Avaliação da hiperemia reativa pós-oclusiva na pele da pata de rato usando imagens de contraste de manchas a laser

Resumo

Este protocolo apresenta um método para avaliar parâmetros de hiperemia reativa pós-oclusiva na pele de um rato anestesiado usando imagens de contraste de manchas a laser e medida invasiva da pressão arterial.

Resumo

A imagem de contraste de manchas a laser (LSCI) é uma técnica moderna e não invasiva para avaliar a perfusão microvascular em humanos e animais de laboratório. A combinação da LSCI com a medida invasiva da pressão arterial (PA) e um teste de oclusão vascular permite o estudo da hiperemia reativa pós-oclusiva (DORPO), fornecendo uma avaliação da reserva de fluxo sanguíneo microvascular e da reatividade vascular. Este artigo demonstra a técnica de uso do LSCI para registrar e visualizar PORH na pata traseira de um rato sob anestesia geral. Um manguito pneumático especial é inflado para criar uma oclusão vascular temporária (180 s) ao nível da tíbia. A avaliação da PORH subsequente (pico de hiperemia e índices cinéticos) pode fornecer informações adicionais sobre os mecanismos e a gravidade do processo patológico em estudo (choque circulatório, insuficiência cardíaca, hipertensão, etc.) ou identificar efeitos vasculares de uma nova droga que não são aparentes ao avaliar a perfusão em repouso. A monitorização invasiva da PA permite o cálculo da condutância vascular cutânea e a consideração de alterações na hemodinâmica sistêmica, o que é particularmente importante em modelos experimentais de doença crítica. O uso dessa abordagem para identificar disfunção microvascular em um modelo de choque hemorrágico em ratos também será demonstrado.

Introdução

A disfunção microvascular está envolvida na patogênese de muitas doenças cardiovasculares, endócrinas e outras, comprometendo a perfusão e oxigenação tecidual e interrompendo os mecanismos reguladores vasomotores da hemodinâmica sistêmica (por exemplo, na hipertensão)¹. Os distúrbios da microcirculação também têm grande significado fisiopatológico nos mecanismos de disfunção orgânica em pacientes críticos com trauma, sepse e vários tipos de choque (hemorrágico, séptico, cardiogênico, etc.)².

Atualmente, vários métodos baseados em laser são usados em estudos clínicos e pré-clínicos para avaliação não invasiva da perfusão tecidual e da função microvascular: Fluxometria Doppler a laser (LDF), Imagem Doppler a laser (LDI/LDPI) e Imagem de contraste de manchas a laser (LSCI). Dentre eles, o LSCI é o mais promissor para avaliação não invasiva da perfusão cutânea na clínica. Tem vantagens claras sobre LDF e LDI/LDPI, pois o método é simples de colocar em prática e oferece visualização de toda a área de investigação com alta resolução espacial e temporal³. LSCI é uma técnica que usa luz laser para criar padrões de manchas, que são então analisados para visualizar a dinâmica do fluxo sanguíneo. São fornecidas avaliações em tempo real e de alta resolução da microcirculação, essenciais para várias áreas de pesquisa, como neurociência⁴, cirurgia abdominal⁵, dermatologia⁶ e outros estudos de pesquisa vascular ^7,8, tanto em ambientes clínicos quanto experimentais.

Uma avaliação simples dos valores de perfusão da pele em repouso geralmente não é informativa para identificar distúrbios microvasculares. Isso se deve às características funcionais intrínsecas da circulação cutânea (alta variabilidade, dependência de temperatura, estresse e outros fatores) e à perfusão tecidual "falsamente normal" durante a resposta compensatória do corpo (por exemplo, um aumento no débito cardíaco nos estágios iniciais do choque séptico). O uso adicional da carga funcional padrão permite uma melhor avaliação da microcirculação e a identificação de disfunção microvascular oculta em condições de repouso¹. Sabe-se também que a LSCI é útil na avaliação da microcirculação cutânea sob estímulos farmacológicos⁹.

A combinação da LSCI com um teste de oclusão vascular permite uma avaliação não invasiva do fenômeno da hiperemia reativa pós-oclusiva (PORH), que reflete importantes parâmetros funcionais da microcirculação, em particular a reserva de fluxo sanguíneo e a reatividade da microvasculatura¹⁰. Essa abordagem é amplamente utilizada em estudos clínicos para identificar anormalidades microcirculatórias funcionais não aparentes nas medidas de perfusão basais¹¹, mas a avaliação de PORH é rara em estudos pré-clínicos em animais^12,13. Em comparação com estudos clínicos, o uso de um teste de oclusão vascular em um experimento in vivo oferece ao pesquisador oportunidades adicionais para avaliar os mecanismos de PORH, a patogênese de doenças graves e a farmacodinâmica de drogas vasoativas. É claro que essas oportunidades devem estar dentro dos limites dos padrões bioéticos modernos para o tratamento humano dos animais.

