Artigo de método

Aplicação da eletroforese em gel de poliacrilamida na análise de subfrações de lipoproteínas relevantes para a doença cardiovascular aterosclerótica

DOI:

10.3791/68996

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24 de outubro de 2025

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1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo tem como objetivo elaborar um método de análise de subfração de lipoproteína baseado em eletroforese em gel de poliacrilamida, que fornece uma importante base diagnóstica para a avaliação de risco de doença cardiovascular. Pode dividir o LDL em sete subfrações. LDL1 e LDL2 são caracterizados como partículas grandes, enquanto LDL3 a LDL7 são caracterizados como partículas pequenas.

Resumo

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O colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) é um fator chave no desenvolvimento da doença cardiovascular aterosclerótica (ASCVD). Níveis elevados de LDL-C estão intimamente ligados à formação de placas ateroscleróticas e ao risco de eventos cardiovasculares. No entanto, a heterogeneidade do LDL influencia significativamente sua capacidade de promover a aterosclerose. Pesquisas indicam que as partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL) podem ser categorizadas em LDL pequena e densa (sdLDL) e LDL grande e flutuante (lbLDL). Entre estes, o sdLDL tem maior probabilidade de penetrar no endotélio vascular e tem atividade de modificação oxidativa mais forte, que está particularmente associada à DCV ASCV. Em pacientes com síndrome metabólica, diabetes e hipertrigliceridemia, os níveis de LDL-C podem estar normais, mas a proporção de sdLDL é elevada, levando a uma subestimação do risco cardiovascular. Portanto, detectar com precisão as subfrações de LDL é crucial para estratificar o risco de DCV ASCVD e otimizar as estratégias de intervenção.

Os métodos tradicionais de detecção de LDL-C, como a fórmula de Friedewald e a medição direta, refletem apenas os níveis de colesterol total e não podem diferenciar entre subfrações. Os métodos para detectar subfrações de LDL-C incluem técnicas de ultracentrifugação (UC), cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e ressonância magnética nuclear (RMN). No entanto, esses métodos têm altos requisitos técnicos, operações complexas ou equipamentos caros, tornando-os impraticáveis para uso clínico generalizado.

A tecnologia de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) separa as partículas de lipoproteína através do efeito de peneira molecular e diferenças de carga. Essa técnica usa sistemas de gel gradiente não desnaturantes, combinados com manchas específicas como o preto do Sudão, oferecendo alta resolução, forte reprodutibilidade e facilidade de operação. A tipagem de lipoproteínas usando a tecnologia PAGE pode fornecer uma avaliação mais abrangente e precisa dos níveis de lipoproteínas dos pacientes, auxiliando nas decisões de tratamento clínico. Este artigo apresentou cinco resultados representativos. O tamanho médio das partículas de LDL da amostra A, B, C, D, E é de 275,3 Å, 266,6 Å, 258,2 Å, 257,4 Å e 252,9 Å, indicando um risco baixo, marginal, leve, moderado e grave de doença cardiovascular devido à dislipidemia, respectivamente.

Introdução

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De acordo com o relatório da Organização Mundial da Saúde de 2021, as doenças cardiovasculares (DCV) continuam sendo a principal causa de morte entre as doenças humanas. O relatório indica que 17,9 milhões de pessoas em todo o mundo morreram de DCV em 2019, representando quase um terço das mortes globais1. A DCV, um tipo de DCV, é a principal causa de morte entre residentes urbanos e rurais na China, representando mais de 40% de todas as mortes2. A aterosclerose é uma doença vascular inflamatória crônica causada por fatores de risco tradicionais e não tradicionais3. Caracteriza-se por deposição de lipídios na parede arterial4, proliferação e calcificação de tecido fibroso, levando ao espessamento da parede do vaso, redução da elasticidade e estreitamento da luz. A dislipidemia é o fator de risco mais significativo para DCVA, sendo o LDL-C um fator de risco patogênico para DCVA, desempenhando um papel crucial no desenvolvimento de DCV5. Numerosos estudos epidemiológicos, estudos de randomização mendeliana e ensaios clínicos randomizados mostraram consistentemente que os níveis plasmáticos de LDL-C estão positivamente correlacionados com o risco de ASCVD. A redução dos níveis de LDL-C pode diminuir o risco de DCV6.

