Artigo de método

Modelo de camundongo com embolia microvascular para microscopia in vivo de dois fótons usando microesferas fluorescentes de poliestireno

DOI:

10.3791/68939

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21 de novembro de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering and Physics, Amsterdam University Medical Center, University of Amsterdam, 2Amsterdam Neuroscience, neurovascular disorders, 3Amsterdam Cardiovascular Sciences

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo contém uma descrição detalhada de uma abordagem passo a passo para um modelo de camundongo crônico de janela craniana e embolia microvascular, otimizado para imagens in vivo por microscopia de dois fótons usando microsferas fluorescentes de poliestireno.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As oclusões microvasculares no cérebro são relativamente comuns, mas ainda são amplamente pouco estudadas. A taxa de eventos, as consequências de longo prazo e os possíveis mecanismos de compensação são em grande parte desconhecidos. Modelos atuais usados para estudar esses eventos, como fototrombose e injeção de micro-êmbolos, têm cada um suas próprias vantagens e limitações. Este estudo desenvolveu um protocolo detalhado que combina a preparação de uma janela craniana crônica com a indução de embolias microvasculares cerebrais por meio da injeção intra-arterial de microsferas em camundongos. Esse sistema permite imagens in vivo de longo prazo da microvasculatura e microoclusões usando microscopia de dois fótons. Microsferas são administradas por meio de um cateter colocado na artéria carótida externa (ECA), que é permanentemente ligada. Importante destacar que a artéria carótida comum (ACC) e a artéria carótida interna (ACI) permanecem intactas durante e após o procedimento, minimizando assim a perturbação do fluxo sanguíneo cerebral. Para facilitar a imagem imediata in vivo e evitar o agrupamento ou adesão das microesferas às pontas da pipeta e ao cateter, as microesferas são suspensas em uma mistura de FITC-Dextrano e 0,1% de Tween 20. A técnica de injeção foi validada usando imagens 3D post mortem in situ para determinar a distribuição das microsferas. Este estudo demonstra ainda mais sua utilidade com um exemplo in vivo de microscopia de dois fótons. Essa abordagem oferece um método consistente e robusto para induzir e estudar embolias microvasculares, permitindo a investigação de seu impacto e dinâmica de depuração usando imagens in vivo de alta resolução.

Introdução

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Um AVC isquêmico devido a embolia de uma grande artéria cerebral é um evento agudo e frequentementedevastador 1. Êmbolos também podem ocorrer em vasos mais distais. Como resultado, podem se desenvolver infartos cerebrais silenciosos (SBIs); Como o nome sugere, eles permanecem assintomáticos e normalmente são descobertos incidentalmente durante a imagem por razões não relacionadas 2,3. As SBIs são comuns e estão entre as condições cerebrovasculares mais frequentemente observadas em autópsias deidosos 4,5. Estudos epidemiológicos mostraram uma prevalência de 20% em indivíduos sem histórico de AVC. Os SBIs contribuem para disfunção cognitiva e demência, aumentam a mortalidade geral e são um fator de risco para futuros AVCs 6,7,8. Os infartos normalmente têm apenas alguns milímetros de diâmetro e estão associados à oclusão de artérias penetrantes com diâmetros de aproximadamente 100 μm. Esses penetradores dão origem a um extenso leito arteriolar e capilar. Um pequeno microtrombo passando pelas artérias penetrantes e alojando na microcirculação a jusante provavelmente permanecerá indetectável naangiografia 9. No entanto, muitos microtrombombos podem ser liberados na fibrilação atrial, placas ateroscleróticas e de outras fontes 10,11,12,13,14. Além dos microtrombos, outras micropartículas (MPs), incluindo partículas de gordura, agregados celulares e até microplásticos, podem causar embolias microvasculares. Vários estudos mostram a presença de MP plástica no sangue e no cérebro que são maiores que o diâmetro capilar de 5μm 15,16.

As oclusões microvasculares permanecem relativamente pouco estudadas em comparação com AVC agudo e SBI. Pouco se sabe sobre a taxa de eventos, consequências de longo prazo e possíveis mecanismos de compensação. No entanto, o interesse está aumentando rapidamente após a introdução bem-sucedida da trombomia mecânica no AVC, onde embolismos microvasculares podem causar comprometimento da reperfusão microvascular após aparentemente a recanalização bem-sucedida da grande artériaculpada 17. Além disso, há um aumento nas pesquisas sobre microplásticos, que podem ter efeito parcial por meio de emboliamicrovascular 18,19,20.

As oclusões microvasculares no córtex do camundongo podem ser estudadas, entre outras coisas, por microscopia multifóton, utilizando uma janela craniana. Os modelos mais comumente usados para estudar as oclusões microvasculares cerebrais são o modelo fototrombótico e o modelo microsférico. O modelo fototrombótico utiliza corantes fotossensíveis para induzir embolias em vasos selecionados (tipicamente vasos não capilares) por meio da fotoativação. No entanto, esse modelo não permite o estudo de embolias por um período mais longo devido à ativação do sistema fibrinolítico, que dissolve aembolia 21,22. Além disso, a ativação do corante sensível à luz produz espécies de oxigênio singlete, causando danos endotelials e da barreira hematoencefálica (BBB) 23. Para estudos sobre a função endotelial e da BBB durante embolias cerebrais, e os efeitos de longo prazo na circulação cerebral e na função cerebral, o modelo da microsfera é por isso preferido. O modelo de injeção de microsferas utiliza microsferas injetadas na circulação cerebral para ocluir a microvasculaturacerebral 9,24,25,26,27,28,29,30. A possível desvantagem desse modelo está no fato de que não é possível pré-determinar a localização das embolias, em contraste com o método fototrombótico31,32. A vantagem é que microesferas de diâmetros bem definidos podem ser injetadas, atingindo assim (micro-) vasos de diâmetrosespecíficos 33,34,35.

Ao longo dos anos, múltiplas abordagens para a injeção de microsferas na circulação cerebral de roedores foram desenvolvidas. Esses protocolos encontram consenso ao acessar o triângulo carótido, que consiste na artéria carótida comum (CCA), artéria carótida interna (ICA) e artéria carótida externa (ECA) para injeção intra-arterial na microsfera. O método para a injeção intra-arterial da microesfera varia entre os protocolos de várias maneiras. Primeiramente, os estudos utilizaram uma seringa 9,26,27,29,33,34 ou um cateter 25,28,30,36. Em segundo lugar, há uma variação considerável no número e tamanho das microsferas injetadas. Os diâmetros das microsferas normalmente variam entre 10 e 50 μm, com a escolha dependendo do tamanho do vaso alvo. Como regra geral, quanto maiores as microsferas, menor deve ser o número que se deve injetar, pois há menos arteríolas do quecapilares 25, 26 e 30.

Alcançar a injeção consistente de microsferas intra-arteriais continua sendo um desafio. Na prática, um grande número de microsferas é injetado, mas apenas uma fração chega à circulação cerebral. Isso é especialmente problemático para estudar os efeitos das microesferas alojadas por microscopia de dois fótons in vivo , pois o sucesso dessa técnica depende da presença de microesferas nas camadas externas do córtex do camundongo, dentro da visão através da janela craniana preparada. Escolher corantes fluorescentes apropriados para microsferas é fundamental, pois combiná-los com modelos transgênicos de camundongos e coloração intravascular pode ser desafiador devido à intensa fluorescência das microsferas e à sobreposição dos espectros de emissão.