Este protocolo apresenta um método para avaliar os parâmetros de PORH na pele de um rato anestesiado usando LSCI e medida invasiva da pressão arterial. Este último envolve cateterismo da artéria carótida do rato e permite a medição da pressão arterial média (PAM) e da frequência cardíaca. Além disso, amostras de sangue arterial podem ser coletadas para testes laboratoriais (por exemplo, gasometria arterial). Vale a pena notar que este protocolo é orientado principalmente para um experimento agudo que não envolve despertar o animal da anestesia após a conclusão dos procedimentos experimentais (por exemplo, modelar uma doença crítica). O método que propomos para avaliar a microcirculação em ratos é relativamente simples e será particularmente útil em estudos de fisiologia vascular comparativa e fisiopatologia, incluindo avaliação da disfunção endotelial, bem como em testes pré-clínicos de novas drogas vasoativas.

Protocolo

Os procedimentos descritos abaixo foram realizados como parte de um protocolo aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa do Centro Federal de Pesquisa e Clínica de Medicina Intensiva e Reabilitação.

1. Preparação do manguito pneumático para oclusão vascular

1. Use um manguito pneumático de um sistema de medição de pressão arterial não invasiva (NIBP) para ratos para criar oclusão vascular transitória na pata traseira de um rato.
2. Conecte o manguito ao manômetro aneróide e à bomba de borracha de um tonômetro mecânico convencional para medir a pressão arterial em humanos. Use três segmentos de tubo de plástico transparente de 3 mm (1 m dos quais está incluído no sistema NIBP) e um conector em T de tamanho apropriado (Figura 1).
3. Verifique a funcionalidade e a estanqueidade do sistema pneumático montado antes de usá-lo em um animal. Confirme se a pressão do manguito é mantida em 200-220 mmHg por vários minutos quando inflada.

2. Preparação de cateter arterial, estação de trabalho e instrumentos cirúrgicos

1. Trate a área de trabalho com álcool 70%. Cubra a mesa de operação com uma cortina estéril. Cateteres e instrumentos de esterilização a gás (em procedimentos de sobrevivência e experimentos crônicos).
2. Para cateterismo da artéria carótida, use um cateter PE-50 (OD 0,9 mm, ID 0,6 mm) de 12 cm de comprimento com um anel de travamento a 25 mm da extremidade. Para evitar a perfuração arterial, use um cateter com bordas lisas.
3. Conecte uma agulha romba de 22 G e uma seringa de 2 mL cheia de solução salina heparinizada (5 UI de heparina / 1 mL) na extremidade externa do cateter. Lave o cateter com solução salina heparinizada (0,1-0,2 mL) para garantir a permeabilidade e evitar a formação de coágulos.

3. Anestesia e manuseio pré-cirúrgico

NOTA: Todos os agentes anestésicos podem deprimir a respiração e a circulação. A dosagem adequada com base na espécie animal, cepa, idade e estado de saúde é fundamental para evitar overdose fatal. O pessoal deve ser treinado em anestesia animal e monitoramento de sinais vitais. Os procedimentos devem ser aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) relevante ou órgão de ética equivalente. Deve-se ter cuidado ao manusear agulhas, bisturis e outros instrumentos pontiagudos. Sempre use um recipiente para objetos cortantes para descarte imediato. Nunca recapitule agulhas. Esteja ciente do risco de ferimentos com agulhas, que podem transmitir agentes zoonóticos ou causar trauma físico.

1. Anestesiar o rato por uma injeção intraperitoneal (IP) de uma mistura de tiletamina (10 mg / kg) + zolazepam (10 mg / kg) solução a 2% em solução salina e xilazina (5 mg / kg) solução a 0,5% em solução salina. Certifique-se de que a anestesia seja adequada, verificando a ausência de reflexos (pinça do dedo do pé).
2. Raspe o pelo das áreas anterior e posterior do pescoço (incluindo a região interescapular). Trate a pele nessas áreas com um anti-séptico para a pele (álcool 70%). Coloque o animal em decúbito dorsal em uma mesa cirúrgica aquecida.
3. Monitore a condição do animal anestesiado avaliando regularmente a profundidade da anestesia (movimentos espontâneos, resposta a estímulos dolorosos), padrão respiratório (frequência, profundidade, ritmo, chiado no peito), a cor da pele e das membranas mucosas. Use injeções adicionais de tiletamina + zolazepam 10 mg / kg IP, conforme necessário.
4. Evite hipotermia significativa mantendo a temperatura retal do animal em 36,5-37,0 ^oC usando uma mesa de aquecimento e cobertores isolantes.

