Artigo de método

Avaliando intervenções terapêuticas no modelo de camundongo deficiente em SHIP de ileíte e fibrose semelhantes à doença de Crohn

DOI:

10.3791/68928

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14 de outubro de 2025

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1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of British Columbia and BC Children's Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo demonstra como o modelo de camundongo deficiente em 5'-inositol fosfatase (SHIP) contendo domínio de homologia 2 Src de inflamação ileal e fibrose semelhante à doença de Crohn (DC) pode ser usado para testar novas terapias para DC.

Resumo

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A doença de Crohn (DC) é uma condição inflamatória crônica e recidivante caracterizada por inflamação segmentar transmural que pode afetar qualquer parte do trato gastrointestinal. Uma característica da DC é a função de barreira intestinal prejudicada, e a fibrose intestinal é uma complicação comum. Camundongos deficientes em SHIP (SHIP-/-) desenvolvem espontaneamente disfunção da barreira intestinal, inflamação ileal e patologia fibrótica, recapitulando as principais características da ileíte semelhante à DC. Os camundongos SHIP-/- servem como um modelo valioso para testar terapias anti-inflamatórias e antifibróticas na DC.

Aqui, descrevemos métodos para avaliar intervenções terapêuticas neste modelo, usando a dexametasona como exemplo de terapia eficaz. Fornecemos um protocolo passo a passo para caracterizar a doença e a resposta ao tratamento, incluindo avaliação in vivo da permeabilidade intestinal medida por FITC-dextrana, bem como exame patológico macroscópico e análises histológicas detalhadas. As avaliações histológicas incorporam coloração de hematoxilina e eosina (H&E) para inflamação, coloração tricrômica de Masson para fibrose e coloração de azul de Alcian/ácido periódico-Schiff (PAS) para hiperplasia e hipertrofia de células caliciformes. Além disso, citocinas e marcadores inflamatórios no tecido ileal são quantificados para avaliar o estado inflamatório. Juntos, esses métodos fornecem uma estrutura abrangente para avaliar a eficácia do tratamento no modelo de camundongo SHIP-/- de ileíte semelhante a CD. Este protocolo é amplamente aplicável a investigadores que estudam inflamação intestinal, cicatrização da mucosa e fibrose intestinal.

Introdução

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Os dois principais tipos de doença inflamatória intestinal (DII) são a doença de Crohn (DC) e a colite ulcerativa (RCU), ambas caracterizadas por inflamação gastrointestinal crônica (GI) que pode seguir um curso remitente-recorrente ou progressivo1. Embora a DII tenha sido historicamente considerada uma doença de nações ocidentalizadas, sua incidência está aumentando rapidamente em países em desenvolvimento na América do Sul, Ásia e África2. Ao mesmo tempo, a prevalência continua a aumentar na América do Norte, Europa e Austrália, com um aumento de quase 50% na incidência e prevalência relatada entre 1990 e 2019, ressaltando a crescente carga global de saúde da DII 2,3. Apesar dos esforços significativos de pesquisa, a causa subjacente da DII permanece desconhecida. As evidências atuais sugerem uma interação complexa entre suscetibilidade genética, disfunção do sistema imunológico e gatilhos ambientais, incluindo alterações no microbioma 4,5.

Existem diferenças importantes entre CD e UC. Na colite ulcerativa, a inflamação está confinada ao cólon e é caracterizada por envolvimento contínuo que se limita à camada mucosa 6,7. Em contraste, a DC é caracterizada por inflamação descontínua e transmural que pode afetar qualquer parte do trato gastrointestinal, mais comumente no íleo terminal 6,7. Uma complicação marcante da DC é a fibrose intestinal, que contribui para a formação de estenoses e obstrução intestinal8. A fibrose é definida pela deposição excessiva de componentes da matriz extracelular, como o colágeno, e espessamento das camadas musculares intestinais 9,10. Aproximadamente 30% das pessoas com DC desenvolvem doença de estenose dentro de 10 anos após o diagnóstico11. Atualmente, nenhuma terapia visa diretamente a fibrose, uma necessidade clínica não atendida que pode ser atendida usando modelos pré-clínicos adequados para estudar essa complicação 9,12.

Para entender melhor a patogênese da DII e facilitar o desenvolvimento de novas terapias, vários modelos de camundongos foram estabelecidos12. Embora exista um grande número de modelos de colite, apenas alguns recapitulam a inflamação ileal e a fibrose associada à DC12. Entre eles estão o domínio de homologia Src 2 contendo 5'-inositol fosfatase-deficiente (SHIP-/-) aqui descrito, bem como os camundongos SAMP1/YitFc e os camundongos TnfΔARE. Esses modelos refletem coletivamente a complexidade da DC humana, pois cada uma é impulsionada por mecanismos celulares e moleculares distintos. A doença em camundongos SAMP1 / YitFc resulta de uma predisposição poligênica que afeta a função da barreira epitelial e a regulação imunológica13,14, enquanto os camundongos TnfΔARE carregam uma deleção de elementos ricos em AU no mRNA do TNF, levando ao aumento da estabilidade do mRNA e à superprodução de TNF15,16. Embora valiosos, esses modelos têm limitações. O modelo SAMP1 / YitFc sofre de baixa eficiência de reprodução, o que representa desafios na geração de tamanhos de coorte suficientes para estudos17. Além disso, o modelo TnfΔARE requer até 24 semanas para desenvolver patologia fibrótica notável, o que torna caro e desafiador fazer estudos de intervenção16.