Oclusões microvasculares são estudadas em modelos de roedores, e efeitos sinérgicos de múltiplas microsferas já foram demonstrados anteriormente em cérebros ex vivo de roedores 9, assim como a aparente extravasação dessas partículas, um processo chamadoangiofagia 33,35,37,38. Para viabilizar a investigação in vivo, foram desenvolvidos métodos para microscopia multifóton em camundongos com janelas cranianas. O objetivo do estudo atual é desenvolver e relatar um protocolo detalhado para a injeção intra-arterial de microsferas em camundongos, que otimize o estudo de seus efeitos no tecido cerebral e seu destino. A principal vantagem desse protocolo é a melhoria da eficiência da administração, minimizando a perda de microsfera e aumentando a probabilidade de sua presença no território da artéria cerebral média (MCA) dentro da área de imagem da janela craniana. O protocolo otimizado de injeção de microsferas é avaliado usando microscopia in vivo de dois fótons e imagem 3D post mortem in situ com um microtomo crio-microtomo dedicado à imagem.

Protocolo

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Todos os procedimentos envolvendo animais seguiram o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O Comitê Central de Experimentos com Animais da Holanda concedeu aprovação total (AVD11400202316817).

NOTA: Foram usados camundongos machos e fêmeas entre 2 meses e 1 ano. Ao chegar, os animais foram aclimatados por 7 dias antes de qualquer procedimento experimental. Os animais eram alojados com um máximo de 4 por gaiola, fornecidos com alimento e água à vontade e mantidos em um ciclo de 12 horas de luz e escuridão. Os camundongos NG2-DsRed e TIE2-GFP foram adquiridos (veja a Tabela de Materiais para detalhes) e criados internamente.

1. Implante craniano de janela

  1. Anestesia e cuidados pré-cirúrgicos
    1. Adicione 0,06 mg/mL de Carprofeno à água potável 1 dia antes do início da cirurgia na janela craniana.
    2. Pese o camundongo e administre 5 mg/kg de Carprofeno e 2 mg/kg de dexametasona por via subcutânea 30 minutos antes da cirurgia.
    3. Prepare a área cirúrgica posicionando uma almofada térmica com sistema de feedback na estrutura estereotáxica e cobrindo-a com um pano estéril.
    4. Coloque todos os instrumentos cirúrgicos estéreis em um segundo pano estéril.
    5. Anestesie o camundongo em uma câmara de indução com uma mistura de ar de 1 L/min (30% oxigênio e 70% ar médico) e 3-4% de isoflurano, seguido de manter a anestesia com 1,5-2% de isoflurano usando uma máscara facial.
    6. Prenda o mouse em uma moldura estereotáxica e insira a sonda termômica da almofada térmica de forma retal usando lubrificante. Aplique pomada para os olhos para evitar que ressece e ajuste a bolsa térmica a 37 °C.
    7. Administrar subcutaneamente 1,5 mg/kg de ropivacaína na linha da incisão cirúrgica 5 minutos antes da cirurgia.
    8. Limpe a pele sobre o crânio, do pescoço até logo além dos olhos, com betadine usando uma ponta de algodão.
  2. Preparação cirúrgica para fixação de barras de cabeça e janelas
    1. Usando pinças estéreis e tesoura cirúrgica, faça uma incisão inicial na pele sobre a parte posterior do crânio. Estenda a incisão da sutura lambda para frente ao longo da linha média até as suturas frontais, logo à frente do bregma (Figura 1A). Retraa cuidadosamente e remova a pele para expor totalmente os músculos temporales de ambos os lados.
    2. Aplique aproximadamente 0,1 mL de lidocaína a 1% no crânio para minimizar o sangramento.
    3. Remova o periósteo e arranhe todas as regiões do crânio onde a barra da cabeça será fixada usando uma lâmina cirúrgica. Faça os arranhões perpendiculares ao redor do crânio para garantir uma adesão firme da barra da cabeça.
    4. Limpe qualquer sangue restante com uma ponta de algodão e seque o crânio usando ar comprimido.
  3. Fixação da barra de cabeça
    1. Prepare uma mistura de cola dental em um recipiente cerâmico frio (4 °C) adicionando 100 μL de monômero a 0,1 g de polímero e misturando. Adicione 1 gota de catalisador à mistura para iniciar a solidificação rápida da cola.
    2. Aplique a cola na parte inferior da barra de cabeça. Incline levemente a barra da cabeça para o lado lateral esquerdo a partir do seio sagital e pressione sobre o crânio. Aplique cola adicional nas bordas da barra de cabeça para vedar todas as aberturas. Isso garante uma adesão firme.
    3. Faça uma mistura de cimento dentário misturando 100 μL de fluido de cimento dentário com 0,1 g de pó. Aplique o cimento em todos os lados da barra de cabeça enquanto impede que o cimento flua para o crânio na área de perfuração. Adicione uma camada adicional de cimento dentário sobre a barra de cabeça para formar um poço, permitindo a aplicação de fluidos na janela craniana (Figura 1B).
    4. Deixe a cola e o cimento secarem por pelo menos 10 minutos.
    5. Confirme a adesão firme da barra da cabeça aplicando suavemente pressão no crânio onde a craniotomia será realizada. A barra da cabeça é devidamente aderida quando o crânio não está se movendo e não aparece fluido entre o cimento dentário e o crânio.
  4. Craniotomia
    1. Prenda o rato ao suporte de imagem usando a barra de cabeça ou mantenha-o dentro da estrutura estereotáxica para fixar firmemente a cabeça do animal durante a craniotomia.
    2. Marque o alvo de perfuração da craniotomia (4 mm de diâmetro) no crânio usando um marcador de ponta fina. Localize o MCA visível através do crânio para garantir que a janela craniana esteja posicionada de forma ideal, cobrindo o máximo possível do MCA. Para confirmar o tamanho correto e a posição do alvo de perfuração, segure o vidro de cobertura acima da área marcada e ajuste o tamanho do alvo de perfuração conforme necessário.
    3. Comece a furar em círculos nas marcações sem exercer pressão no crânio, para evitar a geração de calor (Figura 1C). Resfrie o crânio aplicando soro a cada 30 segundos. Durante o resfriamento, limpe e resfrie a cabeça da furadeira mergulhando-a em água e depois secando-a com papel toalha. Remova toda a poeira óssea regularmente usando ar comprimido. Confirme o tamanho da craniotomia colocando o vidro de cobertura no crânio e ajustando a perfuração, se necessário.
    4. Continue furando em círculos até que o osso esteja suficientemente fino. Rachaduras aparecerão na área de perfuração assim que o crânio estiver quase perfurado. Certifique-se de que o osso esteja suficientemente afinado adicionando soro fisiológico para amolecer o crânio afiado e pressionando suavemente o meio do osso craniano dentro da área de perfuração. A área de perfuração é fina o suficiente quando o crânio desce uniformemente em todos os lados da área sob pressão suave. Continue perfurando até chegar a esse ponto. Não perfure o crânio; Isso pode causar danos à dura-mãe e ao tecido cerebral. Mantenha a área de perfuração embebida em LCR se a dura-máter estiver danificada ou houver sangramento.
      NOTA: Antes de remover o crânio, certifique-se de que toda a poeira óssea seja retirada da área de perfuração. Partículas residuais ósseas na dura-máter podem potencialmente iniciar o crescimento ósseo sob a janela.
    5. Limpe completamente toda a poeira óssea usando aCSF e ar comprimido. Aplique aCSF na área perfurada até que o crânio fique totalmente submerso. Usando uma agulha de calibre 27 (0,4 mm x 16 mm) ou calibre 30 (0,3 mm x 13 mm), perfure cuidadosamente o crânio afino horizontalmente (~180°), evitando danos à dura-máter-máter e ao cérebro. Empurre suavemente o osso para cima até que ele se solte, aplicando força mínima. Se o osso não se soltar facilmente, continue perfurando. Remova o crânio descolado com pinças, mantendo o cérebro submerso em LCR (Figura 1D).
    6. Lave o cérebro com aCSF, depois coloque uma esponja hemostática estéril e absorvente de gelatina suína embebida em aCSF no cérebro para controlar o sangramento local por 2 minutos. Remova cuidadosamente a esponja, mantendo o cérebro submerso no aCSF. Continue lavando com aCSF para garantir que não haja poeira óssea ou sangue no cérebro. Se o sangramento persistir, coloque uma esponja hemostática estéril e absorvente fresca, embebida em LCR, no cérebro.
      NOTA: Sangramento leve é comum durante a remoção óssea. Certifique-se de que o sangramento parou antes de colocar o vidro, pois sangramento residual pode reduzir a clareza da janela.
  5. Posicionamento do vidro de cobertura
    1. Absorva o LCR que cobre o cérebro com uma ponta de algodão, restando apenas uma camada fina. Coloque o vidro de cobertura sobre o cérebro e pressione-o suavemente contra a abertura do crânio usando micro-pinças dobradas. Certifique-se de que o vidro da cobertura fique um pouco abaixo do nível do crânio e posicionado paralelo à barra da cabeça.
      NOTA: O vidro deve ser pressionado firmemente contra o cérebro para evitar a formação de cáries e preservar a qualidade da janela. Manter o vidro da cobertura paralelo à barra da cabeça garante que ele fique perpendicular à objetiva do microscópio, melhorando a qualidade da imagem.
    2. Fixe o vidro de cobertura na barra do crânio e da cabeça com cola epóxi, aplicando nas laterais enquanto segura o vidro firmemente no lugar e paralelo à barra da cabeça.
    3. Sele todas as bordas do vidro da capa com cola para evitar exposição ao cérebro. Mantenha uma gota de LCR no cérebro durante a aplicação para evitar que a cola infiltre sob a janela ou entre em contato com a dura-mãe (Figura 1E).
    4. Deixe a cola solidificar por 5 minutos.

