Teste de biodegradação aeróbica de materiais usando um inóculo natural de água do mar marinho e respirômetro de circuito fechado

Resumo

O protocolo descreve o procedimento operacional padrão para testar materiais potencialmente biodegradáveis, sintéticos e naturais, em condições aeróbicas, usando um inóculo natural de água do mar e um sistema automatizado de respirometria de circuito fechado.

Resumo

A avaliação adequada de materiais biodegradáveis depende da ampla adoção de métodos de teste padrão. Embora esses métodos existam, a capacidade de teste permanece limitada, limitada pelo custo e pelo tempo inicial para estabelecer novos laboratórios. Este protocolo de triagem modificado é baseado no ASTM International D6691-24a, Método de Teste Padrão para Determinar a Biodegradação Aeróbica de Materiais Plásticos no Ambiente Marinho por um Consórcio Microbiano Definido ou Inóculo Natural de Água do Mar. Ele avalia a biodegradação de materiais em um ambiente marinho, comparando os resultados com controles positivos e negativos, e usa um inóculo natural de água do mar suplementado com amônio e fosfato para evitar a limitação de nutrientes. Os materiais são expostos a esta água do mar enriquecida com nutrientes e incubados a 30 °C. Um respirômetro Micro-Oxymax mede a produção de biogás (dióxido de carbono, CO₂) ao longo do tempo. O grau de mineralização (biodegradação) é determinado pelo cálculo da proporção de carbono derivado do material convertido em carbono de biogás. A porcentagem de produção de CO₂ , expressa como uma fração do teor de carbono medido ou teórico, é relatada em função do tempo. O sistema de respirometria de circuito fechado acomoda uma variedade de vasos de reatores, preparados em triplicata para cada material, um controle negativo (apenas inóculo de água do mar) e um controle positivo (celulose de cromatografia em camada fina). Este método é importante para avaliar materiais no ambiente marinho e aborda a prevenção da poluição global.

Introdução

Os resíduos de plástico representam uma ameaça para os ecossistemas marinhos e para a saúde humana¹. A crescente preocupação com a poluição plástica, juntamente com os detritos marinhos de quaisquer materiais no oceano, ressalta a necessidade de soluções sustentáveis, como melhor gerenciamento de resíduos em fim de vida e materiais biodegradáveis que se biodegradam prontamente no ambiente marinho. Ao contrário dos plásticos sintéticos tradicionais, que persistem por décadas a séculos e geram microplásticos que se acumulam nas teias alimentares ^2,3,4, os materiais biodegradáveis, componentes orgânicos do carbono, podem ser metabolizados em CO 2 e metano (CH₄) ou assimilados em biomassa microbiana⁵. Compreender a biodegradação de materiais na água do mar é, portanto, fundamental para quantificar e mitigar os impactos ambientais dos detritos marinhos.

A biodegradação no ambiente marinho é controlada pela interação de variáveis espaço-temporais, incluindo disponibilidade de luz e nutrientes, pressão, temperatura, composição de espécies microbianas e natureza físico-química e estrutura do polímero, que determinam a taxa, o grau e o mecanismo de degradação⁶. Essas variáveis representam um desafio significativo para estudos de biodegradação baseados em laboratório que simulam ambientes marinhos. Este procedimento operacional padrão (SOP) usa água do mar natural como inóculo, capturando a comunidade microbiana in situ presente e registra variáveis relevantes, incluindo nutrientes dissolvidos na água do mar, carbono e nitrogênio particulados, clorofila, salinidade, pH e temperatura. Essa abordagem controlada baseada em laboratório otimiza as condições para promover a mineralização e permite medições diretas de biodegradação que não são viáveis in situ. O ASTM International D6691-24a, Método de Teste Padrão para Determinar a Biodegradação Aeróbica de Materiais Plásticos no Ambiente Marinho por um Consórcio Microbiano Definido ou Inóculo Natural de Água do Mar (doravante ASTM D6691), e este SOP foram desenvolvidos como uma ferramenta de triagem rápida e confiável para avaliar a biodegradabilidade de materiais 7,8,9,10.

Alinhado com ASTM D6691, um teste de triagem para biodegradabilidade inerente do polímero, este protocolo avalia a biodegradação de materiais em condições ideais, 30 °C, área de superfície máxima da amostra moída e excesso de nutrientes inorgânicos (nitrogênio, 130 mg/L; fósforo, 23 mg/L)⁹, para promover a mineralização e evitar limitações de nutrientes. Embora os testes de triagem ofereçam informações iniciais valiosas, testes adicionais, como amarrações costeiras e em alto mar, que medem a perda de peso em função do tempo, podem ser necessários para uma avaliação abrangente em condições marinhas naturais. Uma vez que esses testes de amarração costeira e em alto mar estimam a biodegradação com base na perda de peso em função do tempo^10,11, os pesquisadores devem primeiro realizar esse teste de triagem, que mede diretamente o metabolismo microbiano, antes de ir para um experimento de ancoragem costeira e em alto mar in situ, que também é mais caro.

