O protocolo descreve o procedimento operacional padrão para testar materiais potencialmente biodegradáveis, sintéticos e naturais, em condições aeróbicas, usando um inóculo natural de água do mar e um sistema automatizado de respirometria de circuito fechado.
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Artigo de método
Teste de biodegradação aeróbica de materiais usando um inóculo natural de água do mar marinho e respirômetro de circuito fechado
Neste artigo
Resumo
Resumo
A avaliação adequada de materiais biodegradáveis depende da ampla adoção de métodos de teste padrão. Embora esses métodos existam, a capacidade de teste permanece limitada, limitada pelo custo e pelo tempo inicial para estabelecer novos laboratórios. Este protocolo de triagem modificado é baseado no ASTM International D6691-24a, Método de Teste Padrão para Determinar a Biodegradação Aeróbica de Materiais Plásticos no Ambiente Marinho por um Consórcio Microbiano Definido ou Inóculo Natural de Água do Mar. Ele avalia a biodegradação de materiais em um ambiente marinho, comparando os resultados com controles positivos e negativos, e usa um inóculo natural de água do mar suplementado com amônio e fosfato para evitar a limitação de nutrientes. Os materiais são expostos a esta água do mar enriquecida com nutrientes e incubados a 30 °C. Um respirômetro Micro-Oxymax mede a produção de biogás (dióxido de carbono, CO2) ao longo do tempo. O grau de mineralização (biodegradação) é determinado pelo cálculo da proporção de carbono derivado do material convertido em carbono de biogás. A porcentagem de produção de CO2 , expressa como uma fração do teor de carbono medido ou teórico, é relatada em função do tempo. O sistema de respirometria de circuito fechado acomoda uma variedade de vasos de reatores, preparados em triplicata para cada material, um controle negativo (apenas inóculo de água do mar) e um controle positivo (celulose de cromatografia em camada fina). Este método é importante para avaliar materiais no ambiente marinho e aborda a prevenção da poluição global.
Introdução
Os resíduos de plástico representam uma ameaça para os ecossistemas marinhos e para a saúde humana1. A crescente preocupação com a poluição plástica, juntamente com os detritos marinhos de quaisquer materiais no oceano, ressalta a necessidade de soluções sustentáveis, como melhor gerenciamento de resíduos em fim de vida e materiais biodegradáveis que se biodegradam prontamente no ambiente marinho. Ao contrário dos plásticos sintéticos tradicionais, que persistem por décadas a séculos e geram microplásticos que se acumulam nas teias alimentares 2,3,4, os materiais biodegradáveis, componentes orgânicos do carbono, podem ser metabolizados em CO 2 e metano (CH4) ou assimilados em biomassa microbiana5. Compreender a biodegradação de materiais na água do mar é, portanto, fundamental para quantificar e mitigar os impactos ambientais dos detritos marinhos.
A biodegradação no ambiente marinho é controlada pela interação de variáveis espaço-temporais, incluindo disponibilidade de luz e nutrientes, pressão, temperatura, composição de espécies microbianas e natureza físico-química e estrutura do polímero, que determinam a taxa, o grau e o mecanismo de degradação6. Essas variáveis representam um desafio significativo para estudos de biodegradação baseados em laboratório que simulam ambientes marinhos. Este procedimento operacional padrão (SOP) usa água do mar natural como inóculo, capturando a comunidade microbiana in situ presente e registra variáveis relevantes, incluindo nutrientes dissolvidos na água do mar, carbono e nitrogênio particulados, clorofila, salinidade, pH e temperatura. Essa abordagem controlada baseada em laboratório otimiza as condições para promover a mineralização e permite medições diretas de biodegradação que não são viáveis in situ. O ASTM International D6691-24a, Método de Teste Padrão para Determinar a Biodegradação Aeróbica de Materiais Plásticos no Ambiente Marinho por um Consórcio Microbiano Definido ou Inóculo Natural de Água do Mar (doravante ASTM D6691), e este SOP foram desenvolvidos como uma ferramenta de triagem rápida e confiável para avaliar a biodegradabilidade de materiais 7,8,9,10.
Alinhado com ASTM D6691, um teste de triagem para biodegradabilidade inerente do polímero, este protocolo avalia a biodegradação de materiais em condições ideais, 30 °C, área de superfície máxima da amostra moída e excesso de nutrientes inorgânicos (nitrogênio, 130 mg/L; fósforo, 23 mg/L)9, para promover a mineralização e evitar limitações de nutrientes. Embora os testes de triagem ofereçam informações iniciais valiosas, testes adicionais, como amarrações costeiras e em alto mar, que medem a perda de peso em função do tempo, podem ser necessários para uma avaliação abrangente em condições marinhas naturais. Uma vez que esses testes de amarração costeira e em alto mar estimam a biodegradação com base na perda de peso em função do tempo10,11, os pesquisadores devem primeiro realizar esse teste de triagem, que mede diretamente o metabolismo microbiano, antes de ir para um experimento de ancoragem costeira e em alto mar in situ, que também é mais caro.