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Figura 1: Visão geral do protocolo de craniotomia. Exemplos detalhados de imagens e desenhos esquemáticos de etapas cruciais durante a craniotomia e a cirurgia de colocação da barra de cabeça. (A) Remoção da pele (passo 2.2). (B) Fixação da barra de cabeça (passo 2.3). (C) Perfuração da craniotomia de 4 mm (passo 2.4.3). (D) Remoção do crânio (passo 1.4.5). (E) Posicionamento do copo de cobertura (passo 1.4.7). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

  1. Cuidados pós-cirúrgicos
    1. Administre 5 mg/kg de Carprofeno por via subcutânea.
    2. Transfira o animal para uma gaiola de recuperação a 37 °C por 30 minutos. Depois, devolva à gaiola com 0,06 mg/mL de Carprofeno na água potável por até 2 dias após a cirurgia.
    3. Forneça comida embebida em 0,06 mg/mL de Carprofeno até que o animal retorne ao peso pré-cirúrgico.
    4. Permita que o animal se recupere por pelo menos 7 dias antes de realizar a cirurgia modelo de embolia microvascular.

2. Modelo de camundongo com embolia microvascular

  1. Montagem do cateter
    1. Insira a ponta de um microcateter de 20 cm de comprimento (ID 0,23114 OD 0,27432 mm) em um cateter transparente (ID 0,31 OD 0,64 mm) e sele a conexão com cola epóxi e fita. Confirme que o comprimento total do cateter é suficiente para conter pelo menos 160 μL.
    2. Insira uma agulha luer-lock calibre 27 (0,1 mm x 16 mm) na extremidade oposta do cateter transparente. Sele a ponta com cola epóxi e fita.
    3. Encha uma seringa de 1 mL com soro fisiológico e conecte-a ao travamento luer da agulha do cateter. Lave com 0,7 mL de soro fisiológico, garantindo que não haja vazamentos ou bolhas de ar.
    4. Encha o cateter com 80 μL de soro fisiológico e marque o nível atingido no cateter.
  2. Anestesia e cuidados pré-cirúrgicos
    1. Forneça ao camundongo água potável contendo 0,06 mg/mL de Carprofeno um dia antes da cirurgia de embolia microvascular.
    2. Coloque uma almofada térmica com sistema de realimentação sob um pano estéril e ajuste para 37 °C.
    3. Coloque todos os instrumentos cirúrgicos estéreis em um segundo pano estéril.
    4. Pese o rato e administre 5 mg/kg de Carprofeno por via subcutânea 30 minutos antes da cirurgia.
    5. Anestesie o camundongo usando isoflurano a 3-4% em uma câmara de indução com fluxo de gás de 1 L/min composto por 30% de oxigênio e 70% de ar cirúrgico.
    6. Transfira o camundongo para a mesa cirúrgica e mantenha a anestesia por meio de uma máscara facial que administra 1,5-2% de isoflurano a 1 L/min com 30% de oxigênio e 70% de ar.
    7. Insira uma sonda de temperatura retal lubrificada e aplique pomada para os olhos para evitar ressecamento.
    8. Posicione uma seringa de 2 mL sob o pescoço do camundongo deitado para facilitar o acesso à área cirúrgica.
    9. Prenda delicadamente as patas dianteiras à mesa cirúrgica com fita.
    10. Raspe a área cirúrgica e aplique betadine seguida de lidocaína.
  3. Incisão
    1. Verifique a profundidade da anestesia usando uma pinça no dedo do pé.
    2. Faça uma incisão na linha média de aproximadamente 0,5 cm sobre a traqueia abaixo da mandíbula usando tesoura cirúrgica e pinças de dissecação.
    3. Dissece o tecido conjuntivo superficial à fáscia cervical usando pinças de microsutura para expor os músculos esternohióides subjacentes.
    4. Separe os músculos esternohióide esquerdo e direito rasgando suavemente o tecido conjuntivo entre eles. Retraa o músculo omohióide direito caudal lateralmente com um gancho de tecido. Certifique-se de que o triângulo carotídeo direito, incluindo CCA, ICA e ECA, seja claramente visível.
  4. Preparação cirúrgica da ACC, ICA, ECA e da Artéria Parietal Posterior (PPA)
    NOTA: Evite agarrar ou beliscar o nervo vago; Mova-a apenas com cuidado para evitar efeitos adversos à saúde do animal. Não toque na traqueia, pois isso pode causar problemas respiratórios. Identifique a artéria occipital (OA), que se ramifica a partir da ICA no meio caminho entre a bifurcação em forma de Y da ICA e a origem da ECA, e a artéria tireoide superior (TA), que se ramifica do lado medial da ECA. Essas artérias são frágeis e devem ser tratadas com extremo cuidado.
    1. Remova qualquer fascia e tecido adiposo restante ao redor da ACC.
    2. Separe cuidadosamente o CCA do nervo vago.
    3. Coloque dois fios 4/0 1.5 ao redor do CCA e amarre-os frouxamente. Certifique-se de que os nós não atrapalhem o fluxo sanguíneo do CCA.
    4. Remova a fáscia e o tecido adiposo da ACI e da PPA. Liga temporariamente o PPA e todos os ramos laterais do ICA, incluindo o OA, fazendo um nó com uma rosca 4/0 1.5.
    5. Remova a fáscia e o tecido adiposo da ECA e da TA. Coloque dois nós soltos ao redor do ECA e TA usando roscas 4/0 1.5. Posicione o fio mais distal o mais longe possível da bifurcação em forma de Y e use-o para ligar permanentemente a ECA e a TA. Deixe o nó proximal solto.
  5. Preparação da solução de microsfera e carregamento de cateter
    NOTA: Prepare a solução de FITC-Dextran/microsfera pouco antes da injeção para minimizar a adesão da microesfera ao cateter.
    1. Homogeneize e sonice as microesferas de 10 μm (7,2 x 106 microsferas/mL) para obter uma suspensão uniforme de partículas individuais.
    2. Prepare 140 μL de 25 mg/mL de FITC-Dextrano 70 kDa contendo 0,1% de Tween20, depois adicione 20 μL de microesferas homogeneizadas para obter 160 μL de mistura FITC-Dextran/Tween20/microesfera contendo 1,44 × 105 microesferas.
    3. Retrai brevemente a seringa conectada ao cateter para criar uma câmara de ar.
    4. Imerga a ponta do cateter na mistura preparada de FITC-Dextran/Tween20/microsfera e puxe lentamente a seringa até que a mistura esteja no cateter.
    5. Certifique-se de que não haja bolhas de ar no cateter. Se presente, esvazie a mistura em um recipiente de 0,5 mL e repita os passos 2.5.3 e 2.5.4.
    6. Coloque a seringa com o cateter carregado na bomba da seringa. Ajuste a bomba para 10 μL/min e funcione até que uma pequena gota de mistura de microesferas apareça na ponta do cateter.
