J Vis Exp. (8), e296(2007).
  11. Chowdhury, A. N., et al. A customizable chamber for measuring cell migration. J Vis Exp. (121), e55264(2017).
  12. De Ninno, A., et al. Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments. J Vis Exp. (170), e61895(2021).
  13. Shahryari, V., et al. Pre-clinical orthotopic murine model of human prostate cancer. J Vis Exp. (114), e54125(2016).
  14. Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. Microfluidic co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating soluble signal-mediated interactions. J Vis Exp. (38), e1749(2010).
  15. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  16. Liu, R., Zhou, B. Harmine promotes axon regeneration through enhancing glucose metabolism. J Biol Chem. 301 (3), 108254(2025).
  17. Shrirao, A. B., et al. Microfluidic platforms for the study of neuronal injury in vitro. Biotechnol. Bioeng. 115 (4), 815-830 (2018).
  18. Van Laar, V. S., Arnold, B., Berman, S. B. Primary embryonic rat cortical neuronal culture and chronic rotenone treatment in microfluidic culture devices. Bio Protoc. 9 (6), e3192(2019).
  19. Huang, N., et al. Reprogramming an energetic AKT-PAK5 axis boosts axon energy supply and facilitates neuron survival and regeneration after injury and ischemia. Curr Biol. 31 (14), 3098-3114 (2021).
  20. Zhou, B., et al. Facilitation of axon regeneration by enhancing mitochondrial transport and rescuing energy deficits. J Cell Biol. 214 (1), 103-119 (2016).
  21. Cartoni, R., et al. The mammalian-specific protein armcx1 regulates mitochondrial transport during axon regeneration. Neuron. 92 (6), 1294-1307 (2016).
  22. Han, S. M., Baig, H. S., Hammarlund, M. Mitochondria localize to injured axons to support regeneration. Neuron. 92 (6), 1308-1323 (2016).
  23. Yang, L. Q., Chen, M., Ren, D. L., Hu, B. Dual oxidase mutant retards mauthner-cell axon regeneration at an early stage via modulating mitochondrial dynamics in zebrafish. Neurosci Bull. 36, 1500-1512 (2020).
  24. Yuan, M., et al. Ex vivo and in vivo stable isotope labelling of central carbon metabolism and related pathways with analysis by LC-MS/MS. Nat Protoc. 14 (2), 313-330 (2019).
  25. Mercimek, R., et al. On the effects of 3D printed mold material, curing temperature, and duration on polydimethylsiloxane (PDMS) curing characteristics for lab-on-a-chip applications. Micromachines (Basel). 16 (6), 684(2025).
  26. Derosa, B. A., et al. Convergent pathways in idiopathic autism revealed by time course transcriptomic analysis of patient-derived neurons. Sci Rep. 8 (1), 8423(2018).
  27. Cheng, X. T., Huang, N., Sheng, Z. H. Programming axonal mitochondrial maintenance and bioenergetics in neurodegeneration and regeneration. Neuron. 110 (12), 1899-1923 (2022).
  28. Huang, N., Sheng, Z. H. Microfluidic devices as model platforms of CNS injury-ischemia to study axonal regeneration by regulating mitochondrial transport and bioenergetic metabolism. Cell Regen. 11 (1), 33(2022).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Axonal Injury ModelMultiomics AnalysisCortical NeuronsMetabolic RemodelingAxonal RegenerationTranscriptomic AnalysisMetabolic Flux AnalysisPDMS MicrofluidicsVacuum Aspiration Injury

Artigos relacionados