O método de teste padrão ASTM D6691 descreve procedimentos para avaliar a biodegradação aeróbica de materiais plásticos não flutuantes em ambientes marinhos. Esta norma, juntamente com as normas de especificação, como a ASTM D7081 (Especificação Padrão para Plásticos Biodegradáveis Não Flutuantes no Ambiente Marinho; com foco na biodegradabilidade em meio aquoso, atualmente retirada da ASTM e sendo reformulada), fornece uma estrutura para certificar polímeros experimentais como biodegradáveis marinhos 9,12. Em geral, uma especificação é um padrão de consenso da ASTM International que define os requisitos que um material, produto ou sistema deve atender. Ele garante que os materiais projetados para biodegradar em ambientes marinhos o façam dentro de prazos aceitáveis e não liberem aditivos potencialmente tóxicos, como corantes ou plastificantes.
Com base na ASTM D6691, este protocolo quantifica a taxa e o grau de biodegradação aeróbica de materiais (substrato experimental) na água do mar natural e expande os controles positivos de materiais (ou seja, celulose, papel Kraft, quitina/quitosana), historicamente mostrados como biodegradáveis no ambiente marinho 7,9,10. O objetivo deste método é selecionar materiais sob condições otimizadas para ver se os materiais se biodegradam no ambiente marinho. O inóculo aproveita a comunidade microbiana natural presente na água do mar, coletada seguindo as diretrizes específicas descritas na ASTM. Essas diretrizes enfatizam o uso de água do mar com salinidade de aproximadamente 32, coletada em um local livre de poluentes como esgoto, despejo de produtos químicos ou derramamentos de óleo. O teste usa um respirômetro automatizado de circuito fechado com vasos de reator de 250 mL mantidos a 30 ° C, cada um contendo 75 mL de água do mar e ~ 20 mg do substrato experimental ou de controle8. A mineralização (biodegradação) é expressa como a porcentagem de biogás de carbono líquido (CO2-C) produzido em relação à massa inicial de carbono adicionada. Este método não leva em conta a assimilação de carbono em biomassa microbiana.
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Protocolo
1. Recolha e caracterização da água do mar
- Identifique um local de coleta de água do mar não afetado por águas residuais, produtos químicos, manchas de óleo ou forte influência de água doce.
- No local de coleta, registre a fonte (localização, latitude e longitude, profundidade de coleta, profundidade total e temperatura), data da coleta da amostra e condições da água observadas.
- Colete e combine amostras de água do mar de várias profundidades, locais e eventos de amostragem para promover uma composição diversificada da comunidade microbiana.
- Em um garrafão de 20 L lixiviado com ácido, colete de 10 L a 20 L de água do mar usando uma garrafa grande de Niskin e transporte de volta ao laboratório.
- Do garrafão, transfira 1 L de subamostra inteira de água do mar para uma garrafa de polietileno de alta densidade âmbar (HDPE) de 1 L lixiviada com ácido para análise laboratorial de carbono particulado e nitrogênio para condições iniciais de água do mar. A partir da amostra de 1 L, filtrar (0,2 μm; acetato de celulose com baixo teor de azoto) e recolher uma subamostra de 60 ml num frasco de polietileno lixiviado com ácido para análise dos constituintes inorgânicos e orgânicos dissolvidos de azoto (N) e fósforo (P).
- Rotule as subamostras com o nome do projeto, a ID da amostra e a data. Medir as concentrações de NH4+ pelo método do indofenol (4500-NH3)13,14 e os níveis de PO4 3- pelo método da solução única (4500-P E)13,15. Quantificar o azoto e o carbono particulados utilizando o método de análise elementar16. Medir as concentrações de clorofila-a seguindo os protocolos descritos por Parsons et al.17(10150 A, 10150 C)13.
NOTA: As análises da qualidade da água relacionadas a nutrientes são opcionais. Este protocolo pressupõe que as análises sejam conduzidas por um laboratório externo. - Cubra frouxamente a abertura do garrafão para manter as condições aeróbicas e armazene a água do mar a 30 °C no escuro por até 7 dias.
NOTA: A água do mar também pode ser arejada usando uma bomba de ar e um sistema de borbulhadores.