  6. Inserção de cateter e injeção de microsferas
    NOTA: Evite injetar bolhas de ar no sistema vascular, pois isso pode causar efeitos adversos graves ou morte. Bolhas de ar podem resultar de carga incorreta do cateter ou vazamentos no tubo.
    1. Coloque um clipe de vaso no ICA e aperte um dos nós proximais previamente preparados ao redor do CCA (veja o passo 2.4.3).
    2. Usando microtesouras, faça uma pequena incisão diagonal no ECA aproximadamente 0,5 mm distal ao fio de ligadura. Certifique-se de que o tamanho da incisão seja um pouco menor que o diâmetro do cateter.
    3. Absorva qualquer sangue com um pano ou tecido estéril, garantindo que nenhum sangue continue vazando além das ligaduras e do clipe vascular.
      NOTA: O triângulo vascular deve permanecer livre de sangue após a incisão ECA. O sangue residual pode levar à formação de coágulos, que podem causar grandes eventos isquêmicos cerebrais ao restaurar o fluxo carotídeo ou bloquear a ECA, impedindo a injeção na microsfera.
    4. Ligue brevemente a bomba da seringa para formar uma gota de mistura de microesferas na ponta do cateter, confirmando que não resta ar na ponta do cateter.
    5. Abra a incisão ECA e insira o cateter usando micropinças finas. Evite tocar em outras superfícies durante a inserção para evitar perda da mistura de microsfera ou entrada de ar no cateter. Se a inserção falhar ou a ponta do cateter tocar uma superfície, repita o passo 2.6.4 antes de tentar novamente.
    6. Fixe o cateter no ECA apertando o ponto proximal (veja o passo 2.4.5) ao redor do ECA.
    7. Certifique-se de que não haja vazamento ou bolhas de ar dentro da vasculatura iniciando a bomba da seringa a 10 μL/min. Se algum estiver presente, desconecte o cateter e retorne ao passo 2.6.4.
    8. Se não houver vazamento ou bolhas de ar, continue bombeando a 10 μL/min para aumentar gradualmente a pressão no cateter e na vasculatura até que seja observado um aumento visível da artéria. Para igualar a pressão arterial do animal, estabeleça pressão adequada no cateter e na vasculatura antes de reabrir o ICA e o CCA. Quando o fluxo sanguíneo é restaurado no CCA e ICA, algum sangue pode entrar no cateter, mas será posteriormente reinjetado no ICA. Confirme visualmente a injeção da mistura da microsfera na ECA e que o acúmulo de pressão é bem-sucedido ao observar o corante verde FITC preenchendo as artérias. Se isso não for observado, pare a bomba da seringa, remova o cateter e repita os passos 2.6.4 a 2.6.8.
    9. Remova o clipe do recipiente do ICA e aumente a vazão da bomba da seringa para 20 μL/min. Confirme a injeção bem-sucedida da microsfera verificando que a ICA distal da bifurcação da PPA está preenchida com corante FITC. Se confirmado, prossiga para a etapa 2.6.11; Se não, prossiga para o passo 2.6.10.
    10. Pare a bomba da seringa e afrouxe a ligadura PPA. Reposicione a ligadura da PPA mais distal em relação à bifurcação ICA-PPA, depois aperte a ligadura. Volte para o passo 2.6.9.
    11. Remova a rosca que ligava o CCA para permitir que a mistura da microesfera flua para o ICA.
    12. Solução de problemas em caso de fluxo retrógrado durante a injeção da mistura da microsfera:
      1. Se ocorrer fluxo retrógrado da mistura de microsferas para a CCA, diminua o fluxo da bomba de seringa para 10 μL/min.
      2. Se o fluxo retrógrado continuar, comprima suavemente o ECA, ICA e CCA usando micro-pinças para garantir que não haja obstrução do fluxo devido a um trombo.
      3. Confirme visualmente que não há êmbolo de ar dentro da vasculatura. Um êmbolo de ar pode ser reconhecido como uma seção transparente dentro do vaso.
      4. Se houver um êmbolo de ar, pare a bomba da seringa e mova o êmbolo de ar para a ECA comprimindo suavemente a artéria usando micro-pinças. Ligue o CCA e coloque um clipe de embarcação no ECA. Remova o cateter e o embolo de ar e volte ao passo 2.6.4.
      5. Se não houver obstrução, mas o fluxo retrógrado continuar, feche a CCA usando um clipe de vaso e retorne ao passo 2.6.10.
        NOTA: O fluxo retrógrado da mistura da microsfera para a CCA não deve ocorrer, pois pode indicar reabertura inadequada da ICA, embolia aérea ou formação de trombo com efeitos potencialmente prejudiciais ao resultado do experimento.
    13. Interrompa a injeção da microsfera desligando a bomba da seringa assim que a mistura no cateter atingir a marca de 80 μL (veja o passo 3.1.4). Um total de 80 μL de FITC-Dextran/Tween20 com 7,2 x 10 microsferas é injetado.
  7. Conclusão do procedimento
    1. Ligue o CCA usando o nó preparado restante (veja o passo 2.4.3) e feche o ICA com o clipe do navio.
    2. Remova o cateter do ECA mantendo a rosca que fixa o cateter no ECA na mesma posição.
    3. Liga permanentemente a ECA apertando a rosca que prendia o cateter.
    4. Remova o clipe do vaso e as roscas ao redor do CCA, ICA e PPA para restaurar o fluxo sanguíneo. Umedecida a área cirúrgica com algumas gotas de soro fisiológico.
    5. Suture a pele com uma agulha curva 3/8 de corte reverso de 12 mm e uma sutura de seda 3-0 (USP) não absorvível.
  8. Cuidados pós-cirúrgicos
    1. Administrar subcutaneamente 5 mg/kg de Carprofeno.
    2. Transfira o animal para a gaiola de recuperação (~33 °C) por 30-60 minutos. Devolva o animal à gaiola quando estiver totalmente recuperado.
    3. Nos primeiros 2 dias, deixe a comida de molho por 10 minutos em 0,06 mg/mL de Carprofeno e forneça ao animal, complementando a água potável com 0,06 mg/mL de Carprofeno. Após esse período, continue administrando comida embebida sem Carprofeno até que o animal retorne ao peso pré-cirúrgico.
    4. Monitore o animal várias vezes ao dia nos primeiros 2 dias, depois 3 vezes por semana. Eutanasie o animal se um objetivo humano for alcançado.
      NOTA: Os desfechos humanos são definidos de acordo com a Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu. Além disso, eutanasie qualquer animal se ele apresentar sinais de isquemia, como comportamento circular ou paralisia, pois o modelo de embolia microvascular não deve causar um evento isquêmico grave.

