Estabelecimento e Avaliação de um Modelo de Rato Diabético com Arteriosclerose dos Membros Inferiores

Resumo

A arteriosclerose obliterante dos membros inferiores é uma complicação comum do diabetes mellitus. Aqui, apresentamos um novo método de modelagem animal que simula a progressão da doença oclusiva aterosclerótica ao injetar etanol nos vasos sanguíneos para desestruturar a estrutura vascular, fornecendo assim uma nova plataforma para o tratamento de doenças vasculares.

Resumo

Este estudo teve como objetivo estabelecer e validar um novo modelo de ratos para arteriosclerose obliterante dos membros inferiores (ASO) em ratos diabéticos. Diferentemente da ligadura tradicional da artéria femoral, injetamos 95% de etanol (0,1 mL) na artéria ilíaca externa. Após a operação, a oclusão arterial e a isquemia do membro posterior foram avaliadas nos dias 1, 3, 7 e 14 usando ultrassom Doppler, imagem térmica e medição do peso muscular úmido. Foi realizada uma análise histológica dos vasos sanguíneos e tecidos musculares para avaliar a taxa de sucesso e a estabilidade do modelo. Etanol de alta concentração (95%) induz dano vascular nas células endoteliais, levando à oclusão da artéria femoral. Comparado ao grupo controle, o ultrassom Doppler revelou uma redução progressiva no diâmetro arterial e aumento da velocidade do fluxo no membro afetado. A imagem térmica demonstrou diminuição da temperatura dos membros, enquanto a medição do peso muscular mostrou uma redução significativa na massa muscular ipsilateral. A análise histopatológica confirmou a oclusão do lúmen arterial, diminuição da densidade microvascular e agravamento progressivo da lesão ao longo do tempo. Em conclusão, a injeção de etanol 95% na artéria ilíaca replica efetivamente as características fisiopatológicas da oclusão arterial dos membros inferiores, fornecendo um modelo inovador para o estudo da arteriosclerose obliterante em ratos diabéticos.

Introdução

A oclusão arterial dos membros inferiores diabéticos (DLEAO) é uma das principais causas de incapacidade e mortalidade em pacientes diabéticos, prejudicando gravemente a qualidade de vida e impondo um ônus socioeconômico^{substancial 1}. A patogênese da doença arterial diabética envolve interações complexas entre hiperglicemia, dislipidemia, inflamação crônica e disfunção^{vascular 2}. Modelos animais têm sido fundamentais para elucidar esses mecanismos, fornecendo insights críticos para o desenvolvimento terapêutico. Modelos animais servem como ferramentas valiosas para simular a fisiopatologia da doença arterial periférica (DAP) em pacientes diabéticos humanos. Esses modelos possibilitam estudos reprodutíveis e de alta capacidade para investigar a progressão da doença e elucidar mecanismos subjacentes. Além disso, ensaios pré-clínicos utilizando modelos animais fornecem dados essenciais para novas terapêuticas, incluindo agentes farmacológicos, terapia gênica e abordagens de medicina regenerativa (por exemplo, terapia com células-tronco⁾³. Essa pesquisa fundamental é fundamental para informar ensaios clínicos subsequentes e avançar a medicina translacional.

Atualmente, o método de laqueadura da artéria femoral (FAL) é amplamente utilizado em laboratórios para estabelecer modelos de isquemia do membro posterior em^{ratos 4}. Essa abordagem induz rapidamente manifestações isquêmicas nos membros^{inferiores 5}; no entanto, a trombose arterial resultante difere da progressão fisiopatológica observada em pacientes diabéticos com doença arterial dos membros inferiores (LEAD), que envolve lesão endotelial, acúmulo de fatores inflamatórios e proliferação de células musculares^{lisas 2,6}. Além disso, o FAL desencadeia neovascularização rápida e formação de vasos colaterais, restaurando a perfusão de baixo fluxo logo após a modelagem ^5,7. Isso contrasta com a progressão crônica do LEAD diabético. Portanto, é necessário desenvolver um modelo animal que replique com mais precisão os mecanismos fisiopatológicos da arteriosclerose humana.