O SHIP é um regulador negativo da via de sinalização da fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) e é predominantemente expresso em células hematopoiéticas. Ele funciona removendo o grupo fosfato 5 'do fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato, atenuando assim a sinalização PI3K a jusante18. Os camundongos SHIP-/- oferecem várias vantagens para estudos pré-clínicos. Esses camundongos são relativamente fáceis de reproduzir e exibem sinais de fibrose já nas 8 semanas de idade19. A remodelação fibrótica acelerada neste modelo é provavelmente impulsionada por respostas inflamatórias aumentadas devido a uma via PI3K desregulada, que leva à hiperativação de células imunes e subsequente remodelação rápida do tecido. Mais importante ainda, nós e o grupo de Kerr mostramos independentemente que os camundongos SHIP-/- desenvolvem ileíte com características que se assemelham ao CD19,20 humano. Apoiando a relevância deste modelo, um subconjunto de indivíduos com DC reduziu a atividade do SHIP em biópsias ileais e PBMCs21. Além disso, aqueles com baixa atividade de SHIP tendem a experimentar um curso mais grave da doença, muitas vezes exigindo múltiplas cirurgias22.

Os camundongos SHIP-/- começam a desenvolver inflamação intestinal espontânea e descontínua localizada no íleo distal já às 4 semanas de idade, com inflamação presente em todos os camundongos às 6 semanas de idade20. Com 8 semanas de idade, os camundongos estabeleceram patologia fibrótica, caracterizada por espessamento da muscular externa e extenso acúmulo de colágeno na submucosa e entre as camadas musculares19. A inflamação neste modelo é impulsionada pela interleucina-1β derivada de macrófagos (IL-1β)21. Tanto a depleção de macrófagos usando lipossomas contendo clodronato quanto o bloqueio farmacológico da sinalização de IL-1 com um antagonista do receptor de IL-1 (anakinra) melhoraram a inflamação intestinal em camundongos SHIP-/-21. Além da ileíte, os camundongos SHIP-/- exibem inflamação pulmonar, que usamos para avaliar os efeitos fora do alvo de terapias projetadas para administração intestinal localizada23. Outros relataram que a inibição da caspase-8 com Z-IETD-FMK reduz significativamente a inflamação ileal e pulmonar em camundongos SHIP-/-24, apoiando ainda mais a patologia pulmonar como uma característica adicional para avaliar o controle inflamatório sistêmico.

Este artigo metodológico revisita nosso trabalho recentemente publicado sobre o tratamento bem-sucedido com dexametasona23 e fornece uma descrição detalhada dos principais procedimentos técnicos, com considerações adicionais para o uso de modelos de camundongos em testes farmacológicos. Especificamente, destacamos os parâmetros padrão para avaliar a eficácia do medicamento em modelos de DII, incluindo avaliação da permeabilidade intestinal, patologia macroscópica, histopatologia e mediadores e efetores pró-inflamatórios, e discutimos como integrar esses dados para tirar conclusões sobre a eficácia terapêutica geral.

Protocolo

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Os estudos envolvendo animais devem ser realizados em conformidade com os protocolos éticos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e de acordo com as Diretrizes dos Conselhos Nacionais de Pesquisa sobre Cuidados com Animais. Todos os procedimentos em animais neste protocolo seguiram as diretrizes éticas do Conselho Canadense de Cuidados com Animais e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade da Colúmbia Britânica (protocolo A21-0212).

NOTA: Para avaliar o impacto terapêutico do medicamento na patologia intestinal de camundongos SHIP-/-, inclua SHIP+/+ como controles saudáveis para comparação. Para intervenção terapêutica, inicie o tratamento com 6 semanas de idade, quando a doença estiver totalmente estabelecida no modelo. Aqui, os camundongos SHIP+/+ e SHIP-/- receberam gavagem oral diária de dexametasona a 3 mg/kg em β-ciclodextrina a 0,5% (veículo) ou apenas o veículo por 2 semanas, em um volume de 10 μL/g.

1. Ensaio FITC-dextrano para medir a permeabilidade da barreira epitelial

  1. Camundongos rápidos por 4 h antes do ensaio.
  2. Dissolva 4 kDa FITC-dextrano em PBS estéril 1x até uma concentração final de 80 mg / mL.
  3. Prepare o suficiente para 150 μL por mouse, mais 50 μL extras para a curva padrão.
    NOTA: Minimize a exposição à luz da solução de FITC-dextrana e amostras de plasma durante todo o procedimento.
  4. Contenha suavemente (scruff) cada camundongo e administre 150 μL da solução de dextrano FITC por gavagem oral.
    NOTA: Inicie um cronômetro imediatamente após administrar a primeira gavagem. Aguarde 10-15 minutos entre cada camundongo subsequente para permitir tempo suficiente para que a eutanásia e os procedimentos a jusante sejam realizados de maneira escalonada, minimizando a variabilidade devido às diferenças de tempo.
  5. Mantenha os ratos sem comida por 4 h.
  6. Eutanasiar camundongos usando isoflurano a 5% (anestésico inalante administrado com 1,5 L de oxigênio/min) seguido de dióxido de carbono de acordo com o procedimento institucional padrão. Colete sangue por punção cardíaca com agulhas de 25 G e seringas de 1 mL.
  7. Adicione imediatamente 10 μL de solução de ácido-citrato-dextrose a cada 100 μL de sangue coletado como anticoagulante. Misture bem por inversão.
  8. Centrifugue a 1500 x g por 10 min a 4 ° C e transfira cuidadosamente o plasma (sobrenadante) para tubos de microcentrífuga de 1,7 mL rotulados. Mantenha as amostras no gelo e protegidas da luz até a análise.
  9. Dilua cada amostra de plasma 1:2 e 1:10 com 1x PBS.
  10. Adicione 100 μL de cada diluição a uma placa opaca de 96 poços em duplicatas.
  11. Realize diluições seriais 1:2 do estoque original de 80 mg/mL de FITC-dextrano usando 1x PBS para atingir as seguintes concentrações: 3000, 1500, 750, 375, 187,5, 93,8, 46,9, 23,4 e 0 ng/mL. Adicione 100 μL de cada concentração à placa de 96 poços em duplicata.
  12. Meça a fluorescência com excitação de 485 nm e emissão de 535 nm usando um leitor de microplacas.