2. Preparação do substrato experimental
- Adicione 10-15 g de substrato experimental (ou seja, polissacarídeos naturais, madeira, fibras, polímeros) que podem estar na forma de pellets, fragmentos e peças formadas a um frasco de fresagem de aço inoxidável de 50 mL com uma esfera de aço de 20 mm. Triturar o substrato experimental até obter um tamanho de partícula uniforme (0,10-0,25 mm) antes do início do ensaio.
- Mergulhe o frasco de moagem em nitrogênio líquido e fragilize por 15 min até que o nitrogênio líquido pare de ferver.
CUIDADO: O nitrogênio líquido é um líquido criogênico que pode causar queimaduras, ferimentos ou queimaduras. Leia e siga todas as Fichas de Dados de Segurança antes de usar. Use equipamento de proteção individual adequado. - Prenda o jarro de fresagem no acessório do moinho de bolas e defina os parâmetros do instrumento para 30 Hz e 2:30 min e pressione Iniciar. Repita 4x com 30 s de resfriamento em nitrogênio líquido entre as tentativas. Se o material for um polímero com baixa temperatura de transição vítrea, execute ciclos de fresagem adicionais conforme necessário para produzir uma distribuição uniforme do tamanho das partículas.
- Verifique a uniformidade de tamanho e caracterize a distribuição de tamanho de partícula por análise de peneira, conforme descrito na ASTM D1921-9618. Monte peneiras padrão abrangendo a faixa de tamanho de partícula esperada, com o menor tamanho de malha na parte inferior. Coloque a amostra moída na peneira superior e prenda a pilha de peneiras em um agitador mecânico. Agite até que as partículas passem pela malha. Colete e pese o material retido de cada peneira para calcular a distribuição do tamanho das partículas. Use o mesmo conjunto de peneiras em todos os tratamentos para manter a comparabilidade. Registre a distribuição na planilha de dados.
- Determinar o teor de carbono por subamostra do peso seco do substrato experimental moído por análise elementar16.
NOTA: Este protocolo pressupõe que a análise elementar é conduzida por um laboratório externo.
3. Preparação dos nutrientes adicionais para a água do mar
- Encher um balão volumétrico de 2 ou 4 l até meio com água do mar. O volume total necessário depende do número de vasos do reator a serem usados no experimento. Cada vaso do reator conterá 75 mL de água do mar. Se a fonte de água do mar contiver altas concentrações de matéria orgânica particulada, peneire a água do mar através de uma malha de 20 μm para eliminar a contaminação heterogênea por partículas grandes.
- Usando uma balança de precisão com sensibilidade de 0,001 g, tarar um prato de pesagem e pesar 0,5 g/L de cloreto de amônio (NH4Cl) e, em seguida, 0,1 g/L de fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) com base em 2 L ou 4 L de água do mar.
CUIDADO: O cloreto de amônio pode causar danos ou irritação nos olhos. Leia e siga todas as fichas de dados de segurança antes de usar e use equipamento de proteção individual adequado.
NOTA: Descarte os resíduos monobásicos de cloreto de amônio e fosfato de potássio em recipientes dedicados para resíduos perigosos de acordo com os procedimentos institucionais e regulamentos locais. Pequenos volumes de soluções diluídas (<1%) NH4Cl e KH2PO4 podem ser elegíveis para descarte de drenagem após diluição com água abundante, se permitido pela instituição e pela autoridade local de águas residuais. - Adicione os nutrientes inorgânicos ao balão volumétrico de 2 L ou 4 L, dê volume com água do mar, adicione uma barra de agitação e mexa em uma placa de agitação até que todos os sais se dissolvam. A solução deve ser límpida, sem partículas visíveis.
- Subamostre 20-30 mL da água do mar suplementada com nutrientes para medição de pH e salinidade. Filtre mais 60 mL através de um filtro de acetato de celulose com baixo teor de nitrogênio de 0,2 μm em um frasco de polietileno lixiviado com ácido para análise de N e P inorgânico dissolvido seguindo os métodos padrão na etapa 1.5.
- Meça o pH e a salinidade em um medidor de bancada seguindo as instruções do fabricante. Espera-se uma diminuição do pH de aproximadamente uma unidade para água do mar com força total devido à acidez do suplemento nutritivo.
4. Preparação para a incubação do vaso do reator
- Lixivie com ácido todos os vidros, incluindo vasos de reator de 250 mL para as amostras e pipeta volumétrica de 75 mL em ácido clorídrico (HCl) a 10% por 24 h e enxágue 3x com água deionizada.
CUIDADO: O HCl pode causar queimaduras graves e danos aos olhos. Leia e siga todas as Fichas de Dados de Segurança antes de usar. Use equipamento de proteção individual adequado.