4. Cateterismo da artéria carótida esquerda

1. Faça uma incisão na linha média da pele de 2 cm na superfície ventral do pescoço. Usando um hemostático e uma pinça, disseque longitudinalmente os músculos e a fáscia do pescoço para expor a artéria carótida esquerda e isolar uma seção de 5-7 mm do vaso. Separe cuidadosamente o nervo vago da artéria carótida, evitando lesões nele.
2. Usando uma sutura de seda 4-0, coloque uma gravata solta na parte caudal da artéria e ligue a extremidade cranial do vaso. Use as mandíbulas de pinças microcirúrgicas colocadas sob a artéria para esticá-la suavemente para evitar sangramento após a incisão.
3. Usando uma tesoura microcirúrgica inclinada a 45° cranialmente, faça uma incisão transversal na artéria entre as duas ligaduras (a uma profundidade não superior à metade do diâmetro do vaso).
4. Depois de fazer uma pequena incisão na artéria, insira o cateter em direção ao coração até o anel de fixação com a ajuda de uma pinça. Enquanto segura o cateter no lúmen do vaso, aperte a ligadura caudal e dê nós adicionais acima do anel de fixação do cateter.
5. Verifique a permeabilidade do cateter aspirando uma pequena quantidade de sangue para uma seringa e lave o cateter novamente. Prenda o cateter com um porta-agulha liso a 2-3 cm do anel de fixação. Remova a agulha romba e a seringa do cateter.
6. Vire cuidadosamente o rato em uma posição de bruços. Faça uma incisão na linha média da pele de 0,5-1,0 cm entre as escápulas usando uma tesoura cirúrgica. Tunelamente a pinça hemostática por via subcutânea através da incisão dorsal em direção à ventral. Segure a extremidade externa do cateter e, passando-o cuidadosamente pelo túnel subcutâneo, leve-o para a região interescapular.
7. Insira uma agulha romba com uma seringa de 2 mL presa à extremidade externa do cateter.
8. Feche as feridas cirúrgicas ventrais e dorsais usando uma agulha atraumática e sutura monofilamentar 4-0.

5. Medição invasiva da pressão arterial

1. Encha o transdutor calibrado do sistema invasivo de medição da PA com solução salina heparinizada (5 UI de heparina/1 mL).
2. Coloque o animal na posição ventral. Desconecte a seringa de 2 mL da agulha romba e conecte o cateter ao transdutor (Figura 2). Remova a pinça do cateter e lave a linha de pressão arterial com 0,1-0,2 mL de solução salina heparinizada.
3. Use um sistema de aquisição de dados para medir e registrar a PA e a frequência cardíaca. A pulsação bem definida na forma de onda da pressão arterial (amplitude de 10-15 mm Hg e superior) indica a permeabilidade e o posicionamento correto do cateter.
   NOTA: Para medir com precisão a pressão arterial, o transdutor deve ser posicionado ao nível do coração do animal. Se aparecerem bolhas de ar na linha de medição da PA, remova-as para evitar embolia gasosa dos órgãos internos.
4. Estabilize o animal anestesiado por 15-20 min antes de medir a pressão arterial média (PAM) e outras variáveis fisiológicas basais.
5. Abra o aplicativo de software de aquisição de dados. No menu Arquivo , selecione Novo.
6. Certifique-se de que a entrada física correta (por exemplo, Entrada 1) esteja selecionada. Clique na seta do menu suspenso no cabeçalho do canal correspondente (por exemplo, Canal 1) e selecione Configurações do canal.
7. Na caixa de diálogo, ajuste a faixa de tensão (±100 mV) para acomodar o sinal esperado. Defina as unidades de exibição para mmHg.
8. Ajustar taxa de amostragem: Clique no botão Taxa de amostragem na barra de ferramentas. Para PA invasiva, defina a taxa de amostragem para 200 Hz (200 amostras/segundo). Se os objetivos do estudo incluírem análise da morfologia da onda de pulso, aumente a taxa de amostragem para 1 kHz.
9. Clique no botão Iniciar para começar a gravar os dados experimentais.
10. Depois que o segmento de dados desejado for capturado, clique no botão Parar . Salve o arquivo de dados via Arquivo | Salvar como... Dê a ele um nome de arquivo exclusivo.