2. Avaliação anatomopatológica macroscópica

  1. Após a coleta de sangue para o ensaio FITC-dextrano, excise cuidadosamente todo o intestino delgado.
  2. Remova suavemente qualquer gordura e tecido conjuntivo aderidos.
    NOTA: Tenha cuidado ao manusear o tecido, pois as regiões doentes podem ser frágeis e propensas a rasgar.
  3. Coloque o intestino sobre uma folha de papel branco em branco para obter o contraste ideal. Inspecione visualmente o tecido em busca de sinais macroscópicos de doença. A inflamação é tipicamente localizada nos 10 cm distais do intestino delgado no camundongo SHIP-/-.
    NOTA: As principais características macroscópicas a serem avaliadas incluem mudanças de cor, com regiões mostrando vermelhidão ou hiperemia visível em relação ao tecido adjacente de aparência normal. Além disso, examine se há espessamento do tecido, pois as áreas afetadas podem parecer inchadas, edemaciadas ou rígidas à palpação suave. Procure a presença de sangue, que pode aparecer como manchas hemorrágicas visíveis, descoloração vermelha escura ou sangue aderente.
  4. Alinhe o intestino ao lado de uma régua para escala e tire uma foto para documentar os achados patológicos grosseiros.

3. Avaliação histológica

  1. Remova o conteúdo intestinal lavando suavemente o lúmen com 1x PBS usando uma seringa. Não aplique muita força no tecido, pois isso pode distorcer a arquitetura das vilosidades e criptas.
  2. Identifique e colha aproximadamente 1 cm do íleo distal que é mais representativo da patologia macroscópica. Inclua regiões afetadas visíveis, se presentes. Para comparações (SHIP+/+ vs. SHIP-/-), certifique-se de que os tecidos sejam coletados de locais anatômicos correspondentes.
    NOTA: Para avaliação inicial da eficácia do tratamento, recomenda-se preparar o íleo como um rolo suíço. Este método fornece uma visualização global da doença e reduz o viés de amostragem.
  3. Coloque o tecido em um de histologia, colocando-o entre as esponjas para evitar dobras.
  4. Para hematoxilina e eosina (H & E) e coloração tricrômica de Masson, fixe o tecido em formalina tamponada neutra a 10% durante a noite a 4 ° C, usando pelo menos 10-20 vezes o volume do tecido (cerca de 5 mL por) e garantindo que todos os estejam totalmente submersos. Transfira os para etanol 70% para armazenamento, mantendo-os totalmente submersos até o processamento.
    NOTA: A formalina a 10%, um fixador contendo 3,7% de formaldeído, é um potente irritante respiratório, um sensibilizador dérmico e é classificado como cancerígeno humano. A inalação, ingestão ou contato com a pele podem resultar em toxicidade aguda, enquanto a exposição crônica pode aumentar o risco de câncer. Todos os procedimentos que envolvem formalina devem ser realizados em um exaustor químico certificado, usando equipamento de proteção individual (EPI) apropriado, incluindo jaleco, luvas resistentes a produtos químicos e proteção para os olhos. Colete os resíduos em recipientes claramente rotulados como "Resíduos de Formalina" para descarte adequado de acordo com os protocolos institucionais de resíduos perigosos. Todos os materiais contaminados com formalina (por exemplo, pontas de pipeta, lenços de papel, luvas) devem ser tratados como resíduos quimicamente perigosos e descartados seguindo os procedimentos locais de Saúde e Segurança Ambiental (EHS).
  5. Para a coloração com azul de Alcian/PAS, fixe o tecido na solução de Carnoy (etanol a 60%, clorofórmio a 30% e ácido acético glacial a 10%) a 4 °C durante a noite, usando aproximadamente 5 mL por ou 10-20 vezes o volume do tecido. Transfira os para 100% de etanol para armazenamento até o processamento.
    NOTA: A solução de Carnoy é composta de 60% de etanol, 30% de clorofórmio e 10% de ácido acético glacial. Esta mistura é altamente volátil, inflamável e tóxica. Manuseie a solução da Carnoy exclusivamente em um exaustor e armazene em recipientes hermeticamente fechados, longe de fontes de calor ou ignição. Os resíduos de Carnoy devem ser coletados em recipientes designados para solventes orgânicos mistos e descartados de acordo com as diretrizes institucionais de resíduos perigosos. Todos os materiais contaminados com a solução de Carnoy devem ser tratados como resíduos quimicamente perigosos.
  6. Incorpore os tecidos em parafina e corte seções de 5 μm para coloração.
  7. Pontue os cortes ileais corados com H&E em uma escala de 16 pontos de acordo com os critérios da Tabela 1. A pontuação final do dano histológico é determinada pela média das pontuações de 2 revisores, que são cegos para a condição experimental.
  8. Avalie os cortes transversais corados com tricrômio de Masson usando uma escala de 6 pontos com base nos critérios da Tabela 2. O escore final de fibrose é calculado como a mediana dos escores atribuídos por dois revisores independentes cegos para as condições experimentais.