O LDL é a principal lipoproteína responsável pelo transporte do colesterol endógeno no organismo7. A LDL plasmática é heterogênea, consistindo de uma variedade de partículas com diferentes tamanhos, densidades e composições químicas8. As partículas de LbLDL têm uma densidade menor e um tamanho maior, enquanto as partículas de sdLDL têm maior densidade e tamanho menor. A heterogeneidade do LDL está subjacente aos seus variados efeitos biológicos9. As partículas de LbLDL são maiores em diâmetro (≥ 25,5 nm), mais baixas em densidade (perto de 1,02 g/mL) e soltas em morfologia, consistindo em LDL1 e LDL2. As partículas de LbLDL contêm uma quantidade maior de ésteres de colesterol. Eles são menos propensos a serem oxidados ou penetrar no endotélio vascular, tornando-os relativamente mais seguros. Em contraste, as partículas de sdLDL têm um diâmetro menor (< 25,5 nm)10, maior densidade (próximo a 1,06 g/mL) e estrutura densa, consistindo de LDL3 a LDL7. As partículas de SdLDL contêm menor quantidade de éster de colesterol, mas níveis mais altos de triglicerídeos e apolipoproteína B (ApoB) em comparação com lbLDL. Suas propriedades físicas os tornam mais propensos a penetrar na barreira endotelial arterial. Sob o subendotélio, as partículas de sdLDL são oxidadas por espécies reativas de oxigênio (ROS) para formar LDL oxidada (ox-LDL)11. A LDL-ox inibe a atividade da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), reduz a produção de NO e induz as células endoteliais a expressarem VCAM-1/MCP-1, promovendo a adesão e migração de monócitos12. As células mononucleares endoteliais migratórias se diferenciam em macrófagos, que absorvem ox-LDL sem limite através dos receptores eliminadores. O acúmulo de éster de colesterol intracelular se transforma em células espumosas, que são os principais componentes das estrias lipídicas ateroscleróticas. As células espumosas secretam fatores inflamatórios como IL-1β e TNF-α, que expandem ainda mais o estresse oxidativo e o dano endotelial, formando um ciclo de feedback positivo13. Pode ativar a inflamação das células endoteliais, promove a formação de células espumosas e acelera a progressão da placa. Dois grandes estudos de coorte mostraram que o sdLDL-C tem maior valor de referência clínica do que o LDL-C na predição e avaliação dos riscos potenciais de DCV aterosclerótica14-15. Mas o método tradicional de detecção de LDL-C não pode testar subfrações de lipoproteínas devido à limitação do método.

As partículas de LDL (LDL-P) refletem o número de partículas de LDL por unidade de volume de sangue e servem como transportadoras para moléculas de LDL, cada uma contendo uma molécula de ApoB e várias moléculas de colesterol. O LDL-C representa a massa total de colesterol transportada por essas partículas. Os níveis de LDL-C são influenciados pelo número de partículas de LDL e pela densidade do colesterol, o que pode não refletir totalmente o risco real16. Por exemplo, pacientes com síndrome metabólica, diabetes ou hipertrigliceridemia podem ter níveis normais de LDL-C, mas LDL-P anormalmente elevados (devido a partículas menores e menor teor de colesterol). Mesmo que os níveis de LDL-C atinjam a meta, o LDL-P alto ainda pode aumentar o risco cardiovascular residual. Estudos têm demonstrado que o LDL-P é mais preditivo do que qualquer outro parâmetro relacionado ao LDL17. A análise das subfrações lipoproteicas é fundamental para entender a patogênese da ASCVD, avaliar o risco residual e orientar o tratamento de precisão. Nos últimos anos, as diretrizes nacionais também recomendaram as subfrações de LDL como indicadores para avaliação de risco de DCV ASCV ou monitoramento do tratamento18.

