Artigo de método

Imagem cardíaca funcional em embriões de peixe-zebra usando microscopia padrão e análise de vídeo: aplicações em pesquisa ambiental e biomédica

DOI:

10.3791/68941

⸱

10 de outubro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Medical Faculty, Department of Pathophysiology, University of Belgrade, 2Faculty of Electronic Engineering, University of Nis

Neste artigo

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Resumo

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Este protocolo descreve um método de microscopia de luz de baixo custo para avaliar a morfologia e função cardíaca em embriões de peixe-zebra, permitindo a avaliação reprodutível da cardiotoxicidade do desenvolvimento sem a necessidade de sistemas avançados de imagem.

Resumo

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O peixe-zebra (Danio rerio) é amplamente utilizado como modelo de vertebrado em pesquisas cardiovasculares devido à sua semelhança genética com os humanos, transparência óptica durante o desenvolvimento inicial e facilidade de imagem in vivo . Este manuscrito apresenta um protocolo padronizado e acessível para avaliar a morfologia e função cardíaca em embriões de peixe-zebra em 96 h pós-fertilização (hpf) usando microscopia de luz de campo claro. O método inclui coleta de embriões, triagem morfológica, imobilização em agarose, gravação de vídeo do coração batendo e análise baseada em imagem de parâmetros cardíacos, como dimensões ventriculares, volume sistólico, frequência cardíaca, fração de ejeção e débito cardíaco. Os cálculos são baseados em aproximações geométricas do ventrículo usando software de código aberto (por exemplo, ImageJ, Zembryo Analyzer). O protocolo permite a avaliação quantitativa do desempenho cardíaco usando equipamentos amplamente disponíveis, tornando-o adequado para laboratórios com recursos limitados e exames de alto rendimento. Neste estudo, 96 larvas de peixe-zebra hpf foram analisadas registrando o coração batendo sob um microscópio óptico. Os principais parâmetros cardíacos medidos incluíram dimensões ventriculares, que foram usadas para calcular o volume sistólico e a frequência cardíaca, determinados por batimentos por minuto. A partir destes, a fração de ejeção e o débito cardíaco foram derivados para avaliar o desempenho cardíaco geral. Resultados representativos de embriões saudáveis demonstraram contração ventricular consistente e índices funcionais robustos, enquanto embriões expostos ao cádmio mostraram morfologia cardíaca prejudicada e débito cardíaco significativamente reduzido. No geral, o método é importante para detectar cardiotoxicidade no desenvolvimento e fornece uma abordagem reprodutível e não invasiva para avaliar a função cardíaca in vivo durante o desenvolvimento inicial do peixe-zebra.

Introdução

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O peixe-zebra (Danio rerio) emergiu como um organismo modelo vertebrado proeminente na pesquisa cardiovascular devido à sua homologia genética com humanos, fertilização externa, transparência óptica de embriões e rápido desenvolvimento 1,2. Essas características, combinadas com custo-efetividade e escalabilidade, tornam o peixe-zebra particularmente adequado para o estudo da morfogênese cardíaca precoce, defeitos cardíacos congênitos e cardiotoxicidade do desenvolvimento3. Sua relevância é ainda reforçada pela alta conservação de genes e vias de sinalização que regulam o desenvolvimento do coração em espécies de vertebrados4. Em particular, os modelos de peixe-zebra contribuíram substancialmente para a compreensão da base genética e fisiológica da formação, remodelação e função do coração em condições normais e patológicas 5,6.

Estruturalmente, o coração do peixe-zebra é composto por um único átrio e um único ventrículo, conectados de forma linear, sem a septação típica do coração de quatro câmaras dos mamíferos. Apesar disso, o coração do peixe-zebra recapitula aspectos-chave da fisiologia cardíaca humana, incluindo a presença de camadas endocárdicas e miocárdicas, um sistema de condução cardíaca, atividade contrátil rítmica e regulação por fatores neuro-hormonais 7,8. É importante ressaltar que o coração do peixe-zebra exibe eventos morfogenéticos importantes, incluindo o loop para a direita do tubo cardíaco e a subsequente expansão e delineamento das câmaras cardíacas, semelhantes às do desenvolvimento embrionário humano9. Além disso, o coração do peixe-zebra mantém muitas das propriedades eletrofisiológicas e hemodinâmicas observadas em vertebrados superiores, incluindo propagação do potencial de ação, modulação da contratilidade e dinâmica do ciclo do cálcio7.