4. Avaliação de citocinas

  1. Após a dissecção e remoção da amostra histológica, colete a porção restante dos 10 cm distais do íleo.
  2. Seque o tecido e registre o peso. Congelar rapidamente em azoto líquido e conservar a -80 °C para processamento futuro.
  3. Quando estiver pronto para o processamento, recupere o tecido e mantenha-o sempre no gelo.
  4. Pese as amostras de tecido. Prepare tampão de homogeneização suficiente para todas as amostras adicionando inibidores de protease a 1x PBS (aprotinina e leupeptina, cada um a 10 μg/mL). Use 10 μL de tampão por mg de tecido (por exemplo, 100 mg de tecido requerem 1 mL de tampão).
    NOTA: O tampão de homogeneização deve ser preparado fresco no dia da homogeneização para garantir que os inibidores da protease sejam eficazes.
  5. Homogeneizar o tecido ileal de espessura total em tampão de homogeneização gelado usando um homogeneizador de bancada. Certifique-se de que o homogeneizado esteja uniforme e livre de fragmentos de tecido visíveis. Enxágue bem a ponta do homogeneizador com PBS entre as amostras para evitar contaminação cruzada.
  6. Centrifugue os homogeneizados de tecido a 10.000 x g por 10 min a 4 °C.
  7. Aliquotar os sobrenadantes clarificados para evitar ciclos de congelamento e descongelamento e armazená-los a -80 °C para análise futura.
  8. Realizar ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs) em sobrenadantes clarificados para quantificar as citocinas de interesse, de acordo com as instruções dos fabricantes.
    NOTA: A densidade óptica a 450 nm foi medida usando o leitor de microplacas Varioskan LUX com software Skanlt RE 7.0.2, com comprimento de onda de referência de 570 nm para correção. O Microsoft Excel foi utilizado para análise dos dados, e os valores de absorbância dentro da faixa linear da curva padrão foram interpolados para determinar as concentrações de citocinas.

Resultados

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Camundongos SHIP+/+ e SHIP-/- de 6 semanas de idade foram gamassados por via oral com 0,5% de β-ciclodextrina (controle do veículo; n = 6/genótipo) ou 3 mg/kg de dexametasona (n = 6/genótipo) diariamente por 2 semanas. O momento e a duração do tratamento dependem do modelo e devem considerar o início e a taxa de progressão da doença, bem como se a intervenção se destina a ser profilática ou terapêutica. Um número igual de camundongos machos e fêmeas deve ser usado em experimentos. Embora não tenhamos identificado diferenças baseadas no sexo na história natural da doença em camundongos SHIP-/-, diferentes protocolos de tratamento podem mostrar respostas específicas do sexo. Nesse modelo, o tratamento profilático de 4 a 6 semanas de idade pode ser usado para prevenir o aparecimento de inflamação e fibrose, enquanto os esquemas terapêuticos realizados de 6 a 8, 8 a 10 ou 6 a 10 semanas de idade podem ser usados para avaliar a eficácia do tratamento para a doença estabelecida. A dosagem e o momento ideais devem ser guiados pela literatura e pelos estudos de titulação. Mostramos anteriormente que este regime de dosagem de dexametasona é eficaz quando administrado após o desenvolvimento da inflamação ileal.

Um cronograma recomendado para o dia da colheita é descrito na Figura 1A. A dexametasona não induziu nenhuma patologia intestinal nos camundongos SHIP+/+ com base no exame macroscópico. Os camundongos SHIP-/- exibiram áreas visíveis de vermelhidão e espessamento, indicativas de inflamação. Essas características patológicas macroscópicas estavam ausentes em camundongos SHIP-/- tratados com dexametasona (Figura 1B). Para avaliar a função da barreira intestinal, as concentrações plasmáticas de FITC-dextrano foram medidas após gavagem oral. Embora não estatisticamente significativo, os camundongos SHIP-/- apresentaram concentrações plasmáticas elevadas de FITC-dextrana em comparação com os controles SHIP+/+, sugerindo aumento da permeabilidade intestinal. O tratamento com dexametasona reduziu as concentrações de FITC-dextrano em camundongos SHIP-/- para concentrações semelhantes às observadas em camundongos SHIP+/+ (Figura 1C).

O exame histológico de cortes transversais intestinais de camundongos SHIP-/- revelou características patológicas marcantes, incluindo infiltração de células imunes, arquitetura de cripta de vilosidade interrompida, hiperplasia/hipertrofia de células caliciformes e espessamento da camada muscular (Figura 2A). Essas características se refletiram em escores de dano histológico significativamente mais altos em comparação com camundongos SHIP+/+ (p = 0,0005, Figura 2B). Não foi observado dano histológico em camundongos SHIP+/+ tratados com dexametasona. Consistente com as melhorias observadas na patologia macroscópica e na função de barreira, a dexametasona reduziu a histopatologia em camundongos SHIP-/-, embora o efeito não tenha sido estatisticamente significativo (p = 0,0981, Figura 2A e Figura 2B). A coloração tricrômica de Masson revelou deposição substancial de colágeno nos tecidos intestinais SHIP-/-, acompanhada por escores de fibrose significativamente mais altos em comparação com os controles SHIP+/+ (Figura 2C). A dexametasona atenuou efetivamente as características fibróticas em camundongos SHIP-/-, diminuindo os escores de fibrose para valores comparáveis aos dos controles SHIP+/+ (Figura 2C). Além disso, a coloração com azul de Alcian/PAS confirmou hiperplasia/hipertrofia de células caliciformes em camundongos SHIP-/-, que foi reduzida após o tratamento com dexametasona (Figura 2D).

