Estabelecimento e quantificação da infecção lítica de novo pelo herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi livre de células

Resumo

Este protocolo descreve um sistema in vitro para modelar a infecção lítica de novo do herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi usando vírions derivados de BAC16. O método permite a investigação da replicação e disseminação viral precoce. A produção de vírus infecciosos é quantificada por ensaios de unidades infecciosas baseados em GFP e PCR em tempo real de genomas virais encapsulados.

Resumo

O herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV), um gamaherpesvírus implicado em múltiplas malignidades humanas, pode sofrer replicação lítica durante a infecção primária, um processo que contribui para a disseminação viral, evasão imunológica e patogênese da doença. No entanto, a falta de sistemas in vitro robustos para infecção lítica de novo limitou os insights sobre os eventos iniciais da infecção. Aqui, apresentamos um protocolo tratável que emprega células HCT 116 de câncer colorretal humano como alvos para infecção com vírions livres de células derivadas de células produtoras de iSLK reativadas pelo cromossomo artificial bacteriano 16 (BAC16) KSHV. Este modelo recapitula as principais etapas da infecção primária, incluindo entrada viral, entrega do genoma, expressão gênica lítica e produção de progênie. A infecção é sincronizada por meio de espinografia e monitorada temporalmente. A produção do vírus é quantificada usando um sistema de leitura dupla que compreende ensaios de unidade infecciosa (UI) baseada em proteína de fluorescência verde (GFP) e qPCR de DNA viral encapsulado. Essas abordagens permitem uma análise detalhada da cinética de replicação viral. Embora o protocolo atual se concentre na detecção de eventos em estágio avançado, o sistema é adaptável para estudar as fases iniciais da infecção por meio de pontos de tempo de amostragem modificados. Ao oferecer uma plataforma reprodutível e escalável para infecção produtiva de novo , este sistema aborda uma lacuna metodológica na pesquisa de KSHV e apóia estudos mecanicistas de interação herpesvírus-hospedeiro e estratégias antivirais.

Introdução

O herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV) é um gama-herpesvírus humano etiologicamente ligado ao sarcoma de Kaposi (SK), linfoma de efusão primária (PEL), doença de Castleman multicêntrica (MCD) e síndrome de citocinas inflamatórias KSHV ^1,2. Como todos os herpesvírus, o KSHV estabelece persistência ao longo da vida no hospedeiro, alternando entre fases latentes e líticas. Embora a latência predomine na maioria das células infectadas, um subconjunto pode entrar no ciclo lítico durante a infecção primária (de novo) ou por meio da reativação da latência³. A replicação lítica envolve uma cascata ordenada de expressão gênica viral, culminando na replicação do genoma, montagem do vírion e liberação da progênie. Esse processo é fundamental para a disseminação viral e progressão da doença ^4,5. Os primeiros estudos da replicação lítica do KSHV geralmente dependiam da expressão ectópica de genes virais individuais em sistemas heterólogos. Embora informativas, essas abordagens não capturaram a regulação gênica coordenada e a interação vírus-hospedeiro presentes durante a infecção autêntica. O desenvolvimento do BAC-16, um cromossomo artificial bacteriano recombinante (BAC) que carrega o genoma completo do KSHV, permitiu a produção de vírus geneticamente manipuláveis que mantêm a competência para replicação e produção de vírion infeccioso⁶. Este sistema facilita a mutagênese direcionada e a análise funcional de genes virais no contexto do genoma completo. Modelos de reativação empregando células iSLK ou BCBL-1 latentemente infectadas com BAC-16 ou KSHV tornaram-se padrão para estudar a replicação lítica de KSHV. Esses sistemas permitem a indução sincronizada do ciclo lítico com agentes como doxiciclina (Dox) e butirato de sódio ^7,8. No entanto, como os modelos de reativação contornam as etapas iniciais da infecção - incluindo entrada viral, tráfego intracelular e a decisão inicial entre latência e replicação lítica - ele não pode recapitular totalmente a dinâmica da infecção primária.