figure-protocol-2
Figura 2: Cirurgia de embolia microvascular. Exemplos detalhados de imagens e desenhos esquemáticos de etapas cruciais durante a cirurgia de embolia microvascular. (A) Preparação das ligaduras CCA (2x), ECA (2x), TA, OA e PPA (passo 2.4). (B) Ligadura (Temporal) da ACC (1ª) e ECA, seguida do fechamento da OA e PPA e fechamento temporário da ICA com um clipe vascular, possibilitando uma incisão na ECA sem sangramento (passo 2.6.2). (C) Colocação do cateter no ECA dissecado, que são amarrados com o segundo ponto (passo 2.6.7). (D) Abertura da sutura proximal ao redor da ACC e remoção do clipe do vaso da ACI para restaurar o fluxo sanguíneo, seguida pela injeção da mistura de microsferas na ACI (passo 2.6.10). CCA = Artéria Carótida Comum; ECA = Artéria Carótida Externa; TA = Arteria tireoide; OA = Arteria Occipital; PPA = Artéria Pterigopalata; ICA = Artéria Carótida Interna. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Imagem in vivo

  1. Microscopia de dois fótons
    1. Coloque o animal no suporte de imagem de dois fótons do microscópio para imagem in vivo pós-operatória. Mantenha anestesia leve com 1,2% de isoflurano em uma mistura de 1 L/min de 30% de oxigênio e 70% de ar, e monitore a frequência e profundidade da respiração. Veja a Tabela Suplementar 1 para detalhes da configuração do microscópio.
    2. Localize microesferas alojadas pela janela craniana usando um objetivo 10x (10x/0,30 DRY) e iluminação com lâmpada de mercúrio. Depois, mude para imagem de dois fótons com um objetivo de imersão em água de 25x (25x/0,95 ÁGUA). Veja a Tabela Suplementar 2 para as configurações de imagem.
    3. Registre os Z-stacks ao redor da microsfera de interesse.

4. Análise post mortem

  1. Ponto final experimental para imagem in situ
    1. Quando o desfecho experimental for alcançado, eutanasia o animal por luxação cervical sob > isoflurano a 4% em uma mistura de 1 L/min de 30% de oxigênio e 70% de ar medicinal.
  2. Imagem cerebral in situ
    1. Extrair o cérebro, insuflá-lo em solvente de sódio (Sigma) a 3,0% de carboximetilcelulose misturado com tinta preta 0,1% (VWR) e congelar a −20 °C por pelo menos 24 horas.
    2. Imagine o cérebro usando um pequeno Sistema de Criomrotômo de Imagem Fluorescente 3D feito sob medida (small-3D-FICS) anteriormente descrito por Juch R.N.S. et al.40. Configure o sistema para cortar o cérebro verticalmente em seções de 16 μm e imagem com resolução de 13,66 × 13,66 μm. Consulte a Tabela Suplementar 3 e a Tabela Suplementar 4 para as configurações de imagem e especificações do sistema. Analise as imagens usando o softwareArticulus 41.
  3. Imagem in situ do camundongo inteiro
    1. Remova a pele, os dentes e a cauda do animal.
      NOTA: A remoção da cauda é opcional, mas aumenta a velocidade de imagem.
    2. Infundir o animal em solvente de sódio carboximetilcelulose 3,0% (Sigma) misturado com 0,1% de tinta preta (VWR) e congelar a −20 °C por pelo menos 24 horas.
    3. Imagine o animal usando um grande Sistema de Criomrôtomo de Imagem Fluorescente 3D feito sob medida (grande-3D-FICS), conforme descrito anteriormente 42. Configure o sistema para cortar seções de 25,9 μm com resolução no plano de 26,09 μm. Veja a Tabela Suplementar 5 e a Tabela Suplementar 6 para as configurações de imagem e especificações do sistema. Analise as imagens usando o softwareArticulus 41.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Imagem post mortem in situ

O sucesso da cirurgia de embolia microvascular foi confirmado por imagens in situ post-mortem de corpo inteiro e cérebro completo, 4 dias após a cirurgia de embolia microvascular (Figura 3A). A fatia sagital de um camundongo mostra o alojamento de microsferas no cérebro. As Figuras 3B e C mostram um exemplo de um cérebro de camundongo extraído, 1 dia após a cirurgia de embolia microvascular. As microsferas estavam predominantemente alojadas no hemisfério ipsilateral, no território de fluxo das artérias cerebrais média e anterior. A contagem de microesferas em fatias cerebrais aumentou significativamente quando Tween20 foi adicionada à mistura (Figura 3E). O monitoramento do peso durante a recuperação após a cirurgia de microembolia mostra que os camundongos perderam menos peso e se recuperaram mais rápido após a cirurgia quando injetados com uma mistura de microesfera que continha Tween20 (Figura 3F).

figure-results-1
Figura 3: Distribuição das microesferas no camundongo após cirurgia de embolia microvascular. Localização in situ de microesferas de 10 μm no mouse visualizada usando o softwareArticulus 41. (A) Exemplo no plano sagital de um camundongo inteiro fotografado com o grande 3D-FICS após cirurgia de embolia microvascular. (B-D) Imagens representativas axiais, coronais e sagitais de um cérebro de camundongo, imagens usando o pequeno 3D-FICS. (E) Número médio de microsferas detectadas por 50 μm de seções cerebrais coronais aproximadamente em bregma ± 0,5 mm para as condições Controle e Tween20. As barras representam a média ± o desvio padrão. As medições individuais são mostradas como pontos. A comparação estatística foi realizada usando um teste t desparelado; O valor p é indicado no gráfico. Valores atípicos foram identificados e removidos usando o método de intervalo interquartil (IQR) (n = 1 para ambos os grupos), resultando em um tamanho final de grupo de n = 3 para controles e n = 14 para Tween20. (F) Mudanças normalizadas de peso ao longo do tempo após cirurgia de embolia microvascular no momento 0. Os pesos foram normalizados para o nível de base de cada animal na cirurgia. As linhas mostram a média ± DS por grupo (Controle, n = 4; Tween20, n = 5) com Control em azul e Tween20 em laranja escuro. A significância estatística entre os grupos em cada ponto temporal foi avaliada usando testes t de duas caudas sem pareamento. (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Injeção de microsferas e microscopia de dois fótons in vivo