Para avaliar as concentrações de citocinas inflamatórias, foram realizados ELISAs em homogeneizados de tecido ileal de espessura total (Figura 3A). As concentrações de IL-1β foram significativamente maiores em camundongos SHIP-/- em comparação com os controles SHIP+/+ (p = 0,0468), o que se alinha com achados anteriores correlacionando a expressão de IL-1β com a gravidade da doença neste modelo. O tratamento com dexametasona reduziu significativamente as concentrações de IL-1β em camundongos SHIP-/- (p = 0,0023). Consistente com relatórios anteriores, as concentrações de IL-6 ou TNF não diferiram entre os quatro grupos experimentais. Também medimos as concentrações das proteínas associadas aos neutrófilos mieloperoxidase (MPO) e lipocalina-2 (LCN-2) em homogeneizados ileais de espessura total como marcadores bioquímicos adicionais de inflamação (Figura 3B). As concentrações de MPO e LCN-2 foram significativamente maiores (p = 0,0031 e p = 0,0002, respectivamente) em camundongos SHIP-/- em comparação com os controles SHIP+/+, embora o aumento no LCN-2 tenha sido amplamente impulsionado por altas concentrações medidas em 2 de 6 camundongos. O tratamento com dexametasona reduziu a MPO e reduziu modestamente o LCN-2, as diferenças não foram significativas. Esses dados sugerem que a MPO é um marcador útil de inflamação em camundongos SHIP-/-, enquanto as concentrações de LCN-2 não são tão consistentes ou confiáveis.

Para investigar a relação entre características inflamatórias e fibróticas no modelo de camundongo SHIP-/-, realizamos análises de correlação de Spearman usando escores de danos histológicos, escores de fibrose e concentrações de IL-1β de tecido ileal de espessura total (Figura 4). As concentrações de IL-1β correlacionaram-se positivamente com os escores de dano histológico (r = 0,6813), indicando que o aumento da inflamação foi associado ao aumento do dano tecidual (Figura 4A). Também foi observada uma correlação moderada entre as concentrações de IL-1β e os escores de fibrose (r = 0,4117), sugerindo uma ligação entre a produção de citocinas inflamatórias e o remodelamento fibrótico (Figura 4B). Além disso, os escores de dano histológico correlacionaram-se significativamente com os escores de fibrose (r = 0,6241), sugerindo que o dano estrutural e a fibrose progridem paralelamente em camundongos SHIP-/- (Figura 4C).