O método de teste padrão ASTM D6691 descreve procedimentos para avaliar a biodegradação aeróbica de materiais plásticos não flutuantes em ambientes marinhos. Esta norma, juntamente com as normas de especificação, como a ASTM D7081 (Especificação Padrão para Plásticos Biodegradáveis Não Flutuantes no Ambiente Marinho; com foco na biodegradabilidade em meio aquoso, atualmente retirada da ASTM e sendo reformulada), fornece uma estrutura para certificar polímeros experimentais como biodegradáveis marinhos ^9,12. Em geral, uma especificação é um padrão de consenso da ASTM International que define os requisitos que um material, produto ou sistema deve atender. Ele garante que os materiais projetados para biodegradar em ambientes marinhos o façam dentro de prazos aceitáveis e não liberem aditivos potencialmente tóxicos, como corantes ou plastificantes.

Com base na ASTM D6691, este protocolo quantifica a taxa e o grau de biodegradação aeróbica de materiais (substrato experimental) na água do mar natural e expande os controles positivos de materiais (ou seja, celulose, papel Kraft, quitina/quitosana), historicamente mostrados como biodegradáveis no ambiente marinho ^7,9,10. O objetivo deste método é selecionar materiais sob condições otimizadas para ver se os materiais se biodegradam no ambiente marinho. O inóculo aproveita a comunidade microbiana natural presente na água do mar, coletada seguindo as diretrizes específicas descritas na ASTM. Essas diretrizes enfatizam o uso de água do mar com salinidade de aproximadamente 32, coletada em um local livre de poluentes como esgoto, despejo de produtos químicos ou derramamentos de óleo. O teste usa um respirômetro automatizado de circuito fechado com vasos de reator de 250 mL mantidos a 30 ° C, cada um contendo 75 mL de água do mar e ~ 20 mg do substrato experimental ou de controle⁸. A mineralização (biodegradação) é expressa como a porcentagem de biogás de carbono líquido (CO_2-C) produzido em relação à massa inicial de carbono adicionada. Este método não leva em conta a assimilação de carbono em biomassa microbiana.

Protocolo

1. Recolha e caracterização da água do mar

1. Identifique um local de coleta de água do mar não afetado por águas residuais, produtos químicos, manchas de óleo ou forte influência de água doce.
2. No local de coleta, registre a fonte (localização, latitude e longitude, profundidade de coleta, profundidade total e temperatura), data da coleta da amostra e condições da água observadas.
3. Colete e combine amostras de água do mar de várias profundidades, locais e eventos de amostragem para promover uma composição diversificada da comunidade microbiana.
4. Em um garrafão de 20 L lixiviado com ácido, colete de 10 L a 20 L de água do mar usando uma garrafa grande de Niskin e transporte de volta ao laboratório.
5. Do garrafão, transfira 1 L de subamostra inteira de água do mar para uma garrafa de polietileno de alta densidade âmbar (HDPE) de 1 L lixiviada com ácido para análise laboratorial de carbono particulado e nitrogênio para condições iniciais de água do mar. A partir da amostra de 1 L, filtrar (0,2 μm; acetato de celulose com baixo teor de azoto) e recolher uma subamostra de 60 ml num frasco de polietileno lixiviado com ácido para análise dos constituintes inorgânicos e orgânicos dissolvidos de azoto (N) e fósforo (P).
6. Rotule as subamostras com o nome do projeto, a ID da amostra e a data. Medir as concentrações de NH₄⁺ pelo método do indofenol (4500-NH3)^13,14 e os níveis de PO^{4 3-} pelo método da solução única (4500-P E)^13,15. Quantificar o azoto e o carbono particulados utilizando o método de análise elementar¹⁶. Medir as concentrações de clorofila-a seguindo os protocolos descritos por Parsons et ^al.17(10150 A, 10150 C)¹³.
   NOTA: As análises da qualidade da água relacionadas a nutrientes são opcionais. Este protocolo pressupõe que as análises sejam conduzidas por um laboratório externo.
7. Cubra frouxamente a abertura do garrafão para manter as condições aeróbicas e armazene a água do mar a 30 °C no escuro por até 7 dias.
   NOTA: A água do mar também pode ser arejada usando uma bomba de ar e um sistema de borbulhadores.