NOTA: 10% dos resíduos de HCl podem ser neutralizados com bicarbonato de sódio para formar uma solução neutra antes do descarte. Realizar a neutralização de acordo com os procedimentos institucionais de resíduos perigosos e os regulamentos locais aplicáveis. - Autoclave os vasos vazios do reator de 250 mL lixiviados com ácido, tampas com portas, anéis de vedação de silicone e tampas de rosca em uma autoclave a 121 ° C por 15 minutos antes do dia do experimento.
- Rotule os frascos de amostra com o número do canal/ID correspondente aos recipientes que recebem amostras ou materiais de controle.
- Com a balança analítica, tarar um frasco para injetáveis (com tampa) e pesar 20 mg (± 0,1 mg) do ensaio experimental ou de controlo, registar o peso total de leitura e retirar reservas. Repita para todas as réplicas experimentais e de controle.
NOTA: Certifique-se de que os pesos sejam precisos. Recomenda-se pesar todos os substratos no mesmo dia e pela mesma pessoa. - Ligue a incubadora no dia anterior à adição dos recipientes e ajuste a temperatura para 30 °C. Ligue o respirômetro pelo menos 2 h antes de executar o diagnóstico do sistema e a calibração do sensor com base nas instruções do fabricante.
NOTA: A preparação do vaso do reator pode prosseguir assim que a temperatura da incubadora atingir e manter 30 ± 2 °C. - Prepare a folha de dados registrando IDs/replicações de amostra e o número do canal correspondente. Organize os vasos do reator e os conjuntos de tampas (tampa com portas/O-ring) em ordem de número do canal/ID (certifique-se de que cada recipiente esteja claramente identificado). Verifique os anéis de vedação e as tampas/portas para garantir que estejam limpos, secos e intactos.
5. Configurando os vasos do reator
- Use uma pipeta volumétrica de 75 mL com lixiviação ácida e um controlador de pipeta motorizado para dispensar 75 mL de água do mar suplementada com nutrientes em cada vaso do reator.
- Remova uma pipeta descartável de água do mar (~ 3 mL) de cada recipiente e coloque-a em uma superfície limpa ao lado dela. Essa água do mar será usada para enxaguar os substratos experimentais e de controle moídos do frasco (Figura 1).
- Transfira os substratos para recipientes apropriados.
- Coloque um O-ring na borda do vaso do reator e, em seguida, coloque uma tampa de duas portas diretamente no topo do O-ring. Prenda o O-ring e a tampa no lugar com uma tampa de rosca.
- Combine o vaso do reator com suas linhas de gás/condensação correspondentes. Insira firmemente as linhas de gás nas portas de entrada/saída apropriadas na tampa do recipiente.
- Ligue a plataforma do agitador para 0.05 x g (modo contínuo). Faça uma verificação visual para garantir que todos os vasos estejam seguros e, em seguida, feche a porta da incubadora.
- Registre a temperatura da incubadora (leitura e sonda do termistor) e a pressão atmosférica usando um barômetro.
Figura 1: Configuração e preparação do recipiente. (A) Adicionando água do mar, (B) adicionando a amostra e (C) adicionando o O-ring, a tampa de metal e a tampa de rosca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
6. Iniciando o sistema de respirometria
- Inicie o software no computador conectado. Verifique se o sistema detecta o hardware através da conexão RS-232. Se o hardware não for encontrado, uma notificação indicará que o dispositivo não está conectado e o programa deve ser reiniciado.
- No menu principal do software, selecione Ferramentas > Diagnóstico > Operações básicas. Clique em Salvar arquivo de log. Clique em Válvulas e Sensores. O software indicará APROVADO ou REPROVADO para cada teste. Prossiga para a calibração de dois pontos do sensor de CO2 somente se ambos os testes forem aprovados.
7. Calibrando o sensor de CO2
- Conecte uma coluna de cal sodática à porta de nitrogênio no painel traseiro da bomba de amostra para remover o CO2 ambiente para calibração zero. Certifique-se de que a cal sodada tenha uma aparência branca como giz e não descolorida (por exemplo, rosa ou roxo).
- Selecione Ferramentas > Calibração. Clique em Iniciar calibração no canto inferior direito. Quando solicitado, ajuste o sample fluxo para 0,5 L/min usando o sample controle da bomba do painel frontal. Clique em OK.
- Quando o temporizador chegar a zero, pressione os botões de deslocamento para cima e para baixo no sensor de CO2 para ajustar a leitura na tela para 0,000 (ou o mais próximo possível). Os valores ficarão verdes quando estiverem dentro do intervalo aceitável. Clique em Próximo gás.