A DCV é a principal causa de morte em todo o mundo. Suas estratégias de prevenção e controle dependem fortemente do manejo lipídico. Atualmente, o rastreamento de indivíduos com dislipidemia na prática clínica depende principalmente de quatro testes lipídicos tradicionais, incluindo triglicerídeos (TG), colesterol total (CT), colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-C) e LDL-C. Além disso, outros marcadores lipídicos, como lipoproteína (a), apolipoproteína A1 (ApoA1) e ApoB, são usados principalmente para populações de alto risco de ASCVD19, como pacientes diabéticos, hipertensos e fumantes ou aqueles cujos níveis de LDL-C foram controlados, mas ainda representam um alto risco.

À medida que a pesquisa progrediu, as limitações dos testes lipídicos tradicionais tornaram-se cada vez mais aparentes, particularmente na eficácia do alerta precoce e na explicação do risco residual. Um número considerável de pacientes com DCV ASCVD é inicialmente diagnosticado com níveis lipídicos normais, tornando o LDL-C ineficaz para alerta primário. Dados epidemiológicos mostram que cerca de 20% dos pacientes com síndrome coronariana aguda apresentam níveis de LDL-C dentro da faixa normal (<3,4 mmol/L) na admissão, sugerindo que o teste lipídico tradicional pode não detectar indivíduos de alto risco. Além disso, mesmo depois de atingir as metas de LDL-C, os pacientes com DCV ainda podem enfrentar um alto risco cardiovascular residual. Nesses pacientes, a maioria dos eventos residuais da artéria coronária não pode ser explicada por uma redução nos níveis de LDL-C. Portanto, o teste simples de LDL-C pode não atender totalmente às necessidades clínicas para diagnóstico e tratamento de DCV ASCV, porque os testes lipídicos de rotina não podem diferenciar entre lbLDL-C e sdLDL-C.

Vários estudos confirmaram uma correlação clara entre subfrações de lipoproteínas e ASCVD. Resultados anormais do teste de subfração de lipoproteína podem servir como um alerta para a prevenção primária de ASCVD em indivíduos com níveis lipídicos normais, ajudando a identificar grupos ocultos de alto risco. Para a prevenção secundária de DCV aterosclerótica, onde os níveis de LDL-C já estão dentro das faixas-alvo, o teste de subfração de lipoproteína pode ajudar a avaliar o risco residual e orientar o tratamento adicional20. Portanto, espera-se que a detecção de novas subfrações de LDL forneça novos alvos para a prevenção e tratamento da dislipidemia e ASCVD em comparação com os testes lipídicos tradicionais.

O sistema de detecção e análise em nosso laboratório usa principalmente o PAGE para separar as subfrações das lipoproteínas com base em seu tamanho e carga. As partículas de lipoproteína são separadas principalmente por tamanho devido à peneiração molecular na matriz de poliacrilamida por PAGE. Moléculas pequenas migram rapidamente, enquanto moléculas grandes são prejudicadas por obstrução estérica e migram lentamente. E quanto mais carga uma molécula carrega, mais rápido ela migra. Este método pode dividir rapidamente as lipoproteínas em doze subfrações. O LDL é dividido em sete subfrações, rotuladas como LDL1 a LDL7. Todos eles têm tamanhos, densidades, propriedades físico-químicas, comportamentos metabólicos e potencial aterosclerótico distintos. LDL1 e LDL2 são classificados como lbLDL, enquanto LDL3 a LDL7 são categorizados como sdLDL. As técnicas de detecção de subfração de lipoproteína incluem UC, HPLC e RMN. No entanto, devido à alta exigência de equipamentos, operação complexa e consumo de tempo, sua aplicação clínica é relativamente limitada21. O método PAGE separa com eficiência várias subfrações do LDL, tornando-o mais fácil de usar em comparação com outras técnicas. O equipamento utilizado é econômico e portátil, tornando-o mais adequado para uso generalizado em laboratórios de rotina clínica. Este estudo tem como objetivo validar o PAGE como um método rápido e econômico para análise de subfração de LDL em amostras de soro para apoiar a tomada de decisão clínica.