Os modelos de infecção de novo oferecem uma estrutura complementar para abordar essas lacunas. Vários modelos de células primárias, como células epiteliais endoteliais e gengivais humanas, demonstraram apoiar a replicação lítica após a infecção por KSHV de novo 3,9,10,11. No entanto, sua vida útil limitada, alto custo e baixa receptividade à manipulação genética restringem sua reprodutibilidade e escalabilidade para estudos mecanicistas. Neste protocolo, descrevemos um modelo tratável e escalável de infecção lítica de KSHV de novo usando a linha celular de carcinoma colorretal humano HCT 116. Embora não seja um alvo natural do KSHV, as células HCT116 exibem permissividade robusta à infecção e fornecem uma plataforma estável e econômica adequada para estudos mecanicistas e aplicações de alto rendimento. Dada a capacidade limitada de formação de placas do KSHV em cultura, utilizamos o sistema BAC16 incorporando um repórter GFP para gerar vírus livre de células para infecção. Isso permite a visualização direta das células infectadas e a quantificação dos títulos infecciosos por meio de ensaios de unidade infecciosa (UI) baseados em GFP¹². Para complementar isso, o DNA associado ao vírion é medido por PCR quantitativo em tempo real (qPCR) após o tratamento com DNase, oferecendo um método sensível para detectar genomas virais encapsulados. Juntos, esses ensaios permitem uma análise quantitativa temporalmente resolvida da dinâmica de replicação lítica durante a infecção primária.

Este protocolo fornece uma plataforma confiável e flexível para modelar a infecção lítica de KSHV de novo in vitro, facilitando a dissecção de eventos iniciais no ciclo de vida viral, permitindo a avaliação da função gênica e da atividade antiviral.

Protocolo

O KSHV é classificado como um patógeno humano de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2). Realize todos os procedimentos envolvendo material infeccioso em um gabinete de biossegurança BSL-2 certificado. Descontamine as superfícies de trabalho com etanol 70% antes e depois de cada procedimento. Descarte todos os resíduos em conformidade com os regulamentos institucionais de biossegurança e as diretrizes BSL-2 da OMS. Uma visão geral esquemática de todo o fluxo de trabalho é fornecida na Figura 1. O procedimento inclui a geração de KSHV derivado de BAC16 livre de células a partir de células iSLK reativadas, infecção de novo de células HCT 116, quantificação de títulos de vírus por ensaio de unidade infecciosa (IU) e análise de qPCR de DNA viral associado ao vírion. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Produção de KSHV derivado de BAC16 sem células

1. Semeie cinco frascos T75 de células iSLK induzíveis por Dox que abrigam KSHV BAC 16 de tipo largo (WT) (iSLK-BAC16) com aproximadamente 80% de confluência. Incubar a 37 °C em uma incubadora umidificada de CO _{5 2} por 24 h.
2. Induzir a reativação lítica adicionando 1 μg / mL de Dox e 1 mM de butirato de sódio a cada frasco. Continue a incubação por 72-96 h.
3. Monitore as células diariamente por microscopia de contraste de fase. Colete o sobrenadante quando >90% das células exibirem arredondamento, descolamento da superfície do frasco e / ou lise visível, características do efeito citopático (CPE) indicativo de reação lítica robusta. Após a coleta do sobrenadante, descontamine e descarte as células iSLK-BAC16 induzidas liticamente usando alvejante a 10%.
4. Centrifugue os sobrenadantes coletados a 1.500 x g por 10 min a 4 ° C para remover os detritos. Filtrar o sobrenadante clarificado através de um filtro de membrana de polietersulfona (PES) de 0,45 μm sem perturbar o sedimento.
5. Transferir os sobrenadantes filtrados para tubos de ultracentrifugação. Pulverizar as partículas virais por centrifugação a 25.000 x g durante 3 h a 4 °C utilizando um rotor SW28.
6. Descarte cuidadosamente o sobrenadante em alvejante a 10%. Ressuspenda o pellet viral em 1 mL de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) sem soro.
7. Alicote o vírus ressuspenso em tubos de microcentrífuga estéreis com tampa de rosca de 1,5 mL. Conservar as alíquotas a -80 °C até à utilização. Determine os títulos infecciosos do estoque de vírus usando ensaios de unidade infecciosa (UI) baseados em GFP em células SLK (consulte a etapa 3).