- Quando solicitado, conecte o cilindro de gás de calibração à porta de calibração no sample painel traseiro da bomba. Ajuste a pressão de saída do gás de calibração para 5 PSIG. Certifique-se de que o excesso de gás flua através da conexão em T, onde o usuário possa ouvir e sentir o gás próximo à conexão, antes de clicar em OK.
- Quando o cronômetro chegar a zero, pressione os botões Up e Down span no sensor CO2 para ajustar a leitura na tela para 2.700 (ou o mais próximo possível). Os valores ficarão verdes quando estiverem dentro do intervalo aceitável. Clique em Próximo gás para concluir a calibração.
NOTA: As concentrações de gás de calibração são determinadas pela mistura de gás padrão primário certificada, conforme documentado no certificado de análise do fornecedor.
8. Configuração do experimento no software
- Selecione Experimento > Configuração. Insira os números dos canais inicial e final nos menus suspensos com base nos canais ocupados.
- Defina Limite de atualização (%) como 0,50, Intervalo de atualização como N.A. e Janela de atualização (s) como Automático.
- Em Configuração Diversa, marque a caixa Sensores de Purgação; certifique-se de que Medição automática de volume, Consumo de O2 Positivo e Ativar modo de fluxo aberto não estejam selecionados.
- Defina o Intervalo de amostra (horas) para 8,00 e a Duração do experimento (horas) para N.A. Defina as unidades de gás e tempo conforme necessário.
- Se estiver usando a sonda de temperatura primária para correção da temperatura de incubação, certifique-se de que a opção Inserir manualmente a temperatura da câmara não esteja selecionada. Marque a caixa Modo de ventilação e certifique-se de que o Modo de drenagem não esteja selecionado.
- Certifique-se de que o modo de ventilação anaeróbica não esteja selecionado.
- Selecione Configuração da câmara. Insira rótulos de canal descritivos (por exemplo, NegCtrl_1, PosCtrl_2, Test_PHA_3).
- Clique em Utilitários. Clique em Células na coluna EN somente para canais ocupados. Clique em Restrição. O software indicará APROVADO ou REPROVADO para cada canal. Prossiga somente se todos os testes de restrição forem aprovados.
- Clique em Volume para medir os volumes do headspace.
NOTA: O volume do headspace é igual ao volume do ar dentro do vaso do reator de amostra e da tubulação de circuito fechado. Confirme se os volumes são razoáveis para o tamanho do vaso e o comprimento da tubulação. - Clique em Vazamento. O software indicará APROVADO ou REPROVADO para cada canal com base no volume do headspace. Se um canal falhar, execute as etapas a seguir.
- Certifique-se de que o O-ring esteja limpo e livre de partículas e fibras e encaixado corretamente entre a borda do recipiente e a tampa de metal.
- Aperte a tampa de rosca. Verifique a conexão e a tubulação nas portas e conexões IN/OUT. Apare as extremidades dos tubos desgastadas ou deformadas com uma lâmina afiada para garantir um corte limpo e reto.
- Se o canal continuar a falhar, substitua o O-ring por um novo e compatível especificado pelo fabricante.
- Clique em Volume para medir novamente os volumes do headspace. Clique em Sair. Certifique-se de que a coluna Volume da guia Configuração da câmara esteja preenchida para todos os canais ocupados.
- No menu principal, selecione Ferramentas > Menu de serviço. Confirme se a sonda de temperatura primária, que mede a temperatura da incubadora, está a 30 °C ± 2 °C e estável.
- Clique em Executar. Salve o arquivo usando um nome descritivo que inclua a data (por exemplo, 030325PositiveControlValidation). Registre o nome do arquivo na folha de dados.
- Selecione Experimento > Exibir > Gráficos para exibir gráficos em tempo real. A produção de biogás aparece como taxas de produção de CO2 positivas. Os controles negativos podem flutuar em torno de zero; no entanto, sua taxa média deve ser zero ou positiva.
- Se o sistema incluir secadores de ar de condensação, mantenha um registro diário da condensação visível na tubulação. Agite suavemente a tubulação para interromper os bloqueios e permitir a drenagem, se necessário.
- Atualize os arquivos de dados (arquivos de texto ASCII) no final de cada intervalo de amostragem. Os dados, incluindo temperatura, % de gás (composição do gás), taxa e acúmulo, podem ser baixados para vários outros pacotes de software durante o experimento ou no final.
- Para abrir .dat arquivos em uma planilha, inicie o Excel e selecione Arquivo > Abrir. Navegue até a pasta que contém o arquivo .dat. No menu suspenso do tipo de arquivo, selecione Todos os arquivos e escolha o arquivo desejado.
- Quando solicitado pelo Assistente de Importação de Texto, selecione Delimitado como o tipo de arquivo e clique em Avançar.