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Protocolo

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Todas as amostras neste estudo são avaliadas e aprovadas pelo Comitê de Revisão de Ética do Hospital Popular da Província de Guangdong (Número de aprovação: KY2025-435-01). Todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes do experimento.

1. Preparação do kit

  1. Preparação do tampão de gel
    1. Preparação de acrilamida a 30% (ACR): Pesar 30 g de acrilamida, adicionar 80 mL de água deionizada, mexer para dissolver e ajustar para 100 mL. Conservar a 4 °C no escuro até à utilização.
    2. Preparação de 1% de bisacrilamida (BIS): Pesar 1 g de bisacrilamida, adicionar 80 mL de água deionizada, mexer para dissolver e ajustar para 100 mL. Conservar a 4 °C no escuro até à utilização.
    3. Preparação de sacarose a 25%: Pesar 25 g de sacarose, adicionar 70 ml de água desionizada, mexer para dissolver e ajustar para 100 ml para armazenamento a 4 °C.
    4. Preparação de persulfato de amônio a 10% (APS): Dissolva 0,1 g de persulfato de amônio em 1 mL de água deionizada e use imediatamente.
    5. Preparação de Tris 1M (pH = 6,8): Pesar 121,14 g de trishidroximetilaminometano, adicionar 800 mL de água deionizada, mexer para dissolver e ajustar o valor do pH para 6,8, depois perfazer até 1000 mL.
    6. Preparação de Tris 1M (pH = 8,6): Pesar 121,14 g de trishidroximetilaminometano, adicionar 800 mL de água deionizada, mexer para dissolver e ajustar o valor do pH para 8,6 e, em seguida, perfazer até 1000 mL.
      NOTA: Ao manusear acrilamida, use luvas de borracha butílica, óculos de segurança, roupas de proteção e opere em um exaustor. Em caso de contato com a pele, lave imediatamente com água e sabão e procure atendimento médico. Em caso de inalação, vá para o ar fresco.
  2. Preparação do gel de separação
    1. Pegue um tubo de vidro limpo e sele a camada inferior com uma película de vedação.
    2. Adicione 8,29 mL de ACR a 30%, 17,76 mL de BIS a 1%, 10 mL de sacarose a 25%, 1 mL de APS a 10%, 10 mL de Tris 1M (pH = 8,6), 0,1 mL de tetrametiletilenodiamina (TEMED) e 32,85 mL de água deionizada em um béquer limpo em sequência. Misture bem para obter 80 mL de licor-mãe (com concentração de poliacrilamida de 3,3%) e adicione ao tubo de vidro a 1,2 mL por raiz. Polimerize em temperatura ambiente por 60 min e sele o líquido com água purificada para garantir uma superfície plana do líquido.
  3. Preparação de cola concentrada
    1. Adicione 4,07 mL de ACR a 30%, 3,05 mL de BIS a 1%, 5 mL de sacarose a 25%, 0,5 mL de APS a 10%, 5 mL de Tris 1M (pH = 6,8), 0,05 mL de TEMED e 32,33 mL de água deionizada em um béquer limpo em sequência, misture bem para obter 50 mL de licor-mãe (com concentração de poliacrilamida de 3,05%), adicione ao tubo de vidro a 0,2 mL por raiz. Polimerize em temperatura ambiente por 60 min e sele o líquido com água purificada para garantir uma superfície plana do líquido.
  4. Preparação da solução de conservação
    1. Pese 6,4 g de Tris, 75 g de sacarose, 2,5 mL de glicerina e 0,3 mL de PC-300 (conservante antibacteriano) e adicione 800 mL de água deionizada, mexa para dissolver, ajuste o valor de PH para 6,8 e, finalmente, dilua para 1000 mL. A concentração de Tris-HCl é de cerca de 52 mM.
  5. Preparação da solução de coloração preta do Sudão
    1. Pese 0,03 g de preto de Sudão e dissolva-o em uma mistura de 2 mL de etilenoglicol, 6 mL de etanol anidro e 2 mL de dimetilsulfóxido. Após a filtração, divida-o em 1 ml por frasco para injetáveis.
      NOTA: Ao manusear o preto do Sudão e o dimetilsulfóxido, use luvas de nitrilo e óculos de proteção para evitar o contato direto. As operações devem ser conduzidas em um ambiente ventilado. Enxágue imediatamente a pele e os olhos com água após a exposição e, em seguida, procure atendimento médico, se necessário.
  6. Embalagem interna
    1. Embalagem completa de acordo com os requisitos de composição do kit.