2. Preparação do substrato experimental

1. Adicione 10-15 g de substrato experimental (ou seja, polissacarídeos naturais, madeira, fibras, polímeros) que podem estar na forma de pellets, fragmentos e peças formadas a um frasco de fresagem de aço inoxidável de 50 mL com uma esfera de aço de 20 mm. Triturar o substrato experimental até obter um tamanho de partícula uniforme (0,10-0,25 mm) antes do início do ensaio.
2. Mergulhe o frasco de moagem em nitrogênio líquido e fragilize por 15 min até que o nitrogênio líquido pare de ferver.
   CUIDADO: O nitrogênio líquido é um líquido criogênico que pode causar queimaduras, ferimentos ou queimaduras. Leia e siga todas as Fichas de Dados de Segurança antes de usar. Use equipamento de proteção individual adequado.
3. Prenda o jarro de fresagem no acessório do moinho de bolas e defina os parâmetros do instrumento para 30 Hz e 2:30 min e pressione Iniciar. Repita 4x com 30 s de resfriamento em nitrogênio líquido entre as tentativas. Se o material for um polímero com baixa temperatura de transição vítrea, execute ciclos de fresagem adicionais conforme necessário para produzir uma distribuição uniforme do tamanho das partículas.
4. Verifique a uniformidade de tamanho e caracterize a distribuição de tamanho de partícula por análise de peneira, conforme descrito na ASTM D1921-96¹⁸. Monte peneiras padrão abrangendo a faixa de tamanho de partícula esperada, com o menor tamanho de malha na parte inferior. Coloque a amostra moída na peneira superior e prenda a pilha de peneiras em um agitador mecânico. Agite até que as partículas passem pela malha. Colete e pese o material retido de cada peneira para calcular a distribuição do tamanho das partículas. Use o mesmo conjunto de peneiras em todos os tratamentos para manter a comparabilidade. Registre a distribuição na planilha de dados.
5. Determinar o teor de carbono por subamostra do peso seco do substrato experimental moído por análise elementar¹⁶.
   NOTA: Este protocolo pressupõe que a análise elementar é conduzida por um laboratório externo.

3. Preparação dos nutrientes adicionais para a água do mar

1. Encher um balão volumétrico de 2 ou 4 l até meio com água do mar. O volume total necessário depende do número de vasos do reator a serem usados no experimento. Cada vaso do reator conterá 75 mL de água do mar. Se a fonte de água do mar contiver altas concentrações de matéria orgânica particulada, peneire a água do mar através de uma malha de 20 μm para eliminar a contaminação heterogênea por partículas grandes.
2. Usando uma balança de precisão com sensibilidade de 0,001 g, tarar um prato de pesagem e pesar 0,5 g/L de cloreto de amônio (NH₄Cl) e, em seguida, 0,1 g/L de fosfato de potássio monobásico (KH₂PO₄) com base em 2 L ou 4 L de água do mar.
   CUIDADO: O cloreto de amônio pode causar danos ou irritação nos olhos. Leia e siga todas as fichas de dados de segurança antes de usar e use equipamento de proteção individual adequado.
   NOTA: Descarte os resíduos monobásicos de cloreto de amônio e fosfato de potássio em recipientes dedicados para resíduos perigosos de acordo com os procedimentos institucionais e regulamentos locais. Pequenos volumes de soluções diluídas (<1%) NH₄Cl e KH₂PO₄ podem ser elegíveis para descarte de drenagem após diluição com água abundante, se permitido pela instituição e pela autoridade local de águas residuais.
3. Adicione os nutrientes inorgânicos ao balão volumétrico de 2 L ou 4 L, dê volume com água do mar, adicione uma barra de agitação e mexa em uma placa de agitação até que todos os sais se dissolvam. A solução deve ser límpida, sem partículas visíveis.
4. Subamostre 20-30 mL da água do mar suplementada com nutrientes para medição de pH e salinidade. Filtre mais 60 mL através de um filtro de acetato de celulose com baixo teor de nitrogênio de 0,2 μm em um frasco de polietileno lixiviado com ácido para análise de N e P inorgânico dissolvido seguindo os métodos padrão na etapa 1.5.
5. Meça o pH e a salinidade em um medidor de bancada seguindo as instruções do fabricante. Espera-se uma diminuição do pH de aproximadamente uma unidade para água do mar com força total devido à acidez do suplemento nutritivo.