6. Medição da perfusão cutânea usando LSCI

1. Limpe a superfície plantar da pata traseira do rato com gaze embebida em água para limpar a pele.
   NOTA: Não use álcool ou outras soluções que possam causar hiperemia da pele.
2. Coloque o manguito pneumático na pata traseira do rato ao nível da tíbia e do músculo gastrocnêmio.
   NOTA: Tenha cuidado ao inserir os dedos e o tornozelo através do lúmen do manguito para evitar danificar a membrana inflável e comprimir os tecidos moles do joelho.
3. Coloque o pé do rato em um pedaço de gaze e, adicionalmente, prenda os dedos dos pés com uma tira de fita adesiva para minimizar os artefatos de movimento (Figura 2).
4. Preparar hardware e software de aquisição de dados para registrar a perfusão cutânea usando o método LSCI.
   NOTA: No trabalho apresentado, o hardware consiste em câmera monocromática de infravermelho próximo (NIR) de alta velocidade, objetiva de câmera, polarizador linear NIR e fonte de laser com o conjunto de difusores. O software consiste em uma ferramenta de gravação de vídeo que captura quadros em uma taxa de quadros especificada (90 quadros por segundo) e tempo de exposição (11 ms). As dimensões reais da área que é o campo de visão da câmera são 16 x 16 mm.
5. Certifique-se de que a área de interesse (tarso e metatarso) esteja no ponto focal da objetiva da câmera.
6. Ajuste a fonte de laser para que a iluminação seja uniforme e não excessiva em toda a área de interesse.
7. Ajuste o polarizador linear para que a reflexão especular do objeto medido seja minimizada.
8. Certifique-se de que os parâmetros em uma ferramenta de gravação de vídeo estejam definidos corretamente e clique no botão Capturar para gravar imagens monocromáticas brutas por 30 s (gravação de linha de base, pode ser mais ou menos). Use as imagens para calcular os valores de perfusão de manchas (consulte a fórmula (2) abaixo).
   NOTA: Neste estudo, foi utilizada uma configuração experimental especialmente desenvolvida, mas qualquer dispositivo disponível comercialmente que implemente o método LSCI pode ser utilizado para realizar medições de acordo com este protocolo. Recomenda-se realizar medições LSCI em uma sala escura para minimizar a influência da iluminação externa nos resultados obtidos.

7. Teste de oclusão vascular e avaliação de PORH

1. Feche a válvula de alívio da bomba de borracha.
2. Depois de capturar a perfusão cutânea basal (em repouso), infle rapidamente o manguito pneumático no membro do animal a uma pressão maior que a pressão arterial sistólica do animal (geralmente 200-220 mmHg para ocluir de forma confiável o fluxo sanguíneo arterial e venoso sem causar lesão nos membros).
3. Continue registrando o sinal LSCI da pele por 180 s (30-300 s, dependendo dos objetivos do estudo) para confirmar a oclusão vascular e, posteriormente, determinar o "zero biológico" da perfusão do speckle.
4. Esvazie rapidamente o manguito após atingir o tempo de oclusão alvo e continue gravando o sinal LSCI da pele por mais 180 s (pode ser mais ou menos) para registrar a dinâmica do PORH.
5. Registre a forma de onda da pressão arterial invasiva simultaneamente com a avaliação da perfusão cutânea antes, durante e após a oclusão vascular. Use esses dados para calcular a PAM e a condutância vascular cutânea (veja abaixo).
6. Obtenha os valores de Perfusão Speckle usando um algoritmo escrito em um ambiente de software. O primeiro passo é transformar imagens monocromáticas brutas em imagens de contraste de manchas. Calcule o contraste médio de manchas usando a fórmula (1):
      (1)
   Onde Intensidade é a intensidade de cada pixel em um determinado momento.
   NOTA: O número de imagens sobre as quais o contraste é calculado pode influenciar muito o resultado do processamento. Neste estudo, foi utilizado um algoritmo LSCI temporal que calcula a média de mais de 90 imagens.
7. Converta os valores de contraste de manchas em valores de perfusão de manchas usando a fórmula (2):
     (2)
8. Selecione uma região retangular que inclua a área de interesse (tarso e metatarso) para calcular a média dos valores de Perfusão Speckle (dentro desta região retangular). Use a evolução do tempo (gráfico) da Perfusão Speckle obtida por tal procedimento para posterior cálculo dos parâmetros estudados.
9. Com base nos valores medidos de perfusão cutânea, calcule os principais parâmetros da PORH ( Figura 3).
10. Calcule a condutância vascular cutânea (CVC) usando a fórmula (3):
       (3)
    Onde LSCI_repouso é o valor médio de perfusão de manchas cutâneas registrado na linha de base (unidades arbitrárias = AU); PAM é a pressão arterial média (mmHg) registrada no mesmo período de tempo.
11. Calcule o pico de condutância vascular cutânea (CVC_máx) usando a fórmula (3) e substituindo os valores apropriados para pico de hiperemia (LSCI_máx) e PAM.