2. Composição do kit

  1. Certifique-se de que o produto contenha colunas pré-fabricadas, solução conservante e solução de coloração preta do Sudão. As colunas pré-fabricadas devem conter acrilamida, bisacrilamida, sacarose, persulfato de amônio, Tris e tetrametiletilenodiamina. O comprimento da coluna pré-fabricada é de 75 ± 0,5 mm, o diâmetro interno é de 5,5 ± 0,02 mm e o diâmetro externo é de 7,0 ± 0,02 mm. A solução conservante deve conter Tris, sacarose, glicerina e conservantes. A solução de coloração preta do Sudão deve conter preto de Sudão, etilenoglicol, etanol anidro e dimetilsulfóxido. Certifique-se de que as especificações da embalagem sejam diferentes de acordo com a quantidade de colunas pré-fabricadas. Uma porção de reagente deve ter uma coluna pré-fabricada. Não combine kits de reagentes de lotes diferentes, pois isso pode afetar os resultados experimentais.

3. Preparação da amostra

  1. Preparação do paciente: Certifique-se de que o paciente esteja com o estômago vazio enquanto coleta amostras de sangue.
  2. Use tubos de amostragem de gel de separação de soro e realize a coleta de amostra de acordo com o Procedimento Operacional Padrão. O sangue deve ser separado o mais rápido possível após a coleta de sangue para evitar hemólise.
  3. Testar as amostras de soro após a separação o mais rapidamente possível à temperatura ambiente. Se o teste imediato não for possível, armazene as amostras a 2-8 °C por até 7 dias ou a -20 °C por até 30 dias.
  4. Restaure as amostras à temperatura ambiente e misture completamente antes de usar, especialmente para as amostras congeladas e descongeladas. O congelamento e descongelamento repetido não é permitido, pois pode comprometer a integridade da amostra. Tanto as amostras de lipemia quanto as de hemólise podem afetar os resultados dos testes. Se for uma amostra de lipemia ou hemólise leve, recomenda-se realizar centrifugação de alta velocidade a 14.462 x g em temperatura ambiente por 15 min. Para amostras de lipemia, use uma pipeta para aspirar toda a camada transparente do fundo. Para amostras de hemólise, colete o sobrenadante. Em seguida, transfira-o para um novo tubo de centrífuga e core. No entanto, se a lipemia ou hemólise for muito grave, recomenda-se coletar sangue novamente.