4. Preparação para a incubação do vaso do reator

1. Lixivie com ácido todos os vidros, incluindo vasos de reator de 250 mL para as amostras e pipeta volumétrica de 75 mL em ácido clorídrico (HCl) a 10% por 24 h e enxágue 3x com água deionizada.
   CUIDADO: O HCl pode causar queimaduras graves e danos aos olhos. Leia e siga todas as Fichas de Dados de Segurança antes de usar. Use equipamento de proteção individual adequado.
   NOTA: 10% dos resíduos de HCl podem ser neutralizados com bicarbonato de sódio para formar uma solução neutra antes do descarte. Realizar a neutralização de acordo com os procedimentos institucionais de resíduos perigosos e os regulamentos locais aplicáveis.
2. Autoclave os vasos vazios do reator de 250 mL lixiviados com ácido, tampas com portas, anéis de vedação de silicone e tampas de rosca em uma autoclave a 121 ° C por 15 minutos antes do dia do experimento.
3. Rotule os frascos de amostra com o número do canal/ID correspondente aos recipientes que recebem amostras ou materiais de controle.
4. Com a balança analítica, tarar um frasco para injetáveis (com tampa) e pesar 20 mg (± 0,1 mg) do ensaio experimental ou de controlo, registar o peso total de leitura e retirar reservas. Repita para todas as réplicas experimentais e de controle.
   NOTA: Certifique-se de que os pesos sejam precisos. Recomenda-se pesar todos os substratos no mesmo dia e pela mesma pessoa.
5. Ligue a incubadora no dia anterior à adição dos recipientes e ajuste a temperatura para 30 °C. Ligue o respirômetro pelo menos 2 h antes de executar o diagnóstico do sistema e a calibração do sensor com base nas instruções do fabricante.
   NOTA: A preparação do vaso do reator pode prosseguir assim que a temperatura da incubadora atingir e manter 30 ± 2 °C.
6. Prepare a folha de dados registrando IDs/replicações de amostra e o número do canal correspondente. Organize os vasos do reator e os conjuntos de tampas (tampa com portas/O-ring) em ordem de número do canal/ID (certifique-se de que cada recipiente esteja claramente identificado). Verifique os anéis de vedação e as tampas/portas para garantir que estejam limpos, secos e intactos.

5. Configurando os vasos do reator

1. Use uma pipeta volumétrica de 75 mL com lixiviação ácida e um controlador de pipeta motorizado para dispensar 75 mL de água do mar suplementada com nutrientes em cada vaso do reator.
2. Remova uma pipeta descartável de água do mar (~ 3 mL) de cada recipiente e coloque-a em uma superfície limpa ao lado dela. Essa água do mar será usada para enxaguar os substratos experimentais e de controle moídos do frasco (Figura 1).
3. Transfira os substratos para recipientes apropriados.
4. Coloque um O-ring na borda do vaso do reator e, em seguida, coloque uma tampa de duas portas diretamente no topo do O-ring. Prenda o O-ring e a tampa no lugar com uma tampa de rosca.
5. Combine o vaso do reator com suas linhas de gás/condensação correspondentes. Insira firmemente as linhas de gás nas portas de entrada/saída apropriadas na tampa do recipiente.
6. Ligue a plataforma do agitador para 0.05 x g (modo contínuo). Faça uma verificação visual para garantir que todos os vasos estejam seguros e, em seguida, feche a porta da incubadora.
7. Registre a temperatura da incubadora (leitura e sonda do termistor) e a pressão atmosférica usando um barômetro.

Figura 1: Configuração e preparação do recipiente. (A) Adicionando água do mar, (B) adicionando a amostra e (C) adicionando o O-ring, a tampa de metal e a tampa de rosca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Iniciando o sistema de respirometria

1. Inicie o software no computador conectado. Verifique se o sistema detecta o hardware através da conexão RS-232. Se o hardware não for encontrado, uma notificação indicará que o dispositivo não está conectado e o programa deve ser reiniciado.
2. No menu principal do software, selecione Ferramentas > Diagnóstico > Operações básicas. Clique em Salvar arquivo de log. Clique em Válvulas e Sensores. O software indicará APROVADO ou REPROVADO para cada teste. Prossiga para a calibração de dois pontos do sensor de CO₂ somente se ambos os testes forem aprovados.