8. Procedimentos experimentais e medições repetidas

1. Após registrar a perfusão cutânea, PORH e outras variáveis fisiológicas de interesse no início do estudo, realizar a intervenção experimental de acordo com o protocolo de estudo aprovado (por exemplo, modelagem do processo patológico e/ou administração de um medicamento vasoativo).
2. Reavalie o PORH e outras variáveis fisiológicas no próximo momento do estudo após o desenvolvimento do processo patológico simulado ou a obtenção do efeito do medicamento administrado.

9. Fim do experimento

1. Após a conclusão do experimento agudo, eutanasiar o rato por injeção intra-arterial de lidocaína a 2% (2 mL) sob anestesia geral profunda (tiletamina + zolazepam e xilazina). Dependendo das leis e protocolos locais, use um método alternativo de eutanásia humana para roedores de laboratório que tenha sido aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).
   NOTA: Para procedimentos de sobrevivência e recuperação planejada do animal da anestesia, forneça cuidados adequados e avaliação regular da condição do animal, incluindo prevenção de hipotermia e analgesia pós-operatória adequada (por exemplo,., cetoprofeno 5-10 mg / kg IM).

Resultados

O método acima descrito para avaliação da função microvascular foi aplicado por nós em uma série de experimentos com modelagem de choque hemorrágico (perda sanguínea de 35% do volume sanguíneo calculado) em ratos Wistar machos pesando 250-300 g. No grupo de animais com hemorragia (HS, n = 13), a avaliação dos parâmetros da PORH com monitorização simultânea da PA invasiva foi realizada 30 min após o término da hemorragia. No grupo controle de animais operados por simulação (Sham, n = 10), ...

Discussão

Aqui descrevemos uma tecnologia modernizada para avaliar a microcirculação cutânea e a reatividade vascular em um experimento in vivo em roedores. Para uma utilização bem sucedida e normalizada deste método em estudos fisiológicos e farmacológicos, devem ser tidas em conta várias considerações adicionais. No protocolo acima, os ratos são anestesiados com uma combinação de tiletamina + zolazepam + xilazina, que é ditada principalmente pelos padrões locais para trabalhar com animais de lab...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agulha atraumática com nylon de sutura cirúrgica, 4C-0,5x16-4/0-N	Medtekhnika, Rússia	N/A	Azul. Comprimento 75 cm. USP 4/0 (MP1.5). Para suturar uma ferida cirúrgica
Cateter para artéria carótida de rato com agulha de seringa romba 22 G	SciCat, Rússia	N/A	PE-50, comprimento 12 cm, OD = 0,9 mm, ID = 0,6 mm. Com um anel de fixação
Transdutor de pressão descartável Deltran	Produtos Médicos de Utah, EUA	6069	Cabo de 12"
Torneira de 3 vias DiscofixC para terapia de infusão e monitoramento	B. Braun, Alemanha	16494C
Heparina	Belmedpreparaty, Bielorrússia	N/A	Heparina sódica 5000 UI/ml, ampolas 5 mL
Lidocaína	Velpharm, Rússia	N/A	Solução injetável 20 mg/ml, ampolas 2 ml
Manguito pneumático "Systole"	Neurobotics, Rússia	N/A	Parte da medição não invasiva da pressão arterial para roedores. Tipo 5-10 mm cauda (ratos)
Cloreto de sódio	Pharmasyntez, Rússia	N/A	Solução para perfusão 0,9%, 250 ml
Laboratório de Software8	ADInstruments, Austrália	N/A	Versão 8.1.13
Software MATLAB	The MathWorks Inc., EUA	N/A	Versão R2019b
Seringa estéril para uso único, 1 mL, 3 partes	Huaian City Hengchun Medical Product Co. Ltd., China	N/A	Agulha de 27 g
Seringa estéril para uso único, 2 (2,5) mL, 3 partes	Vogt Medical Vertrieb GmbH, Alemanha	1310524	Agulha de 23 G
Sutura SILK-S	Polytechmed, Rússia	N/A	Não absorvível, trançado, feito de seda natural com revestimento de silicone, preto em. USP 4/0 (MP1.5). Comprimento 100 m. Para vasos de ligação
Xyla	Interchemie, Holanda	N/A	Xilazina 20 mg/mL, 50 mL
Zoletil 100	Virbac, França	N/A	Tiletamina HCl 50 mg/mL, zolazepam HCl 50 mg/mL, 5 mL