4. Etapas da operação

  1. Preparação
    1. Retire as colunas pré-fabricadas e as amostras a serem testadas. Use uma pipeta para aspirar o líquido de preservação residual da porta de amostra de colunas pré-fabricadas. Equilibre colunas e amostras pré-fabricadas à temperatura ambiente e dissolva 14,3 g de pó tampão eletroforético com 800 mL de água deionizada.
  2. Tingir
    1. Pegue os tubos de centrífuga limpos e numere-os. O número de tubos é consistente com a ordem dos tubos de coleta de sangue. Adicione os tubos de centrífuga com uma proporção de 50 μL de amostra para 10 μL de solução de coloração preta do Sudão, misture bem e deixe repousar por 30 minutos em temperatura ambiente para colorir.
      NOTA: O princípio de coloração do preto do Sudão é baseado em sua propriedade lipofílica. Pode induzir reações cromogênicas específicas com substâncias lipídicas, como gorduras neutras, fosfolipídios e esteróides dentro das células, resultando em partículas preto-acastanhadas ou pretas escuras. Neste sistema, otimizamos o tempo de coloração e a dosagem usando um projeto experimental de fator único com o seguinte protocolo. Três amostras de soro de LDL-C (altas, médias e baixas concentrações) são selecionadas, com volumes de coloração correspondentes de 5 μl, 10 μl, 15 μl e 20 μl, respectivamente. As durações de coloração são definidas em 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 45 min e 60 min. Experimentos eletroforéticos são conduzidos, seguidos pela análise em escala de cinza das bandas eletroforéticas para verificar a eficácia da coloração. As condições ideais são determinadas como volume de coloração de 10 μl com duração de coloração de 30 min ± 5 min. Menor volume e duração da coloração resultam em colesterol de lipoproteína levemente manchado. Embora as condições ideais tenham alcançado o equilíbrio, não são necessários maior volume e duração da coloração.
  3. Separação ionofórica
    1. Insira colunas pré-balanceadas no soquete de borracha do tanque de eletroforese. A porta de amostra da coluna de gel está a cerca de 2 cm de distância da rolha de borracha. Certifique-se de que esteja bem fechado e que não ocorra vazamento. Quando o número de colunas de gel de amostra não estiver cheio, preencha o espaço vazio com um tampão de borracha sem orifícios.
    2. Em seguida, despeje o tampão de eletroforese nos tanques superior e inferior. Remova as bolhas na boca das colunas pré-fabricadas. Adicione 25 μL de amostras coradas à porta de amostra de colunas pré-fabricadas.
    3. Cubra a tampa, conecte o interruptor de alimentação e defina os parâmetros de voltage (U = 100 V), corrente (I = 3 mA/tubo), potência (P = 120 W), tempo (T = 70 min) para separação por eletroforese.
      NOTA: Voltage, potência e tempo são parâmetros fixos. A corrente precisa ser ajustada de acordo com o número de amostras de teste (por exemplo, 10 tubos de amostra, I = 3 mA x 10 tubos = 30 mA).
    4. Após a conclusão da eletroforese, desligue a energia, remova a tampa e despeje o tampão de eletroforese na parte superior do dispositivo de eletroforese. Retire as colunas de gel por sua vez e coloque-as na estrutura de fixação, despeje o excesso de tampão de eletroforese na superfície superior e analise no sistema de análise de varredura.
  4. Análise de digitalização
    NOTA: O tipo de analisador é DY-03 e o software de varredura é KBL 3.3.9 GD.
    1. Ligue o botão liga/desliga do analisador de varredura, clique duas vezes no software do sistema de desktop e clique em Coleção para entrar na interface do software. Clique em Exportar bandeja de amostra na interface do software, coloque colunas de gel no rack de amostra com a extremidade de amostragem voltada para o interior do dispositivo. Certifique-se de que as colunas de gel sejam colocadas nas posições numeradas correspondentes. As posições 25 e 26 são designadas apenas para testes de controle de qualidade.
    2. Clique em Importar bandeja de amostra na interface do software para importar a bandeja de amostra para o dispositivo. Clique em Digitalizar para obter imagens de digitalização de amostra. O dispositivo possui um sistema de foco automático integrado. Ele ajusta automaticamente o foco entre o módulo de digitalização e o tubo de gel para garantir imagens nítidas. O software identifica automaticamente a posição inicial (VLDL) e a posição de terminação (HDL) do eletroforograma. Quando picos óbvios são detectados nessas posições, o software trava na área de análise designada para análise espectral.
    3. Depois de inserir as informações dos pacientes e escanear o código de barras, clique em Análise e processamento na interface do software, o sistema analisará e gerará automaticamente os relatórios de teste. Clique em Carregar LIS para transferir relatórios de teste para o sistema LIS.
    4. Retire as colunas pré-fabricadas após a digitalização e análise e trate-as de acordo com as especificações de resíduos médicos.