- Em Delimitadores, marque a caixa Vírgula. Certifique-se de que nenhum outro delimitador esteja selecionado. A janela de visualização deve exibir dados separados em colunas. Clique em Concluir para carregar os dados na planilha.
- Salve o arquivo como um formato .xlsx ou .csv para análise e arquivamento posteriores.
- Periodicamente, analise os dados para garantir que as réplicas do tratamento sejam consistentes. O erro-padrão dos replicados do tratamento deve ser inferior a 5% da produção cumulativa média de CO2 . Repita os testes que falham nesse limite.
- Clique em Parar quando a incubação for concluída.
- As incubações podem durar de 10 a 90 dias. Se os materiais de ensaio forem altamente biodegradáveis, terminar a incubação quando a produção cumulativa de CO2 estabilizar ou prolongá-la se não for observada degradação após 90 dias.
- Concluir as experiências quando não se observar uma produção líquida de gás durante, pelo menos, 5 dias nos recipientes de controlo e de ensaio. Nenhuma produção líquida é definida como menos de 1% de mudança na porcentagem de biodegradação em 5 dias.
- Desligue o sistema ou prepare-se para o próximo experimento.
9. Quebrando o experimento
- Registre a temperatura da incubadora (sonda do termistor e leitura da incubadora). Desconecte a tubulação dos vasos do reator do respirômetro e pese cada sample vaso do reator usando uma balança de precisão. Registre os pesos para determinar se ocorreu alguma perda de peso/água durante o período de incubação.
- Subamostre 20-30 mL de água do mar de cada vaso do reator para medir o pH e a salinidade e compare esses valores com os registrados na etapa 3.4 para verificar a estabilidade durante a incubação. Filtre mais 60 mL através de um filtro de acetato de celulose com baixo teor de nitrogênio de 0,2 μm em um frasco de polietileno lixiviado com ácido para análise de N e P inorgânico dissolvido seguindo os métodos padrão na Etapa 1.5.
NOTA: As amostras residuais de água do mar podem ser filtradas para remover os plásticos restantes, diluídas para reduzir as concentrações de nutrientes e descartadas por descarga de drenagem de acordo com os regulamentos institucionais e locais. - Enxágue os recipientes, anéis de vedação, tampas de metal e tampas de rosca com água da torneira. Coloque a vidraria em um banho de ácido HCl a 10% por pelo menos 24 h. Autoclave e armazene coberto com papel alumínio para a próxima incubação
10. Cálculo da porcentagem de biodegradação
- Calcular o carbono total no substrato experimental/de controlo do seguinte modo:
onde % C (teor de carbono) é determinado por meio de análise elementar.
NOTA: O carbono total nos substratos experimentais e de controlo pode sofrer a seguinte transformação bioquímica durante a incubação aeróbia:
C + O2 → CO2
Cada mmol (12 mg) de carbono orgânico do substrato experimental/controlo pode ser convertido em 1 mmol de CO2 gasoso. Um mmole de gás produzido ocupa 22,4 mL em temperatura e pressão padrão (STP). - Calcule a porcentagem de biodegradação da seguinte forma:
em que Cg = quantidade de carbono gasoso produzida a partir do substrato experimental/controlo e controlo negativo (apenas inóculo de água do mar), mmoles, e Ci = quantidade de carbono adicionada no substrato experimental, mmoles. - Calcular o erro-padrão, se, da percentagem de biodegradação do seguinte modo:
em que n1 e n2 = número de substratos experimentais/de controlo replicados e de recipientes de reatores de controlo negativo, respetivamente, e s = desvio-padrão do carbono gasoso total produzido. - Calcule os limites de confiança (CL) de 95% da seguinte maneira:
onde t = valor de distribuição t para 95% de probabilidade com (n1 + n2 − 2) graus de liberdade, portanto, n = 3 + 3 − 2 = 4.
11. Fim do protocolo
- Depois de concluir os cálculos e a análise de dados, compile os resultados no relatório final ou insira-os em um banco de dados compartilhado de acordo com os planos de gerenciamento de dados do projeto ou da instituição. Certifique-se de que todos os materiais sejam descartados de acordo com as diretrizes institucionais de resíduos perigosos e que todos os equipamentos sejam limpos e armazenados.
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Resultados
Os resultados dos testes de biodegradação marinha são apresentados. A biodegradação foi avaliada para cada amostra medindo a proporção de carbono convertido em dióxido de carbono. Os gráficos de biodegradação cumulativa, taxa e porcentagem normalmente exibem uma fase de atraso, seguida por uma fase de crescimento e, eventualmente, um platô. O tempo e a magnitude dessas fases dependem do material da amostra, das condições experimentais e da composição do inóculo da água do mar.