Durante a injeção de microsferas, cateteres revestidos com 5% de BSA mostraram muitas microesferas aderidas à superfície do cateter, e microesferas em fluxo frequentemente estavam agrupadas, o que pode causar oclusões maiores (ver Vídeo Suplementar 1). Além disso, adicionar 5% de BSA à mistura da microsfera para evitar adesão e agrupamento não é desejável devido à possível resposta imune na injeção43,44. Para contornar isso, uma solução Tween20 de 0,1% foi usada na mistura de microsferas, resultando em um número visivelmente maior de microesferas fluindo pelo cateter e no número desejado (> 20) de microesferas na janela de imagem (Figura 4 e Vídeo Suplementar 2). A Figura 4A,B mostra uma imagem geral da microscopia de fluorescência do córtex cerebral 0,5 h após a cirurgia de embolia microvascular. Cada ponto branco representa uma microsfera que oclui um capilar na microvasculatura cerebral. A Figura 4C,D mostra as imagens do z-stack de dois fótons como exemplo, a projeção 2D. Microsferas estão causando embolias microvasculares cerebrais com perfusão comprometida, indicada pela ausência de corante intraluminal a jusante da microsfera (Figura 4E e Vídeo Suplementar 3). Além disso, essas embolias causam perturbação da BBB com extravasação do corante FITC-Dextrano (Figura 4F,G).

Esses resultados estão de acordo com o baixo número de microesferas aderidas ao cateter e o agrupamento mínimo de microsferas, observado no cateter durante a injeção da mistura microsfera e pré-adolescente. No entanto, um grande número de microsferas se agrupou nos últimos 20 μL da mistura de microsferas no cateter, que não deve ser injetado para evitar a possível ocorrência de um grande infarto (veja Vídeo Suplementar 4).

figure-results-2
Figura 4: Microscopia in vivo de dois fótons de microsferas alojadas. Exemplos de imagens fluorescentes in vivo e de dois fótons de microesferas alojadas no córtex do camundongo. (A) Visão fluorescente através da janela craniana das microsferas da loja. (B) Imagem fluorescente do ROI selecionado. (C,D) Imagens de microscopia de dois fótons de microesferas aprisionadas na microcirculação cerebral com ROI selecionado para imagens detalhadas. Imagens da pilha Z são representadas em 2D calculando o desvio padrão das intensidades dos pixels ao longo da pilha Z. (E-G) Imagens representativas in vivo de microscopia de dois fótons mostrando três embolias microvasculares cerebrais. Setas vermelhas destacam áreas de extravasação FITC-Dextrana, indicando perturbação da BBB e vazamento de corante. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela Suplementar 1: Especificações do sistema de microscópio de dois fótons. Por favor, clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela Suplementar 2: Configurações de microscópio de dois fótons para FITC-dextrano e imagem de microsfera. Por favor, clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela Suplementar 3: Configurações do sistema Criomrotônomo para imagem fluorescente 3D pequena com microesferas azuis para imagem cerebral de camundongo. Por favor, clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela Suplementar 4: Especificações do sistema Criomrômboto de imagem fluorescente 3D pequeno para imagem cerebral de camundongos com microesferas azuis. Por favor, clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela Suplementar 5: Configurações do sistema Criomicrotome de imagem fluorescente 3D grande para imagem de camundongos inteiros com microsferas vermelhas. Por favor, clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela Suplementar 6: Grandes especificações do sistema de criomrotômo de imagem fluorescente 3D para imagem de camundongos inteiros com microesferas vermelhas. Por favor, clique aqui para baixar esta tabela.

Vídeo suplementar 1: cateter revestido com BSA a 5% com adesão da microesfera à parede do cateter e agrupamento da microesfera na mistura de 25 mg/mL de microesfera FITC-Dextrano durante a injeção. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar 2: cateter revestido com Tween20 a 0,1% com alguma adesão da microesfera à parede do cateter, mas sem agrupamento de microesferas no FITC-Dextrano de 25 mg/mL com mistura Tween20 de 0,1% com microesferas durante a injeção. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar 3: Segmentação 3D de oclusões microvasculares por microesferas. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar 4: Volume final da injeção da microsfera com alta concentração microsfera em 25 mg/ml de FITC-Dextrano com mistura Tween20 de 0,1%. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.

Arquivo Suplementar 1: Adesão da microesfera à validação das pontas da pipeta. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Avaliação imunohistoquímica da cobertura CD45 em 1, 7 e 28 dias após a cirurgia de microembolia, comparando os hemisférios ipsilaterais e contralaterais. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para modelar embolias microvasculares, foi descrito um protocolo para injetar microesferas na circulação cerebral de camundongos que permite o estudo da microembolia usando microscopia de dois fótons in vivo . Esse método otimizou o aprisionamento das microesferas no cérebro, com múltiplas microesferas presas nos primeiros 500 μm do córtex ipsilateral, permitindo uma imagem eficaz de dois fótons.

Uma contagem alta de microsferas na área cortical do cérebro é crucial para a imagem in vivo de dois fótons. A perda de microsferas foi minimizada durante a preparação da mistura das microsferas ao revestir as pontas da pipeta com 5% de BSA ou 0,1% de Tween20, reduzindo a adesão da microsfera (ver Arquivo Suplementar 1). Embora o número exato de microsferas aderidas não pudesse ser quantificado, medições de intensidade média mostraram o efeito dos revestimentos. Além disso, Tween20 pareceu evitar o agrupamento de microesferas no cateter, resultando em um número visualmente maior de microesferas singulares fluindo pelo cateter, embora isso não seja quantificado. Isso reduz o risco de oclusões de grandes vasos e a possível formação de grandes regiões isquêmicas e hipóxicas, o que é indesejável dado o objetivo de modelar embolizações microvasculares. Além disso, os camundongos apresentaram menor perda de peso e se recuperaram mais rapidamente para os pesos pré-cirúrgicos quando injetados com uma mistura de microesferas contendo baixas concentrações de Tween20. Tween20 é um dispersantecomumente usado 45,46,47, portanto, as baixas concentrações usadas neste estudo não devem causar toxicidade ou efeitos adversos na integridade do BBB. Além disso, nossos dados mostram que o vazamento de BBB ocorre apenas próximo (ou após a passagem) do alojamento da microsfera e não de forma sistemática, sem causar um aumento significativo na cobertura total de leucócitos (ver Arquivo Suplementar 2), apoiando o uso de 0,1% de Tween20. No geral, a adição de Tween20 contribui para a redução do agrupamento de microesferas e um aumento na entrega de microsferas à circulação cerebral, confirmado pela contagem de microesferas em fatias cerebrais, e resulta em microesferas suficientes visíveis para microscopia de dois fótons. Embora o uso do Tween20 aumente o número de microsferas alojadas no cérebro, a variabilidade na injeção de microsferas permanece. Vários fatores podem contribuir para essa variação. Primeiro, a formação de trombos dentro do cateter ou vasculatura pode fazer com que microsferas aderam ao coágulo. Segundo, a presença de bolhas de ar pode interferir na entrega suave. Por fim, a restauração incompleta do fluxo sanguíneo no CCA ou ICA pode alterar a hemodinâmica, potencialmente promovendo a adesão da microesfera à parede do vaso ou o agrupamento dentro do lúmen. Infelizmente, essas variações não podem ser detectadas durante o procedimento de injeção.