Dadas essas semelhanças, o peixe-zebra surgiu como um modelo fundamental em toxicologia, especialmente para avaliar como as exposições químicas afetam o desenvolvimento e a função do coração10. No entanto, uma das principais limitações neste campo continua sendo a dependência de técnicas de imagem tecnicamente exigentes. Métodos convencionais de alta resolução, como microscopia confocal ou de folha de luz, ou linhas transgênicas que expressam marcadores cardíacos fluorescentes, embora poderosos, são caros e requerem infraestrutura técnica significativa11. Essas restrições limitam a implementação mais ampla da fenotipagem cardíaca baseada em peixe-zebra, particularmente em ambientes com recursos restritos ou para aplicações que requerem triagem de alto rendimento12.

Há, portanto, uma necessidade crescente de abordagens metodológicas que permitam uma avaliação confiável da função cardíaca usando instrumentação amplamente disponível. A literatura existente contém exemplos de tais métodos simplificados, incluindo imagens baseadas em campo claro ou microscopia de luz combinadas com medições manuais ou semiautomatizadas13 , 14 . No entanto, essas técnicas nem sempre são padronizadas e muitas vezes variam entre os grupos de pesquisa em termos de protocolo, tempo e parâmetros de análise de imagem. Essa variabilidade dificulta a reprodutibilidade e limita o valor comparativo entre os estudos, particularmente em áreas como embriotoxicologia, farmacologia ou ecotoxicologia, onde os desfechos cardiovasculares quantitativos são cada vez mais usados como indicadores de segurança do desenvolvimento15.

Nesse contexto, o peixe-zebra oferece um modelo valioso para a triagem da cardiotoxicidade do desenvolvimento in vivo. Agências reguladoras e consórcios científicos têm reconhecido cada vez mais a relevância do peixe-zebra nessa área, especialmente devido à sua capacidade de detectar alterações sutis na função cardíaca que podem preceder malformações estruturais ou letalidade14. O embrião transparente permite a visualização direta do coração batendo, permitindo uma avaliação ao vivo e resolvida no tempo do desempenho cardíaco sem a necessidade de procedimentos invasivos. Além disso, a simplicidade da anatomia cardíaca do peixe-zebra facilita a quantificação da dinâmica atrial e ventricular, incluindo dimensões da câmara e parâmetros sistólicos, usando técnicas básicas de imagem15.

O objetivo geral do método descrito neste artigo é fornecer uma abordagem acessível e reprodutível para a avaliação morfofuncional do desempenho cardíaco embrionário do peixe-zebra usando microscopia de luz padrão. Ao focar na aquisição simples de vídeo e na análise de imagens post hoc, a técnica visa preencher a lacuna metodológica entre imagens de alta resolução e pontuação observacional qualitativa. Este protocolo é adaptável a diversos ambientes laboratoriais e níveis de recursos, e é especialmente aplicável a estudos toxicológicos, farmacológicos ou genéticos focados na avaliação da função cardíaca.

Além de suas vantagens práticas, o protocolo contribui para o campo, oferecendo um fluxo de trabalho consolidado e passo a passo que combina técnicas comumente usadas em um único pipeline reproduzível. Embora existam abordagens semelhantes na literatura, poucas fornecem esse nível de integração com a documentação visual, o que pode apoiar uma adoção e padronização mais amplas.

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Protocolo

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Todos os procedimentos envolvendo embriões de peixe-zebra foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais de cuidados e uso de animais aprovadas pelo comitê de ética local. A criação de peixes-zebra e a manipulação de embriões foram realizadas em conformidade com a Diretiva Europeia 2010/63/UE sobre a proteção de animais utilizados para fins científicos. Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Manutenção do peixe-zebra e coleta de embriões