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Figura 1: A dexametasona reduz a patologia intestinal macroscópica e a permeabilidade em camundongos SHIP-/-. Camundongos SHIP+/+ e SHIP-/- foram gamassados por via oral diariamente com 0,5% de β-ciclodextrina como controle veicular (CV) ou dexametasona (Dex; 3 mg/kg) de 6 a 8 semanas de idade. (A) Cronograma experimental recomendado. (B) A morfologia macroscópica do ceco e do íleo distal foi avaliada e imagens representativas são mostradas (n = 4-6 camundongos por grupo). Os asteriscos denotam áreas de vermelhidão irregular e espessamento observados no exame macroscópico. As imagens destinam-se a servir como exemplos representativos da patologia geral e não se destinam a análises quantitativas. (C) Para avaliar a permeabilidade intestinal, os camundongos foram jejuados por 4 h e gavagem com 80 mg/mL de FITC-dextrano. Após mais 4 h de jejum, o sangue foi coletado por punção cardíaca e as concentrações plasmáticas de FITC-dextrana foram medidas. Os dados são apresentados como média±DP. A barra cinza representa a faixa de concentrações plasmáticas de FITC-dextrana tipicamente observadas em camundongos C57BL/6 saudáveis quatro horas após a gavagem25. A significância estatística foi determinada pelo teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de comparações múltiplas de Dunn. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: A dexametasona reduz os escores de dano histológico, colágeno, espessura muscular e hiperplasia e hipertrofia de células caliciformes no íleo distal de camundongos SHIP-/-. Camundongos SHIP+/+ e SHIP-/- foram gamassados por via oral diariamente com 0,5% de β-ciclodextrina como controle veicular (CV) ou dexametasona (Dex; 3 mg/kg) de 6 a 8 semanas de idade. (A) Seções transversais ileais coradas com H & E de camundongos foram fotografadas com ampliação de 10x; barras de escala = 200 μm. (B) Escores de danos histológicos para camundongos SHIP+/+ e SHIP-/- expressos como mediana ± IQR. (C) As seções transversais ileais fixas foram coradas com tricrômico de Masson para fibrose; O colágeno está manchado de azul. As imagens foram tiradas com ampliação de 10x; barras de escala = 200 μm. Escores de fibrose para camundongos SHIP+/+ e SHIP-/- expressos como mediana ± IQR. (D) As seções transversais ileais fixas foram coradas com azul de Alcian/PAS. As imagens foram fotografadas com ampliação de 10×; barras de escala = 200 μm. Todas as seções são representativas de n = 6 camundongos por grupo (exceto SHIP+/+ Dex e SHIP-/- Dex, n = 5). A significância estatística para o escore de dano histológico foi determinada pelo teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de comparações múltiplas de Dunn. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: A dexametasona reduz as concentrações de IL-1β em homogeneizados ileais de espessura total de camundongos SHIP-/-. Camundongos SHIP+/+ e SHIP-/- foram gamassados por via oral diariamente com 0,5% de β-ciclodextrina como controle veicular (CV) ou dexametasona (Dex; 3 mg/kg) de 6 a 8 semanas de idade. (A) As concentrações de IL-1β, TNF e IL-6 foram medidas em homogeneizados ileais de espessura total. (B) As concentrações de mieloperoxidase (MPO) e lipocalina-2 (LCN-2) foram medidas em homogeneizados de tecido ileal de espessura total. Os dados são apresentados como média ± DP. As análises estatísticas foram realizadas por meio do teste de Kruskal-Wallis seguido do teste de comparações múltiplas de Dunn. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: As concentrações de IL-1β se correlacionam positivamente com o dano histológico e a fibrose e a fibrose se correlaciona com o escore de dano histológico em camundongos SHIP-/-. A análise de correlação de Spearman foi realizada para avaliar as relações entre o escore de dano histológico, o escore de fibrose e as concentrações de IL-1β no tecido ileal de espessura total de camundongos SHIP-/-. Correlações positivas significativas foram observadas entre (A) escore de dano histológico e concentrações de IL-1β (r = 0,6813), (B) escore de fibrose e concentrações de IL-1β (r = 0,4117) e (C) escore de dano histológico e escore de fibrose (r = 0,6241). Cada ponto de dados representa um mouse individual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Componente de danoPontuação
Perda da arquitetura da cripta0 = nenhum
1 = <25% de perda
2 = perda de 25-50%
3 = perda de 50-75%
4 = >75% de perda
Infiltração de células imunes0 = nenhum
1 = célula imune ocasional na lâmina própria
2 = aumento de células imunes na lâmina própria
3 = células imunes confluentes na lâmina própria e na mucosa rompida
4 = infiltração de células imunes em toda a seção
Hiperplasia e hipertrofia de células caliciformes0 = nenhum
1 = aumento de <50% no número e tamanho das células caliciformes
2 = Aumento de >50% no número e tamanho das células caliciformes
Ulceração0 = nenhum
1 = ulceração intermediária
2 = ulceração substancial
Edema0 = nenhum
1 = <50% da seção
2 = >50% da seção
Espessamento muscular0 = nenhum
1 = espessamento intermediário
2 = espessamento substancial

Tabela 1: Escores histológicos de danos. O dano histológico das seções transversais ileais de camundongos SHIP+/+ e SHIP-/- corados com H&E é pontuado com base nas principais características da ileíte que caracterizam o modelo de camundongo SHIP-/-, incluindo perda de arquitetura (0-4), infiltração de células imunes (0-4), hiperplasia e hipertrofia de células caliciformes (0-2), ulceração (0-2), edema (0-2) e espessamento muscular (0-2).

Componente de FibrosePontuação
Excesso de colágeno0 = Arquitetura normal; sem excesso de colágeno
1 = Leve aumento do colágeno; limitado à submucosa ou subserosa
2 = Expansão moderada do colágeno para a submucosa e muscular própria parcial, com feixes desorganizados
3 = Colágeno extenso e denso substituindo a estrutura normal, envolvendo submucosa e muscular (transmural)
Hiperplasia fibromuscular/muscularização/obliteração muscular da submucosa0 = Nenhum, conteúdo normal da submucosa muscular
1 = Aumento leve no conteúdo muscular
2 = Grande quantidade de músculo na submucosa, afeta a morfologia, mas a estrutura normal
3= O músculo obliterou todo o espaço submucoso

Tabela 2: Pontuação de fibrose. A fibrose em seções transversais ileais de camundongos SHIP+/+ e SHIP-/- corados com tricrômico de Masson foi pontuada com base nas principais características de fibrose intestinal observadas no modelo SHIP-/-, incluindo deposição excessiva de colágeno (0-3) e hiperplasia fibromuscular ou obliteração muscular da submucosa (0-3). O colágeno é avaliado quanto à extensão e ruptura arquitetônica, enquanto as alterações musculares são avaliadas com base no grau de infiltração muscular e distorção da estrutura submucosa.

Discussão

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Este protocolo descreve procedimentos para avaliar ileíte e fibrose intestinal em camundongos SHIP-/-, um modelo murino de inflamação intestinal semelhante a DC com patologia fibrótica associada. O modelo de camundongo SHIP-/- recapitula características da DC que não são comumente vistas em outros modelos de inflamação intestinal em camundongos, especificamente a localização ileal, inflamação irregular e transmural e patologia fibrótica19,26. Combinado com a facilidade de reprodução e o curto tempo para a manifestação da doença, o modelo SHIP-/- está bem posicionado como uma ferramenta poderosa para pesquisa translacional em CD19.

Neste estudo, a significância estatística para o ensaio FITC-dextrana e a pontuação histológica foram avaliadas usando o teste de Kruskal-Wallis, uma vez que esses conjuntos de dados não atenderam às suposições de normalidade exigidas para uma ANOVA de uma via, e os escores histológicos representam variáveis descontínuas e não paramétricas. Embora nossas análises não tenham produzido diferenças estatisticamente significativas entre os grupos tratados com dexametasona e tratados com veículo, observamos tendências claras. A dexametasona reduziu a permeabilidade intestinal e a histopatologia de camundongos SHIP-/-, e esses efeitos podem ter atingido significância com tamanhos de amostra maiores.

