Este artigo apresenta um protocolo para registro in vivo da atividade elétrica de neurônios peptidérgicos hipotalâmicos usando eletrofisiologia de patch-clamp de células inteiras em larvas intactas.
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Artigo de método
* These authors contributed equally
Este artigo apresenta um protocolo para registro in vivo da atividade elétrica de neurônios peptidérgicos hipotalâmicos usando eletrofisiologia de patch-clamp de células inteiras em larvas intactas.
O hipotálamo é uma região antiga do cérebro que regula diversos aspectos da fisiologia e do comportamento, incluindo sono e vigília, apetite, homeostase energética, ansiedade, depressão e interação social. Populações neuronais específicas no hipotálamo exercem seus efeitos por meio da liberação de neurotransmissores e neuropeptídeos. O registro de patch-clamp de células inteiras é uma abordagem indispensável para estudar os papéis desses fatores na transmissão sináptica e na função cerebral. No entanto, é um desafio acessar neurônios hipotalâmicos para registros eletrofisiológicos em mamíferos intactos devido à sua localização profunda no cérebro. Como resultado, nossa compreensão das propriedades intrínsecas e funções fisiológicas dos neurônios hipotalâmicos é limitada. O peixe-zebra larval é um modelo alternativo útil para estudar neurônios hipotalâmicos devido ao seu cérebro vertebrado transparente e pequeno, mas bem conservado. Aqui, apresentamos um protocolo para gravações in vivo de neurônios hipotalâmicos em larvas intactas de peixe-zebra. Usando essa técnica, podemos registrar a partir de neurônios peptidérgicos no hipotálamo, examinar as respostas desses neurônios a estímulos sensoriais e explorar seus efeitos nos neurônios a jusante. Esta técnica experimental, portanto, fornece uma abordagem útil para estudar as funções fisiológicas dos neurônios neuropeptidérgicos hipotalâmicos em animais intactos.
Como um modelo animal vertebrado popular, o peixe-zebra (Danio rerio) é amplamente utilizado em pesquisas em neurociência e tem várias vantagens1. Seu complemento de genes e arquitetura cerebral é altamente conservado com mamíferos, e eles têm um rico repertório comportamental, tornando-os úteis para estudar mecanismos genéticos e neuronais subjacentes a comportamentos como sono, ansiedade, depressão e interação social 2,3,4,5,6 . Seu pequen....
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Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso (IACUC) da Universidade de Xangai (protocolo animal YS 2025-169) e IACUC no Instituto de Tecnologia da Califórnia (protocolo animal 1836). Zebrafish de 5 a 7 dias pós-fertilização (dpf) foram alimentados com rotíferos e utilizados para experimentos. Nesta fase de desenvolvimento, o sexo não é determinado. Peixes-zebra adultos em um nácar [mitfa (w2 / w2)] fundo24 foram usados para reprodução.
1. Soluções e receitas
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Neste manuscrito, apresentamos uma técnica aprimorada de registro de patch-clamp de células inteiras in vivo para investigar neurônios hipotalâmicos em peixes-zebra intactos, particularmente com foco em neurônios de hipocretina (Hcrt).
Conforme apresentado na Figura 1, nossa metodologia permite registros eletrofisiológicos diretos desses neurônios nas profundezas do cérebro em um animal intacto (Figura 1A), superando as limit.......
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O protocolo descrito aqui permite gravações de neurônios peptidérgicos no hipotálamo larval do peixe-zebra, uma das regiões cerebrais mais profundas e tecnicamente desafiadoras de acessar. Devido à dificuldade inerente a essa preparação, os registros bem-sucedidos do patch-clamp requerem atenção meticulosa a alguns parâmetros críticos, ou seja, qualidade da pipeta, técnica de abordagem, pureza da solução e saúde do tecido. Esses fatores determinam coletivamente a probabilidade de alcança.......
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Os autores declaram não haver conflitos de interesse e nada a divulgar.
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Daniel Wagenaar por sua ajuda no projeto de dispositivos para experimentos optogenéticos. Este trabalho foi apoiado por doações R35 NS122172 e R34 NS126800 dos Institutos Nacionais de Saúde para DAP e do Programa de Introdução de Talentos Ultramarinos de Xangai para RZ.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Amplificador | Axónio | 700B | |
| Capilares de vidro borossilicato | Sutter | BF100-58-10 | |
| Câmera CCD | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Computadores para registos electrofisiológicos | Vale | Precisão 3660 | |
| Digidata | Axónio | 1440UMA | |
| Gaiola de Faraday | Sob medida | ||
| Fórceps | F.S.T. | Dumont #5 | |
| Incubadora | Lonroy | GZP-150B | |
| Filtro de membrana | Millipore Sigma | SLGV004SL | |
| Micro faca | F.S.T. | 10318-14 | |
| Objetivo | Olimpo | Mplan 5X/0.1; UMPlanFI/IR 60X/0.9w | |
| Bomba peristáltica | Mais | BT100-1L | |
| Porta-pipetas | Narishige | H-7 | para dissecção |
| Extrator | Instrumento Sutter | pág. 97 | |
| Estereomicroscópio para triagem e dissecção fluorescente | Olimpo | SZX16 | |
| Estimulador | A.M.P.I | Mestre 8 | |
| Micromanipulador tridimensional | Instrumento Sutter | MPC-325 | |
| Microscópio DIC infravermelho vertical | Olimpo | BX51WI | |
| Mesa de isolamento de vibração | TMC | 61-541-06 | |
| Monitor de vídeo | SUNSPO | SP-717 | |
| Banho-maria | Yiheng | HWS-12 | |
| Tradutor X-Y | Sob medida |
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