Em modelos animais diabéticos, lesão mecânica da artéria íntima femoral por cateter com balão ou indução química (por exemplo, estimulação com cloreto férrico) desencadeia efetivamente mudanças patológicas, incluindo denudação endotelial, infiltração de células inflamatórias e migração/proliferação de células musculares^{lisas 8}. Essa abordagem replica melhor as características patológicas características marcantes da aterosclerose humana. Comparado ao modelo tradicional de FAL, a principal vantagem do método induzido por etanol está em sua capacidade de simular com mais precisão o complexo processo fisiopatológico do LEAD diabético. O etanol interrompe diretamente o endotélio vascular, ativando a agregação plaquetária e a trombose, imitando assim o evento inicial no LEAD⁹ diabético. Mais importante ainda, ao destruir gradualmente a microestrutura vascular, o etanol evita efetivamente a rápida compensação da circulação colateral comumente observada no modelo FAL, replicando com sucesso o típico estado crônico de hipoperfusão do LEAD¹⁰ diabético. Em contraste, o modelo de isquemia induzida por ligadura da artéria femoral apresenta limitações notáveis: roedores (por exemplo, camundongos, ratos) rapidamente compensam a isquemia aguda devido à sua circulação colateral bem desenvolvida, levando a uma gravidade isquêmica inconsistente e uma recapitulação ruim da isquemia crítica do membro humano (CLI^)11,12. Além disso, a doença arterial periférica humana (DAP) decorre principalmente da progressão crônica da aterosclerose, enquanto o modelo de laqueação das artérias femures representa um evento isquêmico agudo — mecanismos fisiopatológicos fundamentalmente^{distintos 13}. O objetivo principal deste estudo foi estabelecer e caracterizar um modelo experimental estável e de longo prazo da arteriosclerose obliterante diabética dos membros inferiores (LEAOD) que imite com precisão a progressão da doença em pacientes. A oclusão induzida por etanol é operacionalmente simples, exigindo apenas injeção minimamente invasiva, o que reduz a barreira técnica e a mortalidade animal. Seus parâmetros-chave são facilmente padronizados, garantindo alta reprodutibilidade. Além disso, o método é econômico, elimina a necessidade de equipamentos especializados e é facilmente transferível entre laboratórios. Atualmente, ainda falta modelos animais duráveis para validar intervenções terapêuticas inovadoras.

Protocolo

Este estudo foi conduzido sob um protocolo aprovado pelo Comitê de Ética Animal do Hospital Yantai Yuhuangding. Este estudo utilizou 40 ratos machos de Sprague-Dawley (peso: 250-300 g, idade: 6 semanas) alojados em um ciclo de 12 horas claro/escuro. A partir das 7 semanas de idade, eram alimentados com uma dieta rica em gorduras e sacarose¹⁴^,¹⁵ ad libitum, com acesso gratuito à água por 8 semanas. Com 4 semanas de dieta, o diabetes foi induzido por injeção de estreptozotocina (STZ)¹⁶. Após 8 semanas, o estabelecimento bem-sucedido do modelo diabético foi confirmado antes dos experimentos subsequentes. A cirurgia de oclusão arterial do membro posterior foi realizada em ratos de 14 semanas, conforme descrito abaixo.

1. Indução cirúrgica da arteriosclerose obliterante do membro posterior em ratos diabéticos

1. Prepare todos os instrumentos e materiais cirúrgicos conforme listado na Tabela de Materiais e ilustrado na Figura 1.
2. Anestesie o rato usando uma máquina anestesicária que administra isoflurano (1,5-2,5%) e oxigênio (O₂, 1-2 L/min). Mantenha a respiração espontânea durante todo o processo. Avalie a profundidade da anestesia pelo reflexo de pinçar o dedo do pé para garantir um plano cirúrgico de anestesia.
3. Coloque o rato em posição supina sobre uma plataforma de contenção. Remova pelos do abdômen para os membros inferiores usando creme depilatório e uma lâmina de barbear.
4. Prendam os membros. Desinfete a pele dos membros posteriores com álcool. Faça uma incisão de 2-3 cm na coxa medial direita usando pinças curvas e tesoura.
   NOTA: Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados por um cirurgião experiente para garantir consistência e reprodutibilidade dos modelos animais.
5. Ao microscópio, disseque os tecidos ao redor para expor a artéria/veia ilíaca externa e o nervo femoral. Isole os vasos e o nervo. Rastreie a artéria ilíaca externa até sua bifurcação em artérias femurais superficiais e profundas.
6. Pinça o segmento médio da artéria femoral e a artéria femoral profunda com clipes vasculares. Injete lentamente 0,1 mL de etanol 95% na artéria ilíaca externa distal. Após 60 s, remova os clipes; Alcançar a hemostasia por compressão. Feche a ferida camada por camada.
   NOTA: Durante a injeção, foram observados branqueamentos imediatos da artéria e tremor transitório do pé ipsilateral, confirmando a administração intravascular bem-sucedida do etanol.
7. Não imobilize o membro afetado após a operação. Administre injeção intramuscular de penicilina sódica (400.000 UI) para prevenir infecção.
   NOTA: Neste modelo unilateral de oclusão arterial do membro inferior, o membro contralateral serve como controle. O tempo de oclusão é calculado a partir de 24 horas após o procedimento.

