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Artigo de método

In vivo Registro de Patch-clamp de célula inteira de neurônios peptidérgicos hipotalâmicos em larvas de peixe-zebra

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DOI:

10.3791/68943

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22 de agosto de 2025

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Shanghai University, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo para registro in vivo da atividade elétrica de neurônios peptidérgicos hipotalâmicos usando eletrofisiologia de patch-clamp de células inteiras em larvas intactas.

Resumo

O hipotálamo é uma região antiga do cérebro que regula diversos aspectos da fisiologia e do comportamento, incluindo sono e vigília, apetite, homeostase energética, ansiedade, depressão e interação social. Populações neuronais específicas no hipotálamo exercem seus efeitos por meio da liberação de neurotransmissores e neuropeptídeos. O registro de patch-clamp de células inteiras é uma abordagem indispensável para estudar os papéis desses fatores na transmissão sináptica e na função cerebral. No entanto, é um desafio acessar neurônios hipotalâmicos para registros eletrofisiológicos em mamíferos intactos devido à sua localização profunda no cérebro. Como resultado, nossa compreensão das propriedades intrínsecas e funções fisiológicas dos neurônios hipotalâmicos é limitada. O peixe-zebra larval é um modelo alternativo útil para estudar neurônios hipotalâmicos devido ao seu cérebro vertebrado transparente e pequeno, mas bem conservado. Aqui, apresentamos um protocolo para gravações in vivo de neurônios hipotalâmicos em larvas intactas de peixe-zebra. Usando essa técnica, podemos registrar a partir de neurônios peptidérgicos no hipotálamo, examinar as respostas desses neurônios a estímulos sensoriais e explorar seus efeitos nos neurônios a jusante. Esta técnica experimental, portanto, fornece uma abordagem útil para estudar as funções fisiológicas dos neurônios neuropeptidérgicos hipotalâmicos em animais intactos.

Introdução

Como um modelo animal vertebrado popular, o peixe-zebra (Danio rerio) é amplamente utilizado em pesquisas em neurociência e tem várias vantagens1. Seu complemento de genes e arquitetura cerebral é altamente conservado com mamíferos, e eles têm um rico repertório comportamental, tornando-os úteis para estudar mecanismos genéticos e neuronais subjacentes a comportamentos como sono, ansiedade, depressão e interação social 2,3,4,5,6 . Seu pequeno tamanho e baixo custo de manutenção os tornam ideais para triagem de genes ou drogas de alto rendimento destinadas ao tratamento de doenças neuropsiquiátricas 7,8. Finalmente, a transparência óptica das larvas de peixe-zebra, combinada com técnicas avançadas de microscópio de folha de luz e a disponibilidade de vários repórteres fluorescentes, os torna particularmente adequados para monitorar a atividade neuronal e astroglial em resolução celular em todo o cérebro 9,10,11.

O hipotálamo do peixe-zebra, localizado profundamente no diencéfalo ventral, é conservado anatômica e molecularmente com o hipotálamo dos mamíferos, mas é 2-3 ordens de magnitude menor, fornecendo um sistema mais simples para estudar a função do hipotálamo12. Os neurônios hipotalâmicos formam extensas conexões sinápticas com várias regiões do cérebro, incluindo tálamo, tronco encefálico, glândula pituitária e telencéfalo, por meio das quais regulam a homeostase fisiológica, a sinalização neuroendócrina e os comportamentos autonômicos13,14. Essa modulação do comportamento e da fisiologia depende em grande parte dos neuropeptídeos, que são aminoácidos de cadeia curta que atuam ligando-se a receptores acoplados à proteína G (GPCRs) 15 . Em contraste com a liberação de neurotransmissores de aminoácidos de ação rápida na sinapse, os neuropeptídeos podem se difundir por distâncias maiores por meio da transmissão de volume e mediar efeitos modulatórios lentos na transmissão sináptica e na excitabilidade neuronal16.