Vários desafios técnicos podem surgir ao executar este protocolo. Com relação ao manuseio do tecido, os ileas SHIP-/- requerem manipulação suave durante a dissecção, pois são propensos a rasgar. Isso é particularmente importante ao preparar tecidos para imagens macroscópicas. A fixação tecidual é outro fator crítico para a análise histológica. O tecido fixado em formalina é adequado para coloração tricrômica de H&E e Masson, mas é incompatível com a coloração Alcian Blue/PAS. Em contraste, o tecido fixado por Carnoy é apropriado para coloração H & E e Alcian Blue / PAS, mas não para tricrômico de Masson. A fixação de Carnoy leva a uma coloração azul escura intensa e difusa, que obscurece a visualização do colágeno e da camada muscular. Para análise de citocinas, é essencial processar amostras em gelo, pois as citocinas são altamente sensíveis à degradação. É fundamental que a alíquota seja clarificada Ciclos repetidos de congelamento e descongelamento podem comprometer substancialmente a integridade das citocinas e minar quaisquer diferenças potenciais entre genótipos e/ou grupos de tratamento. Por fim, para garantir uma quantificação precisa, recomendamos a realização de várias diluições de cada amostra para confirmar que as leituras estão dentro da faixa linear da curva padrão do ensaio e para minimizar a interferência potencial da matriz complexa do tecido. Abordar essas considerações técnicas é essencial para gerar resultados reprodutíveis e interpretáveis, mas a variabilidade biológica inerente aos camundongos SHIP-/- também deve ser cuidadosamente gerenciada.

Existem vários aspectos críticos dos camundongos SHIP-/- que também devem ser levados em consideração e cuidadosamente controlados para garantir a reprodutibilidade e minimizar as variáveis de confusão. O microbioma intestinal tem um impacto profundo no desenvolvimento da doença e nas respostas terapêuticas em modelos murinos de DII27,28. Nosso trabalho anterior mostrou que a inflamação intestinal em camundongos SHIP-/- é dependente da microbiota e pode ser melhorada com antibióticos29. Portanto, os controles da leitegada devem ser usados para reduzir a variabilidade impulsionada pelo microbioma, e os grupos de tratamento devem ser balanceados para a origem da gaiola30. Além disso, a correspondência cuidadosa entre os sexos é essencial. Embora não tenham sido observadas diferenças baseadas no sexo na penetrância ou gravidade da doença em camundongos SHIP-/-, outros modelos de ileíte, como SAMP1/YitFc, exibem início precoce e aumento da gravidade da doença em fêmeas14,31. Como os hormônios sexuais também podem modular a composição microbiana32, a correspondência para sexo é fundamental para minimizar possíveis fatores de confusão em estudos de tratamento. Além disso, os tratamentos individuais que estão sendo avaliados podem ter eficácia diferencial em camundongos machos e fêmeas. Embora nossos achados atuais não revelem diferenças relacionadas ao sexo na doença ou na resposta terapêutica à dexametasona, a correspondência entre os sexos deve ser realizada em todos os estudos de tratamento.

Além das considerações de microbioma e sexo descritas acima, é importante incluir camundongos SHIP+/+ em estudos de tratamento para avaliar os efeitos do veículo e dos agentes terapêuticos na ausência de inflamação intestinal. Isso garante que nem o medicamento nem seu método de entrega causem ou contribuam para a patologia no intestino saudável, melhorando assim a interpretação da eficácia e segurança terapêutica.

O momento da intervenção do tratamento também é essencial e deve ser modificado de acordo com os objetivos experimentais, pois há diferenças significativas tanto na inflamação quanto na fibrose em camundongos com 4, 8 e 12 semanas de idade19,26. Os camundongos SHIP-/- desenvolvem inflamação intestinal já nas 4 semanas de idade, com todos os camundongos apresentando inflamação às 6 semanas de idade, e os marcadores de patologia fibrótica podem ser medidos já nas 6 semanas de idade e estão bem estabelecidos às 8 semanas de idade19,26. Assim, os tratamentos direcionados à inflamação ileal devem começar às 6 semanas de idade. As intervenções antifibróticas podem ser iniciadas profilaticamente em 6 semanas ou terapeuticamente entre 8-10 semanas. No entanto, o início e a gravidade da doença podem variar com o ambiente microbiano, que difere entre as instalações. Os investigadores devem primeiro determinar a cinética da doença em sua colônia antes de implementar os protocolos de tratamento. Além disso, os camundongos SHIP-/- podem apresentar uma redução de peso de até 17% em 4-5 semanas, com mais 5% em 8-10 semanas33. Animais que apresentam perda de peso profunda devem ser excluídos dos estudos, pois isso reflete uma manifestação grave da doença e pode prejudicar os resultados do tratamento relacionados à patologia intestinal.

Uma consideração importante ao analisar a progressão da doença no modelo SHIP-/- é a seleção de marcadores inflamatórios apropriados. Com base em nossa vasta experiência com o camundongo SHIP-/-, o perfil de citocinas é normalmente focado em mediadores específicos, como a IL-1β, que é conhecida por ser regulada positivamente durante a progressão da doença. No entanto, para a caracterização inicial das respostas inflamatórias ou ao avaliar novas estratégias terapêuticas, é aconselhável uma análise de citocinas multiplex. Essa abordagem imparcial permite um perfil mais amplo do meio inflamatório e pode revelar alvos inesperados relevantes para a patogênese da doença ou resposta ao tratamento.