7. Calibrando o sensor de CO₂

1. Conecte uma coluna de cal sodática à porta de nitrogênio no painel traseiro da bomba de amostra para remover o CO₂ ambiente para calibração zero. Certifique-se de que a cal sodada tenha uma aparência branca como giz e não descolorida (por exemplo, rosa ou roxo).
2. Selecione Ferramentas > Calibração. Clique em Iniciar calibração no canto inferior direito. Quando solicitado, ajuste o sample fluxo para 0,5 L/min usando o sample controle da bomba do painel frontal. Clique em OK.
3. Quando o temporizador chegar a zero, pressione os botões de deslocamento para cima e para baixo no sensor de CO₂ para ajustar a leitura na tela para 0,000 (ou o mais próximo possível). Os valores ficarão verdes quando estiverem dentro do intervalo aceitável. Clique em Próximo gás.
4. Quando solicitado, conecte o cilindro de gás de calibração à porta de calibração no sample painel traseiro da bomba. Ajuste a pressão de saída do gás de calibração para 5 PSIG. Certifique-se de que o excesso de gás flua através da conexão em T, onde o usuário possa ouvir e sentir o gás próximo à conexão, antes de clicar em OK.
5. Quando o cronômetro chegar a zero, pressione os botões Up e Down span no sensor CO₂ para ajustar a leitura na tela para 2.700 (ou o mais próximo possível). Os valores ficarão verdes quando estiverem dentro do intervalo aceitável. Clique em Próximo gás para concluir a calibração.
   NOTA: As concentrações de gás de calibração são determinadas pela mistura de gás padrão primário certificada, conforme documentado no certificado de análise do fornecedor.

8. Configuração do experimento no software

1. Selecione Experimento > Configuração. Insira os números dos canais inicial e final nos menus suspensos com base nos canais ocupados.
   1. Defina Limite de atualização (%) como 0,50, Intervalo de atualização como N.A. e Janela de atualização (s) como Automático.
   2. Em Configuração Diversa, marque a caixa Sensores de Purgação; certifique-se de que Medição automática de volume, Consumo de O₂ Positivo e Ativar modo de fluxo aberto não estejam selecionados.
   3. Defina o Intervalo de amostra (horas) para 8,00 e a Duração do experimento (horas) para N.A. Defina as unidades de gás e tempo conforme necessário.
   4. Se estiver usando a sonda de temperatura primária para correção da temperatura de incubação, certifique-se de que a opção Inserir manualmente a temperatura da câmara não esteja selecionada. Marque a caixa Modo de ventilação e certifique-se de que o Modo de drenagem não esteja selecionado.
   5. Certifique-se de que o modo de ventilação anaeróbica não esteja selecionado.
2. Selecione Configuração da câmara. Insira rótulos de canal descritivos (por exemplo, NegCtrl_1, PosCtrl_2, Test_PHA_3).
3. Clique em Utilitários. Clique em Células na coluna EN somente para canais ocupados. Clique em Restrição. O software indicará APROVADO ou REPROVADO para cada canal. Prossiga somente se todos os testes de restrição forem aprovados.
4. Clique em Volume para medir os volumes do headspace.
   NOTA: O volume do headspace é igual ao volume do ar dentro do vaso do reator de amostra e da tubulação de circuito fechado. Confirme se os volumes são razoáveis para o tamanho do vaso e o comprimento da tubulação.
5. Clique em Vazamento. O software indicará APROVADO ou REPROVADO para cada canal com base no volume do headspace. Se um canal falhar, execute as etapas a seguir.
   1. Certifique-se de que o O-ring esteja limpo e livre de partículas e fibras e encaixado corretamente entre a borda do recipiente e a tampa de metal.
   2. Aperte a tampa de rosca. Verifique a conexão e a tubulação nas portas e conexões IN/OUT. Apare as extremidades dos tubos desgastadas ou deformadas com uma lâmina afiada para garantir um corte limpo e reto.
   3. Se o canal continuar a falhar, substitua o O-ring por um novo e compatível especificado pelo fabricante.
6. Clique em Volume para medir novamente os volumes do headspace. Clique em Sair. Certifique-se de que a coluna Volume da guia Configuração da câmara esteja preenchida para todos os canais ocupados.
7. No menu principal, selecione Ferramentas > Menu de serviço. Confirme se a sonda de temperatura primária, que mede a temperatura da incubadora, está a 30 °C ± 2 °C e estável.
8. Clique em Executar. Salve o arquivo usando um nome descritivo que inclua a data (por exemplo, 030325PositiveControlValidation). Registre o nome do arquivo na folha de dados.
9. Selecione Experimento > Exibir > Gráficos para exibir gráficos em tempo real. A produção de biogás aparece como taxas de produção de CO₂ positivas. Os controles negativos podem flutuar em torno de zero; no entanto, sua taxa média deve ser zero ou positiva.
10. Se o sistema incluir secadores de ar de condensação, mantenha um registro diário da condensação visível na tubulação. Agite suavemente a tubulação para interromper os bloqueios e permitir a drenagem, se necessário.
11. Atualize os arquivos de dados (arquivos de texto ASCII) no final de cada intervalo de amostragem. Os dados, incluindo temperatura, % de gás (composição do gás), taxa e acúmulo, podem ser baixados para vários outros pacotes de software durante o experimento ou no final.
    1. Para abrir .dat arquivos em uma planilha, inicie o Excel e selecione Arquivo > Abrir. Navegue até a pasta que contém o arquivo .dat. No menu suspenso do tipo de arquivo, selecione Todos os arquivos e escolha o arquivo desejado.
    2. Quando solicitado pelo Assistente de Importação de Texto, selecione Delimitado como o tipo de arquivo e clique em Avançar.
    3. Em Delimitadores, marque a caixa Vírgula. Certifique-se de que nenhum outro delimitador esteja selecionado. A janela de visualização deve exibir dados separados em colunas. Clique em Concluir para carregar os dados na planilha.
    4. Salve o arquivo como um formato .xlsx ou .csv para análise e arquivamento posteriores.
12. Periodicamente, analise os dados para garantir que as réplicas do tratamento sejam consistentes. O erro-padrão dos replicados do tratamento deve ser inferior a 5% da produção cumulativa média de CO₂ . Repita os testes que falham nesse limite.
13. Clique em Parar quando a incubação for concluída.
    1. As incubações podem durar de 10 a 90 dias. Se os materiais de ensaio forem altamente biodegradáveis, terminar a incubação quando a produção cumulativa de CO₂ estabilizar ou prolongá-la se não for observada degradação após 90 dias.
    2. Concluir as experiências quando não se observar uma produção líquida de gás durante, pelo menos, 5 dias nos recipientes de controlo e de ensaio. Nenhuma produção líquida é definida como menos de 1% de mudança na porcentagem de biodegradação em 5 dias.
14. Desligue o sistema ou prepare-se para o próximo experimento.