Estudos recentes em peixe-zebra revelaram diversas funções dos neuropeptídeos hipotalâmicos por meio de abordagens multidisciplinares, como imagens de cálcio em todo o cérebro, sequenciamento de RNA de célula única, análise comportamental de alto rendimento e mapeamento de circuitos neuronais 4,12,17,18. Essas técnicas emergentes transformaram nossa capacidade de caracterizar a diversidade celular em larga escala, unir mecanismos moleculares com funções de neuropeptídeos em nível de circuito e mapear circuitos neurais subjacentes a comportamentos específicos19,20. No entanto, essas abordagens permanecem limitadas em sua capacidade de resolver a dinâmica fisiológica rápida e os mecanismos sinápticos precisos subjacentes à função dos neuropeptídeos.

A técnica patch-clamp, desenvolvida por Neher e Sakmann, continua sendo o padrão-ouro para investigar a fisiologia neuronal devido à sua resolução temporal e precisão biofísica incomparáveis, permitindo a medição direta das flutuações do potencial da membrana, correntes sinápticas e dinâmica do canal iônico21 , 22 . Essa técnica é particularmente inestimável para o estudo de células neuropeptidérgicas, cujos padrões característicos de ruptura e influências neuromodulatórias requerem medição eletrofisiológica direta para entender completamente seus papéis no comportamento e na homeostase 15,16,23.

Aqui, desenvolvemos um protocolo otimizado que permite registros confiáveis de patch-clamp de células inteiras de neurônios peptidérgicos hipotalâmicos de larvas de peixe-zebra, apesar dos desafios técnicos impostos pela localização anatômica profunda desses neurônios. Essa metodologia fornece acesso direto à atividade elétrica dessas células, permitindo a investigação detalhada de suas respostas ao estímulo visual e auditivo (Figura 1). Ao integrar a eletrofisiologia patch-clamp com a optogenética, podemos caracterizar com precisão a conectividade funcional entre os circuitos hipotalâmicos e os neurônios a jusante (Figura 2 e Figura 3), facilitando o estudo dos neuropeptídeos na homeostase fisiológica e no controle comportamental. Essa abordagem preenche uma lacuna crítica na pesquisa em neurociência, permitindo a exploração mecanicista da função dos neurônios hipotalâmicos nos níveis biofísico, celular e de circuito simultaneamente.

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Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso (IACUC) da Universidade de Xangai (protocolo animal YS 2025-169) e IACUC no Instituto de Tecnologia da Califórnia (protocolo animal 1836). Zebrafish de 5 a 7 dias pós-fertilização (dpf) foram alimentados com rotíferos e utilizados para experimentos. Nesta fase de desenvolvimento, o sexo não é determinado. Peixes-zebra adultos em um nácar [mitfa (w2 / w2)] fundo24 foram usados para reprodução.

1. Soluções e receitas

  1. Prepare o meio E3 contendo 5 mM de NaCl, 0.17 mM de KCl, 0.33 mM de CaCl2 e 0.33 mM de MgSO4. Ajustar a solução com NaOH a pH 7,2. Armazene em temperatura ambiente para uso dentro de 1 mês.
  2. Prepare a solução extracelular contendo 134 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 2,1 mM de CaCl2, 1,2 mM de MgCl2, 10 mM de HEPES e 10 mM de glicose. A osmolalidade da solução extracelular é ~ 290 mOsmol L-1. Ajustar a solução por NaOH a pH 7,8. Conservar a 4 °C para utilização no prazo de 1 mês.
  3. Prepare a solução intracelular contendo 100 mM de K-gluconato, 10 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 2 mM de Mg-ATP, 0,3 mM de Na-GFP, 10 mM de HEPES e 10 mM de EGTA. A osmolalidade da solução intracelular é ~ 280 mOsmol L-1. Ajustar a solução por KOH a pH 7,4. Alíquota de 100 μL da solução interna em tubos de microcentrífugas e armazenar a -20 °C para uso dentro de 1 ano.
    NOTA: A adição de Mg-ATP e Na-GTP é recomendada para gravações prolongadas e estáveis. A solução intracelular precisa ser filtrada através de uma membrana de 0,22 μm, que remove partículas e contaminantes microbianos que podem comprometer a formação de selos ou levar ao entupimento da pipeta.
  4. α-bungarotoxina: Dissolva 1 mg de α-bungarotoxina em 1 mL de meio E3 até uma concentração final de 1 mg/mL. Alíquota de 20 μL da solução em tubos de microcentrífugas e armazenar a -20 °C para uso dentro de 1 ano.
  5. Agarose de baixo ponto de fusão: Dissolva 0,75 g de agarose em 50 mL de meio E3 em um frasco de vidro até uma concentração final de 1,5%. Aqueça a mistura em um forno de micro-ondas até que a agarose derreta e a solução pareça límpida e homogênea. Mantenha a agarose derretida a 42-45 °C em banho-maria para uso dentro de 1 mês.