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Discussão
O desempenho do controle positivo determina a validade do teste. É necessário um mínimo de 70% de biodegradação de um substrato de controle positivo biodegradável facilmente marinho (por exemplo, celulose de grau analítico, papel Kraft, etc.), com base em seu rendimento máximo teórico de gás. Este benchmark verifica condições favoráveis e atividade microbiana suficiente na água do mar natural durante a incubação. O não cumprimento desse limite indica um problema potencial com a preparaçã...
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem à Columbus Instruments e ao Laboratório de Biodegradabilidade da Escola de Ciência e Tecnologia Marinha da Universidade de Massachusetts Dartmouth pelo suporte técnico e acesso às instalações. O financiamento para o Sistema de Respirometria Micro-Oxymax da Columbus Instruments e o início do laboratório foi fornecido pela PrimaLoft e pela Massachusetts Technology Collaborative.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0.2 & micro; M, filtro de acetato de celulose de 47 mm | Geofiltro Geotécnico | 83100056 | Filtrar água do mar |
| Pipeta volumétrica de 100 mL | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 13-650-2U | Classe A; ácido lixiviado e enxaguado com água desionizada |
| Béqueres de vidro de 100-600 mL | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 50-194-5690 | Classe A; ácido lixiviado e enxaguado com água desionizada |
| Bolinhas de fresagem de 20 mm | Retsch | 53680062 | Aço inoxidável. Usado com potes de moagem para moagem criogênica de polímeros |
| Potes de moagem de 50 mL | Retsch | 14620216 | Aço inoxidável. Usado com moinhos de mistura de 400 e bolas de moagem de 20 mm para moagem criogênica de polímero |
| Pipeta volumétrica de 75 mL | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 13-650-2T | Classe A; ácido lixiviado e enxaguado com água desionizada |
| Bomba de ar e sistema de bolhas | Tetra | 77846 | Aerar água do mar durante o equilíbrio pré-incubação |
| Papel alumínio | Fisherbrand | 01-213-100 | Cobertura para autoclavar e armazenar limpo |
| Cloreto de amônio (NH4Cl) | Termo Fisher Científico, Fisher Química | A661-500 | Pico de nutrientes na água do mar |
| Balanço analítico | Mettler | AT201 | Pesar substratos experimentais e de controle |
| Autoclave | Tuttnauer | MFI-TTN-3870EA | Para esterilizar recipientes e conjuntos de tampas |
| Micro-Oxymax Base 120VAC Canal Único | Columbus Instruments | 0135-8000 | Usado para armazenar controles positivos e polímeros |
| Gás de calibração | Airgas | X03NI92P3000001 | Misturas Primárias de Gás Padrão; 2,7% Dióxido de carbono, 4,5% Metano, equilíbrio Nitrogênio |
| Monitor de Computador | Dell | 210-BMKK | Monitor hub USB-C Dell Pro 24 Plus. Usado com computador para rodar o software Micro-Oxymax |
| Luvas Criogênicas | Thermo Fisher Scientific, Tempshield, Luvas Criogênicas | 11-394-306 | Usado para lidar com nitrogênio líquido |
| Termômetro de Mostrador | Thermo Fisher Scientific, H-B Instrument Durac | 13-201-433 | Termômetro calibrado para temperatura da água do mar no momento da coleta |
| Pipetas descartáveis | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 13-711-7M | Enxágue as laterais do recipiente para liberar o material |
| Gabinete ENC52 Controlado por Temperatura e Luz | Columbus Instruments | 4740-4054 | Manter as condições de temperatura e luz |
| Pinças de Frasco | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | S07387 | Usado para manipular potes de moagem em nitrogênio líquido |
| Frascos, 250 mL | DWK Ciências da Vida | 14395-250 | Vasos de reatores de amostra |
| Frascos de concha de vidro com fechos no estilo plugue | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-339-26D | Armazenamento de amostras |
| Profundímetro portátil H22PX | Fuzileiros Navais Ocidentais, Marinha de Norcross | 6849368 | Determinar a profundidade do local de coleta de água do mar |
| GPS portátil 73 | Garmin | 10-01504-00 | Usado para determinar a localização do local de coleta de água do mar |
| Panela HDPE | Termocientífica, Nalgene | 13-359-26 | Usado para usar vidros com lixiviação ácida em solução de 10% HCl |