9. Quebrando o experimento

1. Registre a temperatura da incubadora (sonda do termistor e leitura da incubadora). Desconecte a tubulação dos vasos do reator do respirômetro e pese cada sample vaso do reator usando uma balança de precisão. Registre os pesos para determinar se ocorreu alguma perda de peso/água durante o período de incubação.
2. Subamostre 20-30 mL de água do mar de cada vaso do reator para medir o pH e a salinidade e compare esses valores com os registrados na etapa 3.4 para verificar a estabilidade durante a incubação. Filtre mais 60 mL através de um filtro de acetato de celulose com baixo teor de nitrogênio de 0,2 μm em um frasco de polietileno lixiviado com ácido para análise de N e P inorgânico dissolvido seguindo os métodos padrão na Etapa 1.5.
   NOTA: As amostras residuais de água do mar podem ser filtradas para remover os plásticos restantes, diluídas para reduzir as concentrações de nutrientes e descartadas por descarga de drenagem de acordo com os regulamentos institucionais e locais.
3. Enxágue os recipientes, anéis de vedação, tampas de metal e tampas de rosca com água da torneira. Coloque a vidraria em um banho de ácido HCl a 10% por pelo menos 24 h. Autoclave e armazene coberto com papel alumínio para a próxima incubação

10. Cálculo da porcentagem de biodegradação

1. Calcular o carbono total no substrato experimental/de controlo do seguinte modo:
   
   onde % C (teor de carbono) é determinado por meio de análise elementar.
   NOTA: O carbono total nos substratos experimentais e de controlo pode sofrer a seguinte transformação bioquímica durante a incubação aeróbia:
   C + O₂ → CO₂
   Cada mmol (12 mg) de carbono orgânico do substrato experimental/controlo pode ser convertido em 1 mmol de CO₂ gasoso. Um mmole de gás produzido ocupa 22,4 mL em temperatura e pressão padrão (STP).
2. Calcule a porcentagem de biodegradação da seguinte forma:
   
   em que C_g = quantidade de carbono gasoso produzida a partir do substrato experimental/controlo e controlo negativo (apenas inóculo de água do mar), mmoles, e C_i = quantidade de carbono adicionada no substrato experimental, mmoles.
3. Calcular o erro-padrão, s_e, da percentagem de biodegradação do seguinte modo:
   
   em que n1 e n2 = número de substratos experimentais/de controlo replicados e de recipientes de reatores de controlo negativo, respetivamente, e s = desvio-padrão do carbono gasoso total produzido.
4. Calcule os limites de confiança (CL) de 95% da seguinte maneira:
   
   onde t = valor de distribuição t para 95% de probabilidade com (n1 + n2 − 2) graus de liberdade, portanto, n = 3 + 3 − 2 = 4.