2. Preparação e dissecação do peixe-zebra

  1. Coloque um único peixe adulto macho e fêmea contendo um transgene desejado, por exemplo, Tg (hcrt: RFP) peixe25, em um tanque de acasalamento e separe-os por uma divisória transparente durante a noite. Na manhã do segundo dia, remova a divisória para permitir que os peixes se reproduzam. Colete embriões fertilizados no fundo do tanque e devolva os peixes adultos aos tanques de origem no início da tarde.
  2. Levantar os embriões em uma placa de Petri de 9 cm de diâmetro com meio E3 incluindo azul de metileno a 0,0005%. Colocar os embriões numa estufa a 28,5 °C com ciclos claro:escuro de 14:10 h. Troque a solução E3 todos os dias.
    NOTA: O azul de metileno no meio E3 é usado para prevenir o crescimento fúngico até 3 dias após a fertilização (dpf), mas é substituído pelo meio E3 sozinho a 3 dpf, uma vez que o azul de metileno pode afetar o metabolismo celular e a função mitocondrial em estágios posteriores de desenvolvimento26.
  3. Filtre os peixes larvais sob um estereomicroscópio de epifluorescência com ampliação máxima (~ 115x) começando em torno de 3 dpf. Coloque peixes individuais em gotículas de água (maiores que o tamanho do corpo) para facilitar a classificação. Para os peixes com mais de 3 dpf, anestesiar os peixes usando 3 mL de meio E3 contendo 0,01% de tricaína para suprimir a atividade locomotora espontânea. Colete larvas com expressão de fluoróforo brilhante no hipotálamo.
    NOTA: Use luvas de nitrilo, óculos de segurança e jaleco ao manusear tricaína. O excesso de tricaína deve ser descartado como resíduo químico de acordo com os protocolos dos animais.
  4. Após a triagem, lave a tricaína com meio E3 imediatamente e coloque essas larvas de volta na incubadora. Adicionar ~5 ml de solução de alimentação contendo rotíferos na placa de Petri a partir de 5 dpf até ao dia das experiências. Troque a solução E3 e alimente os peixes com rotíferos todos os dias.
  5. Com 5-7 dpf, colete peixes larvais que pareçam saudáveis e mostrem locomoção ativa. Transfira-os para uma pequena placa de Petri (3,5 cm de diâmetro) usando uma pipeta de vidro.
  6. Remova a água ao redor do peixe e adicione 20 μL de 1 mg / mL de α-bungarotoxina no peixe por ~ 30 s. Em seguida, lave o medicamento adicionando ~ 3 mL de meio E3 na placa de Petri.
    NOTA: Use luvas de nitrilo, óculos de segurança e jaleco ao manusear α-bungarotoxina. O excesso de α-bungarotoxina deve ser descartado como resíduo químico de acordo com os protocolos animais.
  7. Cubra a placa de Petri com papel alumínio para manter os peixes no escuro e gradualmente ficar paralisado.
    NOTA: α-bungarotoxina é um bloqueador do receptor de acetilcolina que atua especificamente na junção neuromuscular, paralisando assim o peixe sem afetar o sistema nervoso. Os peixes ainda podem sentir estímulos ambientais e a função cerebral é normal, após a paralisia 9,27.
  8. Verifique se há paralisia após ~ 15 minutos usando um estereomicroscópio e selecione um peixe paralisado que mostre batimentos cardíacos normais e circulação sanguínea robusta no cérebro e no corpo.
  9. Transfira o peixe para uma câmara de gravação feita sob medida, que é uma placa de Petri de 35 mm com um orifício de 10 mm de diâmetro no centro e uma lamínula de vidro de 20 x 20 mm colada na parte inferior para cobrir o orifício. Remova a água e adicione ~ 200 μL de agarose a 1,5% de baixo ponto de fusão.
  10. Posicione o lado dorsal do peixe para cima na agarose usando uma pinça (Dumont # 5). Quando a agarose estiver totalmente solidificada, adicione a solução extracelular para cobrir a agarose. Demora de 5 a 10 minutos para a agarose solidificar completamente.
  11. Corte e remova a agarose acima da cabeça do peixe usando uma microfaca. Em seguida, faça uma pequena incisão na pele acima do ventrículo cerebral entre o tecto óptico e o cerebelo usando uma micropipeta de vidro com abertura de ponta de ~ 1 μm para a pipeta avançando para o cérebro na próxima etapa.
  12. Remova detritos de tecido ou coágulos sanguíneos ao redor do orifício de dissecção usando uma pipeta de vidro quebrado.