5. Controle de qualidade

  1. Realize um teste de controle de qualidade de dois níveis antes do teste diário de amostras. As etapas de operação do teste de controle de qualidade são as mesmas de um teste de amostra. A referência do tipo A é o diâmetro médio da partícula maior que 268 Å. A referência do tipo B é o diâmetro médio da partícula menor que 265 Å.
    NOTA: Análise de resultados: TIPO A, o tamanho médio das partículas de LDL é > 268 Å, LDL1 e LDL2 são mais responsáveis, indicando um baixo risco de DCV. TIPO INTERMEDIÁRIO (TIPO INT), o tamanho médio das partículas de LDL é de 265 a 268 Å, indicando que a proporção de LDL3 para LDL7 está acima do valor crítico. TIPO B, o tamanho médio das partículas de LDL é < 265 Å, LDL3 a LDL7 são responsáveis por mais, indicando um alto risco de DCV.

6. Melhorias técnicas

  1. Para garantir resultados diagnósticos precisos, as seguintes melhorias técnicas devem ser implementadas.
    1. Pré-exame: Certifique-se de que os pacientes estejam em jejum total antes da coleta de sangue. Use soro ou plasma anticoagulante EDTA em vez de plasma anticoagulante heparina. Certifique-se de que a pipeta seja precisa em sua absorção. Evite amostras quilosas ou hemolíticas graves.
    2. Durante o exame: Defina os parâmetros de eletroforese de tensão (U = 100 V), corrente (I = 3 mA/tubo), potência (P = 120 W), tempo (T = 70 min) de acordo com os protocolos padrão. Use luvas estéreis para evitar a contaminação dos tubos de vidro que podem afetar a capacidade de tirar fotos e digitalizar.
    3. Após o exame: Ao emitir relatórios, revise os cromatogramas anormais quanto a possíveis interferências e realize uma reanálise para evitar fornecer conclusões diagnósticas incorretas.
      1. O cromatograma normal: Na posição inicial do VLDL e na posição final do HDL, ambos têm um pico distinto (consulte a seção Resultados representativos).
      2. O cromatograma de anomalia: Na posição inicial do VLDL ou na posição de terminação do HDL não tem nenhum ou mais de um pico.

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Resultados

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Este estudo tem como objetivo inventar um método usando PAGE para detectar subfrações de lipoproteínas no soro dos participantes. O objetivo é determinar se as subfrações do LDL-C são principalmente partículas grandes (LDL1 e LDL2) ou partículas pequenas (LDL3 a LDL7). Após a coloração com preto de Sudão, as amostras são separadas pelo dispositivo de eletroforese em um gel de poliacrilamida. As lipoproteínas são então separadas em bandas distintas dentro dos tubos de gel e a análise de subfração é realizada usando um sis...

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Discussão

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Embora o papel do sdLDL como fator de risco cardiovascular no desenvolvimento da aterosclerose tenha sido confirmado por pesquisas, atualmente não existe um método estabelecido para identificar subfrações de LDL. Nas últimas décadas, um progresso significativo foi feito no desenvolvimento de métodos de detecção de subfrações de LDL. A UC é considerada o padrão ouro. Ele pode separar subfrações de LDL com base em suas diferenças de densidade, distinguindo entre sdLDL e lbLDL com alta reso...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

Agradecimentos

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Este estudo é apoiado por doações do Projeto do Fundo de Pesquisa em Ciência e Tecnologia Médica da Província de Guangdong (A2024108).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pó tampão eletroforéticoEmpresa de tecnologia Guangxi Kangbolai25030401Para preparar soluções tampão e fornecer condições de eletroforese
Produtos de controle de qualidade de alto valorEmpresa de tecnologia Guangxi Kangbolai25030301Para monitorar a exatidão e a precisão
Solução de separação da densidade da amostra de lipoproteínas (eletroforese em gel gradiente)Empresa de tecnologia Guangxi KangbolaiLSS60-SB1-A1  25030301Para separar componentes do subtipo lipoproteína de amostras de soro
Produtos de controle de qualidade de baixo valorEmpresa de tecnologia Guangxi Kangbolai25030301Para monitorar a exatidão e a precisão
Solução de coloração preta do SudãoEmpresa de tecnologia Guangxi KangbolaiLSS60-SB1-A1  25030301Para coloração de amostras

Referências

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