11. Fim do protocolo

1. Depois de concluir os cálculos e a análise de dados, compile os resultados no relatório final ou insira-os em um banco de dados compartilhado de acordo com os planos de gerenciamento de dados do projeto ou da instituição. Certifique-se de que todos os materiais sejam descartados de acordo com as diretrizes institucionais de resíduos perigosos e que todos os equipamentos sejam limpos e armazenados.

Resultados

Os resultados dos testes de biodegradação marinha são apresentados. A biodegradação foi avaliada para cada amostra medindo a proporção de carbono convertido em dióxido de carbono. Os gráficos de biodegradação cumulativa, taxa e porcentagem normalmente exibem uma fase de atraso, seguida por uma fase de crescimento e, eventualmente, um platô. O tempo e a magnitude dessas fases dependem do material da amostra, das condições experimentais e da composição do inóculo da água do mar.

Discussão

O desempenho do controle positivo determina a validade do teste. É necessário um mínimo de 70% de biodegradação de um substrato de controle positivo biodegradável facilmente marinho (por exemplo, celulose de grau analítico, papel Kraft, etc.), com base em seu rendimento máximo teórico de gás. Este benchmark verifica condições favoráveis e atividade microbiana suficiente na água do mar natural durante a incubação. O não cumprimento desse limite indica um problema potencial com a preparaçã...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0.2 & micro; M, filtro de acetato de celulose de 47 mm	Geofiltro Geotécnico	83100056	Filtrar água do mar
Pipeta volumétrica de 100 mL	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-650-2U	Classe A; ácido lixiviado e enxaguado com água desionizada
Béqueres de vidro de 100-600 mL	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	50-194-5690	Classe A; ácido lixiviado e enxaguado com água desionizada
Bolinhas de fresagem de 20 mm	Retsch	53680062	Aço inoxidável. Usado com potes de moagem para moagem criogênica de polímeros
Potes de moagem de 50 mL	Retsch	14620216	Aço inoxidável. Usado com moinhos de mistura de 400 e bolas de moagem de 20 mm para moagem criogênica de polímero
Pipeta volumétrica de 75 mL	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-650-2T	Classe A; ácido lixiviado e enxaguado com água desionizada
Bomba de ar e sistema de bolhas	Tetra	77846	Aerar água do mar durante o equilíbrio pré-incubação
Papel alumínio	Fisherbrand	01-213-100	Cobertura para autoclavar e armazenar limpo
Cloreto de amônio (NH4Cl)	Termo Fisher Científico, Fisher Química	A661-500	Pico de nutrientes na água do mar
Balanço analítico	Mettler	AT201	Pesar substratos experimentais e de controle
Autoclave	Tuttnauer	MFI-TTN-3870EA	Para esterilizar recipientes e conjuntos de tampas
Micro-Oxymax Base 120VAC Canal Único	Columbus Instruments	0135-8000	Usado para armazenar controles positivos e polímeros
Gás de calibração	Airgas	X03NI92P3000001	Misturas Primárias de Gás Padrão; 2,7% Dióxido de carbono, 4,5% Metano, equilíbrio Nitrogênio
Monitor de Computador	Dell	210-BMKK	Monitor hub USB-C Dell Pro 24 Plus. Usado com computador para rodar o software Micro-Oxymax
Luvas Criogênicas	Thermo Fisher Scientific, Tempshield, Luvas Criogênicas	11-394-306	Usado para lidar com nitrogênio líquido
Termômetro de Mostrador	Thermo Fisher Scientific, H-B Instrument Durac	13-201-433	Termômetro calibrado para temperatura da água do mar no momento da coleta
Pipetas descartáveis	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-711-7M	Enxágue as laterais do recipiente para liberar o material
Gabinete ENC52 Controlado por Temperatura e Luz	Columbus Instruments	4740-4054	Manter as condições de temperatura e luz
Pinças de Frasco	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	S07387	Usado para manipular potes de moagem em nitrogênio líquido
Frascos, 250 mL	DWK Ciências da Vida	14395-250	Vasos de reatores de amostra
Frascos de concha de vidro com fechos no estilo plugue	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	03-339-26D	Armazenamento de amostras
Profundímetro portátil H22PX	Fuzileiros Navais Ocidentais, Marinha de Norcross	6849368	Determinar a profundidade do local de coleta de água do mar