3 Gravação de patch-clamp de célula inteira

  1. Prepare micropipetas de gravação com abertura de ponta de ~ 1 μm e resistência de ~ 20 MΩ usando capilares de borossilicato no dia do experimento. Armazene as micropipetas puxadas em um recipiente e use-as no mesmo dia para evitar contaminação.
  2. Ligue o computador, a câmera CCD, o monitor, o amplificador, o digitalizador, o micromanipulador e o software associado. O amplificador e o digitalizador devem ser ligados antes de abrir o software.
  3. Mova cuidadosamente o peixe para um equipamento eletrofisiológico onde o experimento do patch clamp será realizado.
  4. Perfunda o peixe com solução extracelular oxigenada a ~ 2 mL por minuto usando uma bomba peristáltica para manter a saúde e a viabilidade celular dos peixes.
  5. Mova a câmara de gravação usando um tradutor XY (feito sob medida) para centralizar o peixe no campo visual de uma objetiva 4x sob um microscópio vertical.
  6. Mude para uma objetiva de 60x e mova o tradutor para visualizar a região do hipotálamo alvo. Ajuste o contraste de interferência diferencial (DIC) de Nomarski com luz infravermelha de 900 nm para obter a melhor visualização das células.
  7. Ligue a fonte de luz de excitação de fluorescência (por exemplo, lâmpada de mercúrio) e use-a para visualizar neurônios fluorescentes no hipotálamo. Localize neurônios saudáveis que mostrem fluorescência brilhante e limites celulares claros, que geralmente indicam boa saúde celular e facilitam registros eletrofisiológicos de alta qualidade.
  8. Encha lentamente uma micropipeta de gravação com solução intracelular usando uma ponta fina de microcarregador.
  9. Fixe o eletrodo no headstage do amplifier e aperte o botão para evitar vazamento de ar. Aplique uma leve pressão positiva (~150-200 mBar) no interior da micropipeta através da tubulação conectada ao suporte, o que evita que contaminantes na interface ar-solução entrem na ponta do eletrodo.
  10. Abaixe a micropipeta na solução do banho usando um micromanipulador no modo rápido e posicione a ponta da micropipeta acima do orifício dissecado sob a objetiva 4x.
  11. Mude o micromanipulador para o modo lento e mude a objetiva para 60x. Avance a ponta da pipeta de vidro lentamente através do orifício de dissecação e ao longo do ventrículo entre os dois hemisférios tectais.
  12. Traga a ponta da pipeta ortogonalmente em direção a uma célula fluorescente alvo viewed usando DIC e fluorescência. Uma vez que a ponta da pipeta toca a membrana celular, um pequeno recuo é formado.
    NOTA: Para visualizar tecidos profundos como o hipotálamo, o IR-DIC de 900 nm é usado junto com filtros polarizadores e analisadores que são ajustados com precisão para IR-DIC.
  13. A liberação da pressão positiva rapidamente quando a ponta toca uma célula permite que a célula forme uma vedação com a pipeta. Simultaneamente, aplique uma breve pressão negativa através da tubulação conectada ao suporte.
    NOTA: O valor da resistência no software deve aumentar rapidamente para > 1 GΩ, indicando que uma vedação de alta resistência é formada. Quando a célula hipotalâmica fluorescente é registrada com sucesso, deve haver membrana celular fluorescente dentro da ponta da micropipeta de registro.
  14. Clamp a célula em -60 mV e aguarde 1-2 min até que a linha de base e a resistência de acesso estejam estáveis. Aplique um breve pulso elétrico ou sucção suave por via oral para romper a membrana celular abaixo da ponta da micropipeta.
  15. Compense a corrente capacitiva e a resistência em série em uma configuração de software eletrofisiológico. Descarte os dados se a resistência em série for maior que 100 MΩ e variar > 20% nas gravações.
  16. Aplique um pulso de tensão de 1 s -10 mV no modo de tensão para monitorar a resistência intrínseca da membrana antes e depois dos experimentos. Descarte a célula se a resistência da membrana ou o potencial da membrana variar muito.
  17. Primeiro registro no modo de grampo de tensão (VC) quando a célula é mantida em um valor negativo. Depois de estabelecer uma gravação estável, mude para o modo de pinça de corrente (IC), se necessário.
    NOTA: O giga-selo pode não ser estável logo após a ruptura, portanto, prender a célula a -60 mV no modo VC por alguns minutos no início de um experimento pode fornecer melhores condições celulares.
  18. Processe a análise de dados eletrofisiológicos e a detecção de picos off-line usando o MATLAB após a conclusão do experimento.
  19. Após os experimentos, eutanasiar as larvas de peixes com hipoclorito de sódio (NaClO) a 1,5% e descartá-las de acordo com os protocolos institucionais de cuidados com os animais.