  1. Manter o peixe-zebra adulto (Danio rerio) num sistema de aquário de recirculação a 28 °C± 1 °C num ciclo de 14 h de luz/10 h de escuridão.
  2. Alimente os peixes três vezes ao dia com um floco comercial rico em proteínas ou ração granular adequada para peixe-zebra.
  3. No final da tarde, transfira o peixe-zebra adulto para tanques de reprodução equipados com uma malha transparente para separar os peixes do fundo do tanque. Use uma proporção macho para fêmea de 2:3, separada durante a noite por uma divisória removível.
  4. Na manhã seguinte, remova a divisória e adicione 50-100 mL de água fria do aquário para desencadear a desova.
  5. Após a fertilização (dentro de 30-60 min), remova os peixes adultos do tanque de reprodução para evitar a predação de embriões.
  6. Colete embriões usando uma pipeta de plástico Pasteur e transfira-os para placas de Petri estéreis cheias de meio embrionário E3.
    NOTA: O meio embrionário E3 é uma solução salina tamponada que imita a composição iônica do fluido extracelular do peixe-zebra. Prepare o meio E3 dissolvendo 580 mg de NaCl, 27 mg de KCl, 97 mg de CaCl2 · 2H2O e 163 mg de MgCl2 · 6H2O em aproximadamente 800 mL de água destilada ultrapura. Ajuste o pH para 7,2 usando 1 N NaOH ou HCl. Uma vez que o pH esteja ajustado e estável, traga o volume total para 1.000 mL com água destilada. Esterilize a solução filtrando-a através de um filtro de membrana de 0,22 μm. Adicione 100 μL de azul de metileno a 1% por litro para evitar o crescimento de fungos. Conservar o meio E3 preparado a 4 °C e aquecer à temperatura ambiente antes de utilizar.
  7. Incubar embriões a 28,5 °C em uma incubadora com ciclo claro/escuro controlado (14 h/10 h).
    NOTA: Limite o número de embriões por placa de Petri (por exemplo, 50 por placa de 100 mm) para evitar superlotação, que pode causar hipóxia e defeitos de desenvolvimento.
  8. Substitua o meio E3 diariamente para manter as condições ideais de desenvolvimento.

2. Seleção de embriões morfologicamente normais

  1. Aproximadamente 6 h após a fertilização (hpf; tempo decorrido desde a fertilização), transfira os embriões fertilizados para uma placa de Petri limpa contendo meio E3 fresco.
  2. Examine os embriões sob um estereomicroscópio com ampliação de 40x.
  3. Descarte todos os embriões que apresentem sinais de anormalidade no desenvolvimento, incluindo:
    1. Embriões coagulados: Identifique por sua aparência opaca ou branca, textura granular e ausência de estruturas internas distinguíveis. A coagulação é um sinal de inviabilidade e geralmente ocorre nas primeiras horas após a fertilização.
    2. Atraso no desenvolvimento: Exclua embriões que não progrediram para o estágio morfológico esperado (por exemplo, falta de epibólia ou arranjo celular irregular), sugerindo viabilidade prejudicada.
    3. Anormalidades do saco vitelino: Procure sacos vitelinos, irregulares ou assimétricos que possam indicar desenvolvimento defeituoso ou desequilíbrio osmótico.
    4. Malformações externas: Exclua embriões com eixos corporais torcidos, distribuição irregular de massa celular ou formas anormais do córion.
    5. Baixa integridade do córion: Evite usar os embriões com córions colapsados, enrugados ou rompidos, pois eles podem estar sujeitos a estresse mecânico ou osmótico.
  4. Reter apenas embriões que atendam a todos os seguintes critérios: (1) Forma corporal transparente e simétrica, (2) Progressão epiboly uniforme com camadas celulares lisas, (3) Blastoderma claramente visível e córion esférico intacto.
    NOTA: Com 6 hpf, um embrião de peixe-zebra morfologicamente normal é em forma de cúpula com um blastoderma claramente definido envolvendo a parte superior da gema. O citoplasma deve ser distribuído uniformemente, sem manchas granulares e sem sinais de fragmentação ou aglomeração.

3. Imagem cardíaca usando microscopia de luz

  1. A 96 hpf, montar os embriões individualmente em placas de Petri com fundo de vidro de 35 mm preenchidas com meio E3.
  2. Prepare agarose de baixo ponto de fusão a 1,2% em meio E3 e pré-aqueça a 37-38 °C. Mantenha a temperatura usando um bloco de calor ou banho-maria.
  3. Incorpore cada embrião em agarose e oriente-o suavemente lateralmente usando uma pinça fina antes que a agarose se solidifique.
    NOTA: Certifique-se de que o coração esteja claramente visível e voltado lateralmente, com o átrio e o ventrículo no mesmo plano focal.
  4. Use um microscópio de luz invertida equipado com uma câmera digital para gravar vídeos de alta resolução de 30 segundos focados especificamente na região cardíaca dos embriões de peixe-zebra. Capture vídeos com ampliação de 40× ou 100× para garantir uma visualização clara das estruturas cardíacas e batimentos cardíacos.
    1. Grave os vídeos a uma taxa de quadros de 30 quadros por segundo (fps) em formatos não compactados ou minimamente compactados (por exemplo, AVI ou MOV) para preservar a qualidade da imagem e permitir uma análise precisa da dinâmica do movimento cardíaco. Essa configuração permite uma avaliação detalhada de parâmetros funcionais, como frequência cardíaca, ritmo de contração e morfologia da câmara.