O modelo de camundongo SHIP-/- oferece vantagens práticas que permitem reprodutibilidade e eficiência. Os camundongos SHIP-/- desenvolvem inflamação ileal espontânea e consistente e fibrose sem a necessidade de gatilhos exógenos. Isso elimina a variabilidade associada à preparação de reagentes e protocolos de dosagem não padronizados ao induzir inflamação intestinal. O início da doença é rápido, com inflamação evidente por volta de 4-6 semanas de idade e fibrose por volta de 8 semanas de idade, tornando o modelo eficiente em termos de tempo e custo. Além disso, os camundongos SHIP-/- são fáceis de reproduzir e manter, a genotipagem é direta e nenhuma estratégia de criação especializada é necessária. Isso simplifica o gerenciamento de colônias, reduz a carga de trabalho técnica e diminui o risco de introdução de variabilidade genética não intencional 19,21,26. A doença pode ser avaliada de forma confiável usando técnicas amplamente disponíveis na maioria dos ambientes de pesquisa, incluindo o ensaio FITC-dextrana, H&E e coloração tricrômica de Masson e ELISA. Esses recursos combinados suportam o design eficiente do estudo, reduzem as barreiras financeiras e técnicas e promovem a geração consistente de dados entre os laboratórios.

Embora o modelo SHIP-/- apresente vantagens exclusivas, o modelo também apresenta limitações. Como acontece com todos os modelos pré-clínicos, ele não pode replicar totalmente a natureza complexa e multifatorial da DII humana, que é influenciada por fatores genéticos, imunológicos e ambientais34. Os modelos DSS e TNBS continuam amplamente populares devido à sua simplicidade e custo-benefício. Quando combinados com modificações genéticas, esses modelos químicos podem servir como ferramentas eficazes para entender as contribuições específicas do gene para a função de barreira35. No entanto, sua principal utilidade está na modelagem da lesão epitelial aguda; eles ficam aquém de capturar a patologia imunomediada crônica que caracteriza a DC e seu mecanismo de dano epitelial induzido por agentes químicos que carecem de relevância clínica direta36. A confiança exclusiva em um modelo pode resultar em uma avaliação incompleta e/ou enganosa do potencial terapêutico, e recomenda-se o uso de vários modelos para garantir a eficácia do tratamento.

Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Este trabalho é apoiado pelas instalações de Cuidados com Animais do Instituto de Pesquisa do Hospital Infantil BC e financiamento do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá por meio da Rede Canadense de Glicômica (GlycoNet, Uma Rede de Centro de Excelência) e dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (MOP-133607 a LS). K.S. e W.M. são beneficiários das bolsas de doutorado TRIANGLE (TRaIning a New generation of researchers in Gastroenterology and LivEr program).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microtubo de 1,7mL com tampa de encaixe de pressão  DiamedSPE155-N
1x DPBS (sem cloreto de cálcio, sem cloreto de magnésio)GibcoREF 14190-144
25G x figure-materials-1” agulhas BDREF 305122Para punção cardíaca
26G x figure-materials-2” agulhasBDREF 305110Flushing intestinal
Ácido acéticoSigma-AldrichA6283Histologia
Solução de dextrose de citrato ácido (38mM de ácido cítrico, 107 mM de citrato de sódio, 136 mM de dextrose)Millipore SigmaC3821
Agulha de alimentação animal, não estéril, reutilizável, tipo 304SSMillipore Sigma CAD7900 Para gavage
Straight
Tamanho: 24G,
Lxdiam. 1 polegada. x bola de 1,25 mm,
AprotininaCayman Chemical9087-70-1Buffer de homogeneização
Seringa BD Luer-Lok estéril, uso único, 5 mLBDREF 309646Flushing intestinal
BD OptEIA Mouse IL-6 ELISA SetBD em Biociências555240
BD OptEIA Mouse TNF ELISA Set IIBD em Biociências558534
BD® Seringa Luer Slip Tip estéril, uso único, 1 mLBDREF 309659
Almofadas de espuma para biópsia quadradas, 30,2 x 25,4 x 2 mm H.Simport ScientificREF M476-1Histologia
Formalde-Fresh tamponado (Baixo odor, 10% de formalina)Fisher ChemicalSF93-4Histologia
Placas Imuno-Estéreis Transparentes de Fundo Plano, Não Estéreis de 96 PoçosTermo Científica439454
Centrífuga Refrigerada Eppendorf 5415R  Marshall ScientificEP-5415R
Álcool Etílico AnidroGreenfield GlobalP016EAANHistologia
Fita fita de tecido Fisherbrand TRU-FLOWFisher Scientific15-200-403Histologia
FITC-dextran, 3-5kDa (1g)Millipore SigmaFD4-1G
Número CAS: 60842-46-8
LeupeptinMillipore Sigma103476-89-7Buffer de homogeneização
Mouse IL-1 beta/IL-1F2 DuoSet ELISA R& Sistemas DDY401
Placa multitela de 96 poços, fundo sólidoMillipore SigmaMSSWNFX40Branco, não estéreis, não tratado
Clorofórmio OmniPurMillipore Sigma3150Histologia
Homogeneizador Polytron PT-MR2100Cinemática AG632081
Leitor de Microplacas Multimodo Varioskan LuxTermo CientíficaVL0L00D0

Referências

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