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Resultados

Neste manuscrito, apresentamos uma técnica aprimorada de registro de patch-clamp de células inteiras in vivo para investigar neurônios hipotalâmicos em peixes-zebra intactos, particularmente com foco em neurônios de hipocretina (Hcrt).

Conforme apresentado na Figura 1, nossa metodologia permite registros eletrofisiológicos diretos desses neurônios nas profundezas do cérebro em um animal intacto (Figura 1A), superando as limit...

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Discussão

O protocolo descrito aqui permite gravações de neurônios peptidérgicos no hipotálamo larval do peixe-zebra, uma das regiões cerebrais mais profundas e tecnicamente desafiadoras de acessar. Devido à dificuldade inerente a essa preparação, os registros bem-sucedidos do patch-clamp requerem atenção meticulosa a alguns parâmetros críticos, ou seja, qualidade da pipeta, técnica de abordagem, pureza da solução e saúde do tecido. Esses fatores determinam coletivamente a probabilidade de alcança...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse e nada a divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Daniel Wagenaar por sua ajuda no projeto de dispositivos para experimentos optogenéticos. Este trabalho foi apoiado por doações R35 NS122172 e R34 NS126800 dos Institutos Nacionais de Saúde para DAP e do Programa de Introdução de Talentos Ultramarinos de Xangai para RZ.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AmplificadorAxónio700B
Capilares de vidro borossilicatoSutterBF100-58-10
Câmera CCDDage-MTIIR-1000
Computadores para registos electrofisiológicosValePrecisão 3660
DigidataAxónio1440UMA
Gaiola de FaradaySob medida
FórcepsF.S.T.Dumont #5
IncubadoraLonroyGZP-150B
Filtro de membranaMillipore SigmaSLGV004SL
Micro facaF.S.T.10318-14
ObjetivoOlimpoMplan 5X/0.1; UMPlanFI/IR 60X/0.9w
Bomba peristálticaMaisBT100-1L
Porta-pipetasNarishigeH-7para dissecção
ExtratorInstrumento Sutterpág. 97
Estereomicroscópio para triagem e dissecção fluorescenteOlimpoSZX16
EstimuladorA.M.P.IMestre 8
Micromanipulador tridimensionalInstrumento SutterMPC-325
Microscópio DIC infravermelho verticalOlimpoBX51WI
Mesa de isolamento de vibraçãoTMC61-541-06
Monitor de vídeoSUNSPOSP-717
Banho-mariaYihengHWS-12
Tradutor X-YSob medida

Referências

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