Microsferas de poliestireno são mais densas que a água, levando a uma distribuição desigual quando a mistura de microsferas é carregada no cateter. A maioria das microsferas se estabelece próxima à parede do cateter, onde o atrito do fluido desacelera seu movimento em relação ao fluxo central mais rápido. Isso eventualmente resulta em um acúmulo de microsferas nos últimos 20 μL do cateter. A injeção dessa porção concentrada deve ser evitada, pois pode causar grandes êmbolos e eventos isquêmicos. Para evitar isso, o volume da mistura da microsfera deve ser preparado ao dobro do volume de injeção pretendido.

A cirurgia de embolia microvascular exige treinamento substancial e precisão. Um dos passos tecnicamente mais desafiadores envolve colocar um ponto ao redor do PPA, do OA e dos ramos laterais do ICA para garantir a entrega precisa da mistura de microsferas no círculo de Willis e no território do MCA. Essa etapa é complicada pela proximidade do nervo vago próxima ao CCA, pelo pequeno diâmetro dos vasos e pelo espaço cirúrgico limitado, dificultando a posição dos pontos sem causar danos nervosos ou lesão vascular.

Embora um clipe de vaso possa ser considerado uma alternativa à ligação temporária da PPA usando sutura, ele introduz riscos adicionais. Os clipes podem se soltar sem querer, levando à reabertura do recipiente. Além disso, usar um segundo clipe no PPA junto com o clipe existente no ICA aumenta a probabilidade de descolamento do clipe ICA devido ao espaço limitado. Se isso ocorrer, causará uma hemorragia significativa e, sem intervenção imediata, pode resultar na interrupção precoce do experimento. Portanto, o fechamento do PPA usando um clipe de vaso não é recomendado.

O protocolo atual utiliza um cateter, em vez daseringa 33, para injeção na microsfera. Essa abordagem oferece melhor controle sobre a velocidade e volume da injeção, e permite a injeção das microsferas de forma mais remota (por exemplo, dentro de uma modalidade de imagem, como um microscópio ou um scanner de ressonância magnética).

Escolher o ECA em vez do CCA como ponto de entrada permite que o CCA permaneça totalmente aberto durante o procedimento de injeção, o que ajuda a manter uma perfusão cerebral mais fisiológica durante todo o procedimento cirúrgico. Além disso, injetar as microesferas via ECA em vez da CCA tem outrasvantagens 48: i) redução do tempo total de operação durante a reperfusão; ii) redução do risco de sangramento durante a injeção e após a conclusão da cirurgia; iii) com o método de entrada CCA, uma estenose e trombose instáveis são formadas no CCA após a remoção daagulha 49. Isso causa perturbação do fluxo sanguíneo, além do risco de formação de microtrombos, que podem acabar no cérebro. Além disso, entrar pela CCA envolveria um grande risco de fechar permanentemente a CCA, o que pode resultar em reperfusão cerebral subótima durante o período de sobrevivência após a cirurgia, agravada pela alta variação no círculo de Willis emcamundongos 50,51

Embora totalmente otimizado, o protocolo apresenta algumas limitações. Primeiro, a observação de que microesferas viajam mais lentamente ao longo das paredes do cateter e não estão distribuídas uniformemente durante a injeção sugere que menos microesferas são entregues ao ACI do que o esperado. Apesar do uso do Tween-20 para reduzir a aderência, algumas microsferas ainda aderem às pontas da pipeta, ao tubo de Eppendorf e ao cateter. Consequentemente, o número real de microesferas injetadas provavelmente é menor do que o cálculo de 7,2 x10 4 partículas por camundongo. No entanto, microsferas suficientes alcançam a circulação cerebral para permitir a imagem via microscopia de dois fótons. O protocolo de injeção e a composição da mistura são otimizados para microesferas de poliestireno de 10 μm. Se os materiais usados (pontas, tubos, cateteres) ou o tamanho das microsferas forem alterados, tanto a solução quanto o procedimento de injeção devem ser reavaliados de acordo. Segundo, estudos que investigaram o melhor método para oclusão de grandes vasos via oclusão intraluminal do MCA mostraram que a entrada do sistema vascular por ligadura permanente da ECA resulta em isquemia dos músculos masticatório e deglutor52. Isso pode resultar em diminuição da ingestão de alimentos dos camundongos e, consequentemente, perda excessiva de peso, deterioração da função motora e aumento do déficit neurológico. No entanto, essa afirmação foi contradita por outros48. Neste estudo, o monitoramento de peso mostrou uma queda esperada após a cirurgia, mas uma recuperação rápida para os pesos pré-cirúrgicos em poucos dias, indicando que os camundongos realmente se recuperam e comem e bebem normalmente após a ligadura permanente da ECA. Embora o peso dos animais tenha sido monitorado, isso é apenas um indicador indireto do bem-estar do animal e não descarta totalmente comprometidos funcionais como déficits locais masticatórios ou motores. Nenhuma avaliação direta da recuperação funcional foi realizada, o que é uma limitação deste estudo. Outro estudo comparou a entrada do sistema vascular via CCA ou ECA e mostrou que a entrada via CCA pode resultar em reperfusão comprometida da circulação cerebral, concluindo que o método de entrada ECA épreferido 53. Terceiro, a colocação correta e segura do cateter sem introduzir bolhas de ar, coágulos sanguíneos ou vazamentos, e sem obstruir o fluxo no CCA e ICA exige prática significativa. Por fim, em contraste com outros métodos de microoclusão, como a fototrombose usando a injeção deRose-Bengal 22, não se pode prever onde as microesferas eventualmente se alojarão na circulação.

O presente estudo deliberadamente não inclui grupos controles negativos (simulados) ou positivos (fototrombose), pois estes não forneceriam valor adicional para o objetivo principal. O sucesso desse modelo é definido pelo número de microesferas alojadas na microcirculação cerebral, particularmente na área da janela craniana, para possibilitar microscopia in vivo de alta resolução. Um procedimento simulado, por definição, não produziria microesferas na área alvo e, portanto, não ofereceria comparação relevante para o ponto final da imagem in vivo . Da mesma forma, a inclusão de um modelo de fototrombose abordaria um mecanismo fisiopatológico fundamentalmente diferente e, portanto, está além do escopo deste trabalho, que foca em caracterizar o modelo de embolia microvascular em vez de comparar metodologias. Análises histológicas mais amplas das embolias e seu potencial efeito sobre a BBB ou tecido neuronal local não foram realizadas, pois o estudo foi projetado para priorizar a visualização 3D in vivo em vez da validação em nível tecidual.

O protocolo cirúrgico detalhado tanto para a preparação da janela craniana quanto para o modelo de embolia microvascular apoia a investigação confiável e reprodutível de alterações microvasculares associadas a embolia microvascular e à ocorrência de infartos cerebrais silenciosos em todo o hemisfério ipsilateral. A preparação otimizada e a injeção da mistura da microsfera aumentam ainda mais a consistência e validade dessa abordagem experimental.