2. Infecção de novo de células HCT116

NOTA: Uma alta multiplicidade de infecção (MOI) é fundamental para iniciar eficientemente a replicação lítica em células HCT116 após a infecção de novo por KSHV. Essa condição permite uma expressão gênica viral robusta e replicação produtiva sem a necessidade de estímulos exógenos. Um resultado representativo demonstrando o efeito dependente do MOI na produção de vírion é fornecido na Figura Suplementar 1A.

1. Semeie 1 x 10⁵ células HCT116 por poço em uma placa de cultura de tecidos de 12 poços. Incubar durante 24 h a 37 °C numa incubadora humidificada a 5% de CO ₂ .
2. Diluir o estoque de vírus concentrado em DMEM pré-aquecido e sem soro até um volume final de 250 μL para obter uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10.
3. Aspire o meio de cultura de cada poço. Adicione 250 μL de vírus diluído diretamente às células.
4. Centrifugue a placa a 1.500 x g por 1 h a 30 ° C para sincronizar a infecção (espinificação). Transfira imediatamente a placa para uma incubadora a 37 °C e continue a incubação por mais 1 h.
5. Aspire o inóculo e lave as células três vezes com PBS pré-aquecido para remover o vírus residual. Adicione 1 mL de DMEM completo a cada poço.
6. Monitore a expressão de GFP em células infectadas por microscopia de fluorescência 36 h, 60 h e 96 h pós-infecção. Em cada momento, recolher 1 ml de sobrenadante de cultura de cada alvéolo.
   NOTA: Após a coleta do sobrenadante, as células HCT116 infectadas por KSHV podem ser retidas para aplicações a jusante, como extração de RNA, análise de proteínas, imunofluorescência ou citometria de fluxo, com base em objetivos experimentais.
7. Centrifugar os sobrenadantes recolhidos a 1.500 x g durante 10 minutos a 4 °C para remover os restos celulares. Transferir sobrenadantes clarificados para tubos novos. Congelar rapidamente em azoto líquido e conservar a -80 °C para análise posterior.

3. Ensaio de unidades infecciosas (ensaio IU)

NOTA: As células SLK são permissivas à entrada de KSHV e suportam a expressão gênica lítica precoce. Este ensaio quantifica as unidades infecciosas com base na expressão de GFP em células SLK infectadas após exposição a sobrenadantes contendo vírus diluídos em série.

1. Semeie 1 x 10⁴ células SLK por poço em uma placa de 96 poços 24 h antes da infecção. Certifique-se de que as células sejam distribuídas uniformemente e atinjam ~ 60% -70% de confluência no dia da infecção.
2. Rotule nove tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para diluições duplas em série: Tubo 1 (não diluído, 1:1), Tubo 2 (1:2), Tubo 3 (1:4), Tubo 4 (1:8), Tubo 5 (1:16), Tubo 6 (1:32), Tubo 7 (1:64), Tubo 8 (1:128) e Tubo 9 (1:256).
3. Adicione 200 μL de sobrenadante de vírus ao tubo 1. Adicione 100 μL de DMEM pré-aquecido e sem soro a cada um dos tubos 2 a 9. Para iniciar a série de diluições, transferir 100 μl do tubo 1 para o tubo 2 e homogeneizar pipetando para cima e para baixo. Em seguida, transfira 100 μL do Tubo 2 para o Tubo 3 e repita esse processo sequencialmente através do Tubo 9, misturando bem a cada etapa.
   NOTA: Cada tubo deve conter um volume final de 100 μL. Efectuar todas as diluições em triplicata.
4. Aspirar o meio de cultura das células SLK. Adicione 100 μL de cada diluição de vírus aos poços designados. Use 27 poços no total (3 poços por diluição de 1:1 a 1:256).
5. Centrifugue a placa de 96 poços a 1.500 x g por 1 h a 30 °C para promover a adsorção do frasco. Transferir a placa para uma incubadora de CO ₂ a 37 °C durante mais 1 h.
6. Remova o inóculo e adicione suavemente 100 μL de DMEM completo a cada poço. Incubar a placa durante 24 h a 37 °C.
7. Colha as células e analise a expressão de GFP por citometria de fluxo. Registre o número de células positivas para GFP por poço.
8. Calcular as unidades infecciosas por ml (UI/ml) utilizando a seguinte fórmula¹³:
   UI/mL = [(número de células GFP-positivas por alvéolo)/volume de inóculo (ml)] x fator de diluição. Determinar o título final do vírus utilizando a última diluição com células GFP-positivas detetáveis