| Ácido clorídrico (solução de água ácida) | Termo Fisher Científico, Fisher Química | A144-212 | Certificado ACS Plus, 36,5 a 38,0%. Verificação do sensor CO2 e vidros com lixiviação ácida |
| Exaustor de fluxo laminar | Ciências do Ar | FLOW-48-A | Minimizar contaminantes no ar durante a preparação da amostra |
| Niskin grande; Só garrafa Beta Plus - 8,2L horizontal, PVC | Ciência Primeiro | 3-1980-H65 | Para coleta de água do mar no píer ou barco |
| Panela de Nitrogênio Líquido | Thermo Fisher Scientific, Bel Art Magic Touch 2 | 11-999-063 | Segure nitrogênio líquido |
| Vaso de transferência de nitrogênio líquido, 10 L | Termo Científica | TY509X2 | Armazenar e dispensar nitrogênio líquido para criomoagem |
| Nitrogênio Líquido, Grau Industrial, 22 PSI | Airgas | NI 180LT22 | Usado para fragilizar e moer polímeros |
| Agitador Mecânico de Peneira | Humbolt, Grainger | 5DPL6 | Análise de peneiras para distribuição do tamanho das partículas |
| Micro-Oxymax | Columbus Instrumentts | 7395-113-D64 | Anel de vedação com silicone, porta metálica com 3 conexões, e tampa de parafuso GL45 & nbsp; |
| Interface de Expansão Micro-Oxymax 10 de Canais | Columbus Instruments | 0135-8101 | Componente do Sistema de Respirometria |
| Micro-Oxymax Respirometer (sensor de CO2 3%) | Columbus Instruments | 0135-8403 | Infravermelho não dispersivo |
| Moinho Misturador 400 | Retsch | 207450001 | Moinho de mistura 400. Usado para moagem criogênica de polímeros |
| Controlador motorizado de pipeta | Eppendorf | 4430000018 | Transferir água do mar para vasos de reatores de amostra |
| Frasco de Boca Estreita com Âmbar HDPE Qualidade de Laboratório, 1 L | Termocientífica, Nalgene | 02-923-5 | Amostra discreta de água do mar inteira |
| Malha de Náilon 20 Mícrons | ELKO Filtering Co. | 41718 | Usado para peneirar água do mar bruta para remover partículas maiores e heterogêneas |
| Agitador Orbital ao Ar Aberto | Thermo Fisher Scientific | SK4000 | Manter o movimento orbital dos vasos do reator durante a incubação |
| OptiPlex 5090 Computador de Pequeno Formato | Dell | C0SL03 | Computador Desktom usado para rodar o software Micro-Oxymax |
| Medidor de pH/Cond | Mettler Toledo, SevenExcellence S470-Basic | 30046252 | Medidor de pH/condutividade de bancada para medir o inoculo inicial e final de água do mar |
| Garrafa de polietileno, 60 mL | Qorpak | PLC-03564 | Amostra discreta de água do mar filtrada |
| Fosfato de potássio monobásico (KH2(PO4)) | Thermo Fisher Scientific, Fisher BioReagentes | BP362-500 | Pico de nutrientes na água do mar |
| Equilíbrio de precisão | Sartorius | Practum2102-1S | Pesar o tare e o peso total dos recipientes |
| Round Carboy, 20 L | Thermo Fisher Scientific | 02961A | Lixiviação de ácido para armazenamento de água do mar |
| Óculos de Segurança | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 19-181-513 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand, Scoopula | 01-257-567 | Scoopula de laboratório em aço inoxidável |
| Peneiras | Advantech, Grainger | 40PR18-40PR55 | Peneiras de aço inoxidável. O número e tamanhos de peneiras dependerão do material a ser testado. |
| Sigmacell Celulose, Tipo 101 | Sigma-Aldrich | 435236-250G | Pó, substrato de controle positivo |
| Bicarbonato de sódio | Termo Fisher Científico, Fisher Química | S233-500 | Verificação do sensor CO2 |
| Sulfito de sódio, anidro, 98% | Termo Fisher Científico, Termo Científico Químico | AAA1793336 | Verificação do sensor CO2 |
| Termômetro/sonda de termistor | Fisherbrand | 15-079-700 | Verifique a temperatura da incubadora |
| Barômetro de Mostrador de Precisão Rastreável | Fisherbrand | 14-648-51 | Registrar a pressão atmosférica no início do experimento |
| Victor Radiador de Hidrogênio de Média Capacidade, Metano de Dois Estágios, CGA - 350 | AirGas | VIC0781-3559 | Regulador de gás de calibração & nbsp; |
| Frascos volumétricos, 2 L | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | FB4002000 | Classe A; ácido lixiviado e enxaguado com água desionizada. Usado para preparar água do mar com nutrientes e adulteração. |
| Panelas de pesagem | Thermo Fisher Scientific | 02-202-101 | Polietileno |
Referências
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