4. Análise de imagem e medição da função cardíaca

  1. Medições manuais no ImageJ
    1. Importar vídeos. Abra vídeos no ImageJ usando Arquivo > Importar > AVI. Se necessário, converta o vídeo em uma pilha de imagens por meio de Pilhas de > de imagens > Converter imagens em pilha.
    2. Calibre a escala de medição. Use Analisar > Definir escala, insira o diâmetro de campo conhecido (por exemplo, 4 mm para uma objetiva de 10×) e ative a opção Global para aplicar a escala em todas as medições.
    3. Defina regiões de interesse (ROI). Use as ferramentas ROI (linha, polígono, retângulo) para marcar os eixos ventriculares longo e curto durante a sístole final e a diástole final (Figura 1). Gerencie ROIs por meio de ferramentas de análise > > gerenciador de ROI.
  2. Medir os diâmetros e áreas para calcular os parâmetros funcionais (Arquivo Suplementar 1)
    1. Determine a área da superfície ventricular (usando a aproximação da elipse) usando a Equação 1:
      VA = ((D_L - D_S)/2) × π (1)
      Onde DL = diâmetro longo, DS = diâmetro curto.
    2. Estime o volume ventricular no pronto-socorro e no SE usando a fórmula do volume elipsóide (Equação 2)
      VV = (1/6) × π × D_L × D_S² (2)
    3. Calcule a mudança de área fracionária (FAC) e o encurtamento fracionário (FS) usando a Equação 3 e a Equação 4:
      FAC (%) = ((VAD - VAS) / VAD) × 100 (3)
      FS (%) = ((D_L - D_S) / D_L) × 100 (4)
      Onde VAD = área ventricular no DE; EVA = área ventricular em ES; DDL = eixo longo em ED; DSS = eixo curto em ES.
    4. Determine o volume sistólico (SV) usando a Equação 5:
      SV = VVD - VVS (5)
    5. Calcular a fração de ejeção (FE) utilizando a equação 6:
      FE (%) = (SV / VVD) × 100 (6)
  3. Análise automatizada no ZembryoAnalyzer
    1. Inicie e carregue o vídeo capturado. Abra o ZembryoAnalyzer (disponível em: https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyser) e use Arquivo > Abrir vídeo para importar o vídeo desejado.
    2. Execute a detecção automática da região do coração. Clique no botão Detectar coração para permitir que o software localize automaticamente a região de interesse (ROI) com base nas flutuações de brilho nos quadros de vídeo. Ajuste o ROI manualmente, se necessário, usando as ferramentas de retângulo, elipse ou polígono.
    3. Realize a estimativa automática da frequência cardíaca. Deixe o software analisar as alterações de brilho dentro do ROI detectado. A frequência cardíaca é calculada identificando picos periódicos de intensidade. O algoritmo aplica filtragem de limite para remover ruídos e falsos positivos, garantindo a detecção precisa da batida.
    4. Exporte os resultados. Exporte os dados de frequência cardíaca e os gráficos de intensidade correspondentes usando Exportar > PDF ou Exportar > Excel. Opcionalmente, salve os dados brutos no formato CSV ou JSON para processamento estatístico downstream.
  4. Calcule o débito cardíaco (DC) usando a Equação 7:
    CO = SV × FC (7)

5. Avaliação da aplicabilidade do protocolo em testes de cardiotoxicidade usando tóxicos

  1. Pesar o cloreto de cádmio e preparar uma solução de trabalho, dissolvendo-o directamente em meio E3 até uma concentração final de 3 mg/l.
  2. Transfira os embriões para placas de Petri contendo a solução de cádmio 24 h após a fertilização (hpf).
  3. Incubar os embriões na solução de cádmio até 96 hpf a 28 °C± 1 °C com um ciclo de 14 h de luz / 10 h de escuridão.
  4. Substitua a solução de cádmio diariamente para manter uma exposição consistente.
  5. A 96 hpf, gravar vídeos cardíacos de alta resolução, conforme descrito anteriormente, dos embriões para posterior medição e análise dos parâmetros da função cardíaca.
    NOTA: Use este protocolo de exposição ao cádmio para simular a toxicidade cardíaca no desenvolvimento em embriões de peixe-zebra, conforme descrito em um estudo anterior16.