GPS portátil 73	Garmin	10-01504-00	Usado para determinar a localização do local de coleta de água do mar
Panela HDPE	Termocientífica, Nalgene	13-359-26	Usado para usar vidros com lixiviação ácida   em solução de 10% HCl
Ácido clorídrico (solução de água ácida)	Termo Fisher Científico, Fisher Química	A144-212	Certificado ACS Plus, 36,5 a 38,0%. Verificação do sensor CO2 e vidros com lixiviação ácida
Exaustor de fluxo laminar	Ciências do Ar	FLOW-48-A	Minimizar contaminantes no ar durante a preparação da amostra
Niskin grande; Só garrafa Beta Plus - 8,2L horizontal, PVC	Ciência Primeiro	3-1980-H65	Para coleta de água do mar no píer ou barco
Panela de Nitrogênio Líquido	Thermo Fisher Scientific, Bel Art Magic Touch 2	11-999-063	Segure nitrogênio líquido
Vaso de transferência de nitrogênio líquido, 10 L	Termo Científica	TY509X2	Armazenar e dispensar nitrogênio líquido para criomoagem
Nitrogênio Líquido, Grau Industrial, 22 PSI	Airgas	NI 180LT22	Usado para fragilizar e moer polímeros
Agitador Mecânico de Peneira	Humbolt, Grainger	5DPL6	Análise de peneiras para distribuição do tamanho das partículas
Micro-Oxymax	Columbus Instrumentts	7395-113-D64	Anel de vedação com silicone, porta metálica com 3 conexões, e tampa de parafuso GL45 & nbsp;
Interface de Expansão Micro-Oxymax 10 de Canais	Columbus Instruments	0135-8101	Componente do Sistema de Respirometria
Micro-Oxymax Respirometer (sensor de CO2 3%)	Columbus Instruments	0135-8403	Infravermelho não dispersivo
Moinho Misturador 400	Retsch	207450001	Moinho de mistura 400. Usado para moagem criogênica de polímeros
Controlador motorizado de pipeta	Eppendorf	4430000018	Transferir água do mar para vasos de reatores de amostra
Frasco de Boca Estreita com Âmbar HDPE Qualidade de Laboratório, 1 L	Termocientífica, Nalgene	02-923-5	Amostra discreta de água do mar inteira
Malha de Náilon 20 Mícrons	ELKO Filtering Co.	41718	Usado para peneirar água do mar bruta para remover partículas maiores e heterogêneas
Agitador Orbital ao Ar Aberto	Thermo Fisher Scientific	SK4000	Manter o movimento orbital dos vasos do reator durante a incubação
OptiPlex 5090 Computador de Pequeno Formato	Dell	C0SL03	Computador Desktom usado para rodar o software Micro-Oxymax
Medidor de pH/Cond	Mettler Toledo, SevenExcellence S470-Basic	30046252	Medidor de pH/condutividade de bancada para medir o inoculo inicial e final de água do mar
Garrafa de polietileno, 60 mL	Qorpak	PLC-03564	Amostra discreta de água do mar filtrada
Fosfato de potássio monobásico (KH2(PO4))	Thermo Fisher Scientific, Fisher BioReagentes	BP362-500	Pico de nutrientes na água do mar
Equilíbrio de precisão	Sartorius	Practum2102-1S	Pesar o tare e o peso total dos recipientes
Round Carboy, 20 L	Thermo Fisher Scientific	02961A	Lixiviação de ácido para armazenamento de água do mar
Óculos de Segurança	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	19-181-513
Scoopula	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand, Scoopula	01-257-567	Scoopula de laboratório em aço inoxidável
Peneiras	Advantech, Grainger	40PR18-40PR55	Peneiras de aço inoxidável. O número e tamanhos de peneiras dependerão do material a ser testado.
Sigmacell Celulose, Tipo 101	Sigma-Aldrich	435236-250G	Pó, substrato de controle positivo
Bicarbonato de sódio	Termo Fisher Científico, Fisher Química	S233-500	Verificação do sensor CO2
Sulfito de sódio, anidro, 98%	Termo Fisher Científico, Termo Científico Químico	AAA1793336	Verificação do sensor CO2
Termômetro/sonda de termistor	Fisherbrand	15-079-700	Verifique a temperatura da incubadora
Barômetro de Mostrador de Precisão Rastreável	Fisherbrand	14-648-51	Registrar a pressão atmosférica no início do experimento
Victor Radiador de Hidrogênio de Média Capacidade, Metano de Dois Estágios, CGA - 350	AirGas	VIC0781-3559	Regulador de gás de calibração & nbsp;
Frascos volumétricos, 2 L	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	FB4002000	Classe A; ácido lixiviado e enxaguado com água desionizada. Usado para preparar água do mar com nutrientes e adulteração.
Panelas de pesagem	Thermo Fisher Scientific	02-202-101	Polietileno