2. Determinação da temperatura dos membros inferiores

1. Anestesie o rato e coloque-o em posição supina na plataforma cirúrgica.
2. Raspe ambos os membros posteriores e posicione-os simetricamente.
3. Meça a temperatura de ambos os membros posteriores usando um sistema de termografia infravermelha.

3. Diâmetro arterial e velocidade do fluxo sanguíneo

1. Anestesiar o rato.
2. Prepare o sistema de ultrassom e a sonda.
   1. Ligue a máquina de ultrassom pressionando o botão de energia no painel frontal.
   2. Selecione a sonda de matriz linear de alta frequência (por exemplo, 40 MHz) e conecte-a ao sistema.
   3. Aplique uma quantidade generosa de gel acústico de acoplamento na superfície da sonda.
3. Localize a artéria femoral superficial.
   1. Coloque o rato em posição deitada em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal.
   2. Raspe o pelo da região medial da coxa bilateralmente, aproximadamente 1-2 cm acima da articulação do joelho, usando uma máquina de cortar eletricidade.
   3. Coloque delicadamente a sonda perpendicular à superfície da pele sobre a área raspada.
   4. Ajuste a posição da sonda no modo B para visualizar a artéria femoral como uma estrutura tubular pulsátil e anecoica.
4. Meça o diâmetro arterial.
   1. Congele a imagem em modo B pressionando o botão de congelar na máquina ou na interface do software.
   2. Selecione a ferramenta Medição no menu na tela.
   3. Use a função do paquímetro para medir o diâmetro interno da parede próxima até a oposta da artéria.
   4. Repita a medição três vezes no mesmo local e registre o valor médio.
5. Meça a velocidade do fluxo sanguíneo.
   1. Alterne para o modo Doppler de onda pulsada clicando no ícone Doppler PW .
   2. Posicione a comporta da amostra sobre o centro do lúmen da artéria.
   3. Ajuste o ângulo Doppler para ≤ 60° usando a ferramenta de correção de ângulo.
   4. Pressione Atualizar ou Capturar para registrar a forma de onda de velocidade em pelo menos três ciclos cardíacos.
   5. Use a função automatizada de rastreamento do software para calcular a velocidade sistólica máxima (PSV) e a velocidade final diastólica (EDV).
   6. Salve os dados clicando em Salvar e exportando os resultados para uma planilha (por exemplo, CSV, Excel).

4. Pesagem muscular

1. Após anestesia profunda, eutanasie o rato por luxação cervical.
2. Dissecar os músculos gastrocnêmios de ambos os membros posteriores, preservando os tendões de Aquiles (Figura 2).
3. Imediatamente coloque os músculos em uma balança eletrônica para medir o peso molhado.
4. Use os músculos contralaterais como controles.
5. Compare medições de quatro pontos de tempo e apresente-as em um gráfico de curvas.

5. Análise histopatológica

1. Em cada um dos quatro pontos de tempo, eutanasie rapidamente um grupo de ratos.
2. Colhe imediatamente as artérias femorais superficiais bilaterais.
3. Conserte os tecidos arteriais com 4% de paraformaldeído.
4. Insuflem os tecidos na parafina e separem-nos com 5 μm de espessura.
5. Realize coloração por hematoxilina e eosina (H&E) para examinar alterações histopatológicas.

6. Análise estatística

1. Expresse todos os dados como média ± desvio padrão (DS). Considere diferenças estatisticamente significativas em um valor-p de <0,05.

Resultados

Este estudo utilizou injeção intra-arterial de etanol para estabelecer um modelo em ratos SD diabéticos (n = 40). O modelo foi caracterizado por uma taxa de sucesso de 85% (33/40), baseada na confirmação ultrassônica da redução do diâmetro arterial contralateral e da velocidade do fluxo sanguíneo dentro de 14 dias após a injeção. Foi registrada uma taxa de mortalidade relacionada ao modelo de 8% (5/40), predominantemente durante o período inicial. Embora a citotoxicidade do etanol represente risco de danos teciduais ines...

Discussão

Em resumo, estabelecemos com sucesso um modelo de ratos de oclusão arterial progressiva que imita de perto as manifestações clínicas observadas em pacientes diabéticos. Avaliações consistentes da hipoperfusão dos membros posteriores foram alcançadas por meio de medições ultrassonográficas e avaliações de peso úmido muscular por períodos superiores a duas semanas. A ligadura da artéria femoral induziu oclusão vascular superficial, permitindo a recirculação sanguínea através do sistema ven...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
GraphPad versão 8.0.1			RRID:SCR_002798
Termômetro infravermelho baseado em telefone	HIKMICRO		HM-TJP10B-3AMF
Rato Sprague-Dawley	Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd.		250 g
Máquina de ultrassom	Vevo 2100