6. Gerenciamento de dados e réplicas

  1. Registre todas as medições em planilhas estruturadas. Inclua o ID do embrião, o grupo de tratamento e todos os parâmetros calculados.
  2. Certifique-se de que pelo menos 20 a 30 embriões por grupo sejam analisados quanto à confiabilidade estatística.
    NOTA: As gravações de vídeo da região cardíaca podem ser armazenadas e analisadas posteriormente sem comprometer a precisão das medições morfométricas ou funcionais. Em nossas comparações internas, os resultados das análises imediatas e tardias foram consistentes entre os principais parâmetros cardíacos, apoiando a reprodutibilidade da avaliação tardia baseada em vídeo.

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Resultados

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Este protocolo permite a análise quantitativa do desenvolvimento cardíaco do peixe-zebra às 96 h pós-fertilização (hpf), incluindo parâmetros estruturais e funcionais, como tamanho do ventrículo, contratilidade, volume sistólico e fração de ejeção.

A Figura 2 mostra imagens representativas de campo claro do ventrículo do peixe-zebra no final da diástole (ED) e no final da sístole (ES), juntamente com gráficos de barras corresponde...

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Discussão

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Uma das etapas importantes deste protocolo é a identificação e seleção precisas de embriões morfologicamente normais às 6 h pós-fertilização (hpf). Embriões que exibem sinais de coagulação, atraso no desenvolvimento ou anomalias estruturais podem comprometer significativamente a consistência e a interpretabilidade das medidas cardiovasculares. A remoção precoce de embriões inviáveis ou malformados garante uma linha de base confiável para avaliar o desenvolvimento e a função do coração. A...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Ciência, Desenvolvimento Tecnológico e Inovação da República da Sérvia, por meio de um acordo de financiamento institucional com a Universidade de Belgrado, Faculdade de Medicina, para a implementação e financiamento de atividades de pesquisa em 2025. O número de registro do contrato para financiamento institucional em 2025 é 451-03-137/2025-03/200110. Solicitamos que este número seja incluído nos agradecimentos de todas as publicações decorrentes dos subprojetos aprovados.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,22 & micro; Filtro de membrana mMilliporeSLGP033RS0,22 & micro; Filtro de membrana m
Solução HCl 1 NSigma-Aldrich320331Solução de ácido clorídrico para ajuste do pH
Solução 1 N NaOHSigma-Aldrich72068Solução de hidróxido de sódio para ajuste do pH
Peixe-zebra adulto (Danio rerio)Instalação local de criaçãoN/AOrganismo-modelo
Aquários de reprodução com malha//Separação dos adultos para desova
CaCl?· 2H? OSigma-AldrichC5670Diidratado de cloreto de cálcio, grau reagente
Cloreto de cádmioSigma-Aldrich202908Tóxico usado para exposição em 3 mg/L
Alimentação comercial para peixes-zebraMini Gran, Nutri Pet, Gornji Milanovac/Alimentação em flocos ou granular de alta proteína adequada para peixe-zebra
Câmera Digital (microscópio)Fotônica HamamatsuORCA-Flash 4.0 V3Câmera para gravação de vídeo a 30 fps
Bloco de aquecimentoEppendorf5382000010Dispositivo de aquecimento com controle de temperatura
ImageJ SoftwareNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/Software de processamento de imagem de código aberto
Microscópio de Luz InvertidaNikonTi2-EMicroscópio com câmera digital, 40 e poucos; e 100 vezes; Objetivos
KClSigma-AldrichP3911Cloreto de potássio, grau reagente
Agarose com ponto de fusão baixo (1,2%)Thermo Fisher Scientific16520050Para incorporar embriões
Azul de metileno (1%)Sigma-AldrichM9140Agente antifúngico adicionado ao meio E3
MgCl?· 6H? OSigma-AldrichM9272Cloreto de magnésio hexahidratado, grau reagente
NaClSigma-AldrichS9888Cloreto de sódio, grau reagente
Placas de Petri estéreis (100 mm)Corning430167Placas plásticas de Petri para cultura embrionária
Placas de Petri Estéreis (35 mm)MatTek CorporationP35G-1.5-14-CPlacas de Petri com fundo de vidro para montar embriões
Água destilada ultrapuraMilliporeReferência Milli-QÁgua para preparação da solução
ZembryoAnalyzer SoftwareGitHub (Darko Puflovic)https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyserSoftware de análise da função cardíaca

Referências

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Errata

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Formal Correction: Erratum: Functional Cardiac Imaging in Zebrafish Embryos Using Standard Microscopy and Video Analysis: Applications in Environmental and Biomedical Research
Posted by JoVE Editors on 2/09/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68941

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Zebrafish Cardiac ImagingCardiac Function AnalysisBrightfield MicroscopyVideo AnalysisVentricular DimensionsStroke VolumeHeart RateEjection FractionCardiac OutputEmbryonic Cardiotoxicity

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