4. Quantificação de genomas virais encapsulados por qPCR

1. Adicione DNase I a uma concentração final de 100 U / mL a 400 μL de sobrenadante clarificado (consulte a etapa 1 para esclarecimento do sobrenadante e remoção de detritos). Incube por 15 min a 37 ° C para digerir DNAs virais e celulares não encapsulados. Um resultado representativo demonstrando a especificidade e eficácia do tratamento com DNase é mostrado na Figura Suplementar 1B.
2. Adicione EDTA a uma concentração final de 50 mM para interromper a reação DNase. Incubar a 75 °C durante 15 min para inativar a DNase I.
3. Extraia o DNA viral do sobrenadante tratado com DNase usando o DNA Mini Kit de acordo com o protocolo do fabricante.
4. Eluir o DNA viral em 30 μL de tampão de eluição. Use 5 μL de DNA eluído para cada reação de qPCR.
5. Amplifique o quadro de leitura aberto KSHV 73 (ORF 73) usando os seguintes primers: Forward: 5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'; Reverso: 5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3.
6. Prepare reações de qPCR em triplicado usando SYBR Green Master SuperMix. Configure as condições de ciclagem da seguinte forma: Desnaturação inicial: 95 °C por 3 min; Amplificação: 40 ciclos de 95 °C por 10 s, 52 °C por 30 s e 72 °C por 30 s; Análise da curva de fusão: rampa padrão para especificidade do amplicon.
7. Gere uma curva padrão usando diluições seriais de 10 vezes do DNA viral derivado de BAC-16, variando de 10⁹ a 10¹ cópias por reação. Plote os valores de Ct em relação ao log₁₀ do número da cópia de entrada para avaliar a linearidade do ensaio. Uma curva padrão representativa é mostrada na Figura Suplementar 1C.
8. Determine o número de cópias do genoma viral comparando os valores de Ct com a curva padrão. Normalize e relate os resultados como cópias de DNA viral por mL de sobrenadante.

Resultados

Para quantificar o título de vírus infeccioso, os sobrenadantes colhidos 72 h após a reativação lítica das células iSLK-BAC16 foram submetidos a diluição serial dupla e usados para infectar células SLK. O número de células SLK positivas para GFP em cada diluição é mostrado na Figura 2A, e as unidades infecciosas correspondentes (UI) por mL foram calculadas e apresentadas na Figura 2B. Para avalia...

Discussão

A modelagem da infecção lítica de novo do KSHV há muito é prejudicada pela forte propensão do vírus a estabelecer latência na maioria dos tipos de células permissivas. Embora certas células primárias, como as células epiteliais endoteliais e orais, tenham demonstrado apoiar a replicação lítica após a infecção de novo ^9,10, sua vida útil limitada, alto custo e dificuldade técnica na manutenção da cultura reduzem ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,45 µ m filtro de polietersulfome (PES)	VWR	76479-020
Biorender	Biorender	N/A	O design gráfico foi criado com BioRender.com, para o qual os autores possuem licença
Sistema de PCR em tempo real CFX Opus 96	Bio-Rad	184-5072
DMEM completo			O meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Sigma-Aldrich) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS; Gibco), 2 mM de L-glutamina (Gibco) e 100U/ml de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep; GenClone).
DNase I	Biolabs da Nova Inglaterra	M0303S
Doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891
Citômetro de fluxo LSR II 18	BD Biociência	N/A
PerfeCTa SYBR Green Master SuperMix	Quantabio	95054-02K
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	56304
butirato de sódio (NaB)	Sigma-Aldrich	B5887
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0	Thermo Fisher	15575020