Divulgações

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Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de expressar sua sincera gratidão ao Dr. Iwan Dobbe pelo desenvolvimento do software Articulus , utilizado para as reconstruções in situ de imagens 3D. Também agradecemos ao Prof. Dr. Nikolaus Plesnila por gentilmente fornecer camundongos TIE2-GFP (Jackson Laboratory, Stock No. 003658) usados para reprodução interna.

Este estudo foi financiado pela Amsterdam Neuroscience (813294 a I.M.), Amsterdam Cardiovascular Sciences (chamada de equipamentos 2021 e 2023 para I.M.) e pela Fundação Holandesa do Coração (03-006-2021-T019 até I.M.).

Esta pesquisa também é financiada pela Dutch Heart Foundation e The Brain Foundation Netherlands, sendo conduzida em colaboração e apoiada pela Dutch CardioVascular Alliance, 01-002-2022-0126 CONTRAST 2.0. Além disso, esse trabalho foi financiado em parte por meio de financiamento irrestrito da Stryker, Medtronic e Penumbra. As fontes de financiamento não estiveram envolvidas no desenho do estudo, monitoramento, coleta de dados, análises estatísticas, interpretação de resultados ou redação de manuscritos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulha calibre 27 (0,1x16 mm)Terumo-Agulha calibre 27 (Passo 2.1.2.)
Software Articulus--Software de análise 3D (Passos 4.2.2 & 4.3.3)
Betadina 30 ml (100 mg/ml)Mylan8712207037612Betadina/iodo (Passo 1.1.8. & 2.2.10.)
C& Monômero BSun Medical7111Componente da supercola (Passo 1.3.1.)
Lâminas cirúrgicas em aço carbono (nº 15)Swann-Morton205Lâmina para arranhar o crânio (Passo 1.2.4.)
Carprofeno (50 mg/ml)Zoetis-Medicação para alívio da dor (passos 1.1, 1.6, 2.2 & 2.8)
CatalisadorSun Medical7110Componente da supercola (Passo 1.3.1.)
Cateter (DI 0,31 OD 0,64 mm)Freudenberg228-0661Cateter transparente (Passo 2.1.1.)
Ganchos de papel de seda feitos pela Costom--Gancho de papel (Passo 2.3.4.)
Pontas de algodão--Ponta de algodão (Passo 1.1.8, 1.2.4 & 1.5.1.)
Vidro de coberturaInstrumentos Warner64-0724Vidro da tampa craniana da janela (Passo 1.4.2.)
Barra de cabeça de mouse feita sob medida--Barra de cabeça para suporte de imagem (Passo 1.3.2.) 
Suporte de imagem de mouse personalizado  --Suporte de mouse de imagem (Passo 1.4.1. & 3.1.1.)
Quadro estereotáxico personalizado--Quadro estereotáxico (Passo 1.1.7.)
Fluido para cementação dentáriaKulzer64707937Componente do cimento dentário (Passo 1.3.3.)
Pó de cemento dentalKulzer64707945Componente do cimento dentário (Passo 1.3.3.)
Broca dentária & nbsp;Saeshin  L-206Exercício (Passo 1.4.3.)
Dexametasona (4 mg/ml)Centrafarm-Medicação pré-operatória (Passo 1.1.4.)
Pinça dissecadoraBraun-EsculapBD023RPinças (Passo 1.2.2. & 2.3.2.)
broca de rebarba PK/100,5 (0,5mm)Belas Ciências19007-05Broca (Passo 1.4.3.)
Duratears (3,5 g)Alcon-Pomada ocular (Passo 1.1.8. & 2.2.7.)
Cola epóxi (1g)Pattex9H PSMG3XCola epóxi (Passo 1.5.2. & 2.1.1.)
Pinças micro finas retasFerramentas científicas finasDumont #5Pinça micro fina (Passo 2.6.6.)
FITC-Dextrano (70 KDa)Sigma-AldrichFD70SSolução FITC-Dextran (Passo 2.5.2.)
Isoflurano (1000 mg/g)Laboratórios Karizoo S.A.118938Anestesia (Passo 1.1.6. & 2.2.5.)
grande criomrotômetro de imagem fluorescente 3D  Feito sob medida-FICS grandes-3D (Passo 4.3.3)
Lidocaína (100 mg/ml)Aspen-Anestésico local (Passo 1.2.3. & 2.2.10)
Micro tesouras Vannas 3-3/8 polegadaBraun-EsculapOC498RMicro tesoura (Passo 2.6.2)
Pinças de Atar Micro Sutura com Cabo RedondoBraun-EsculapFD280RMicroforeceptores (Passo 2.3.3.)
Pinças de Atar Micro Sutura com Alça Redonda CurvadaBraun-EsculapFD281RMicroforeceptores dobrados (Passo 1.5.1. & 2.3.3.)
Micro clipe vascularBraun-EsculapFD562RClipe de recipiente (Passo 2.6.1.)
Microcateter (DI 0,23114 mm OD 0,27432 mm)MicrolúmenMicrocateter (Passo 2.1.1.)
Tapete Térmico do Mouse, Sonda RetalStoelting53800RBolsa térmica (Passo 1.1.2. & 2.2.2.)
Camundongos NG2-DsRedJackson Laboratory, Bar Harbor, EUA, Stock No. 008241
Monolurato de sorbitano de polietilenoglicolSigma-Aldrich9005-64-5Tween20 (Passo 2.5.2.)
FluorEsferas de Poliestireno Azul (365/415)InvitrogenF8829Microsferas azuis (Passo 2.5.1.)
FluorEsferas de poliestireno vermelho (580/605)InvitrogenF8834Microsfera vermelha (Passo 2.5.1.)
Gaiola de recuperação--Gaiola de recuperação (Passos 1.6.2. & 2.8.2.)
Corte reverso com agulha curva 3/8 (12mm) com pontoBbraun0762067Sutura (Passo 2.7.5)
Ropivacaï Ne (2 mg/ml)--Medicação   (Passo 1.1.5.)
pequeno criomicrotomo de imagem fluorescente 3D    Feito sob medidaPequenos-3D-FICS (Passo 4.2.2)
SpongostanEthiconMS0005Spongostan (Passo 1.4.6.)
Microscópio cirúrgicoEuromex Microscopen B.V.NZ.1903-BMicroscópio para cirurgia (Passo 1.2. 2.1.1.)
Tesoura cirúrgicaBraun-EsculapBC303RTesoura cirúrgica (Passo 1.2.2. & 2.3.2.)
Bomba de seringa (para seringas de 1 ml)Aparelho Havard70-2208Bomba de seringa de 1 ml (Passo 2.5.6.)
Thread, 100m,   4/0 1,5   BbraunF11340354/0.15 threads (Passo 2.4.3.)
Mouses TIE2-GFPJackson Laboratory, Bar Harbor, EUA, Stock No. 003658
Pulverizador ultra puroThorlabsCA6-EUAr comprimido (Passo 1.2.5.)
Transparente Universal de PolímeroSun MedicalT058EComponente da supercola (Passo 1.3.1.)

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hilkens, N. A., Casolla, B., Leung, T. W., de Leeuw, F. E. Stroke. Lancet. 403 (10446), 2820-2836 (2024).
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