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Artigo de método

Integrando Farmacologia de Rede para Investigar o Efeito Protetor do Cinamaldeído contra a Neurotoxicidade Induzida por Oxaliplatina

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DOI:

10.3791/69013

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28 de novembro de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Medical Oncology, Cancer Hospital of China Medical University, Cancer Hospital of Dalian University of Technology, Liaoning Cancer Hospital & Institute, 2China Medical University, 3Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

Este estudo investiga os efeitos protetores do cinnamaldeído (AC) contra danos induzidos por oxaliplatina (OXA) em células ganglionares da raiz dorsal (DRG) de rato. O mecanismo subjacente envolve a supressão da via de sinalização JAK2/STAT3 e a ativação da via SLC7A11-GSH-GPX4, conforme revelado por meio da farmacologia em rede e validação experimental.

Resumo

Este estudo investiga os efeitos protetores do cinnamaldeído (AC) contra danos induzidos por oxaliplatina (OXA) em células ganglionares da raiz dorsal (DRG) de rato. As atividades farmacológicas da AC foram analisadas, e seus potenciais alvos, juntamente com os de seus metabólitos, foram identificados usando o Banco de Dados e Análise dos Sistemas de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP), a Plataforma de Pesquisa Computacional em Rede baseada em Farmacologia Integrativa da Medicina Tradicional Chinesa (TCMIP) e as plataformas PharmMapper. O ensaio CCK-8 é usado para determinar as concentrações ideais dos medicamentos, enquanto ensaios de malondialdeído (MDA) são aplicados para avaliar o nível de peroxidação lipídica. Os níveis intracelulares de Fe2+ e espécies reativas de oxigênio (ROS) foram quantificados usando sondas fluorescentes. O impacto da CA nos níveis de expressão proteica, incluindo p-STAT3, XCT e GPX4, em células DRG tratadas com OXA, foi examinado por meio de imunobloting. A análise farmacológica em redes identificou 14 alvos sobrepostos entre "CA-neuropática dor (NP)-ferroptose". Resultados experimentais demonstraram que um tratamento de 24 horas com 4,0 μmol/L CA produziu efeitos ideais, reduzindo significativamente os níveis de MDA, Fe2+ e ROS em células DRG (P < 0,05). Além disso, o tratamento com CA reduziu a expressão de JAK2, STAT3, p-STAT3, TFRC, ErbB-1 e fator nuclear kappa B (NF-κB) (P < 0,05), enquanto aumentava a expressão de XCT, GPX4 e FTH1 (P < 0,05). Esses achados sugerem que a CA mitiga danos induzidos por OXA nas células DRG ao inibir a via de sinalização JAK2/STAT3 e ativar o eixo SLC7A11-GSH-GPX4.

Introdução

Nos últimos anos, a ferroptose, como modo de morte celular não apoptótica, tem sido comprovadamente envolvida nos danos teciduais induzidos por diversos medicamentos quimioterapêuticos. O mecanismo central da ferroptose é o acúmulo de produtos de peroxidação lipídica dependente deferro 1. Pesquisas sobre os mecanismos da neurotoxicidade por cisplatina revelam que esse medicamento induz ferroptose neuronal por múltiplas vias, sendo esse processo diretamente ligado ao desenvolvimento da neurotoxicidade. Especificamente, a cisplatina inibe a atividade da peroxidase de glutationa 4 (GPX4). Como uma "molécula de freio" crítica na ferroptose, a inativação do GPX4 impede a eliminação dos hidroperóxidos lipídicos (L-OOH), causando assim danos oxidativos às membranas celularesneuronais 2. Enquanto isso, a oxaliplatina pode promover a liberação de ferroptose nas células nervosas e exacerbar a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) por meio da reação de Fenton, amplificando ainda mais a cascata deferroptose 3. Essas evidências sugerem que a regulação direcionada da neurodegeneração pode ser uma estratégia potencial para aliviar a neurotoxicidade da oxaliplatina.

Oxaliplatina (OXA), um agente quimioterapêutico de terceira geração à base de platina amplamente utilizado para câncer colorretal, oferece eficácia antitumoral robusta, mas está frequentemente associada a neurotoxicidade significativa. A administração crônica frequentemente leva à dor neuropática induzida por OXA (OINP), com taxa de incidência que chega a 60%4, caracterizada por alodinia mecânica, hiperalgesia térmica e hipersensibilidade aofrio5. Apesar da prevalência, as estratégias atuais de tratamento para a PO continuam inadequadas, diminuindo substancialmente a qualidade de vida do paciente. Consequentemente, elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à OINP e identificar novos alvos terapêuticos continuam sendo áreas críticas de pesquisaem andamento 6.

O cinnamaldeído (CA), o principal constituinte ativo do óleo essencial de canela, é um líquido amarelo eviscoso 7,8 com diversas atividades biológicas, incluindoinseticida 9,antimicrobiano 10, antifúngico11,antioxidante 12, antidiabético13, anticâncer14, anti-inflamatório e efeitos protetoresneurovasculares15,16. Evidências emergentes sugerem que a CA pode inibir a ativação da via de sinalizaçãoJAK/STAT 17. A fórmula química da CA é C9H8O, e sua estrutura química é mostrada na Figura 1. Como monômero natural da medicina tradicional chinesa, a AC apresenta uma ampla gama de atividades farmacológicas. Em termos de neuroproteção, vários estudos confirmaram que a AC pode entrar no sistema nervoso central através da barreira hematoencefálica, promover a expressão de enzimas antioxidantes (como HO-1 e NQO1) ativando a via de sinalização Nrf2/AR, reduzir o acúmulo de ROS nas células nervosas e, assim, aliviar o dano neurooxidativo no AVC isquêmico. Doença de Alzheimer e outrasdoenças 18,19. Ao mesmo tempo, a CA pode inibir a hiperativação da microglia, reduzir a liberação de fatores inflamatórios (como TNF-α, IL-1β) e diminuir a respostaneuroinflamatória 20. No entanto, não foi relatado se a AC pode aliviar a neurotoxicidade induzida pela oxaliplatina regulando a via da ferroptose.

A via de sinalização JAK2/STAT3 é um importante mecanismo de transdução intracelular de sinais que transmite sinais recebidos na membrana celular para o núcleo celular, e está intimamente relacionada a processos biológicos chave como proliferação celular, diferenciação, apoptose, estresse oxidativo e respostasinflamatórias 21. Como via intimamente relacionada às respostas inflamatórias, a via de sinalização JAK3/STAT3 pode desencadear respostas inflamatórias em um estado ativado, levando a danos inflamatórios teciduais. Estudos indicam que inibir a via de sinalização JAK3/STAT3 pode reduzir a resposta inflamatória e o dano oxidativo em ratos com demência vascular, melhorando assim a função cognitiva dosratos. Além disso, inibir a via de sinalização JAK3/STAT3 também pode aliviar a resposta inflamatória em ratos epilépticos, reduzir a taxa de apoptose neuronal e mitigar a lesãocerebral 23. Embora o ácido cafeico (AC) tenha um certo efeito protetor sobre o sistema nervoso, ainda não se conclui claramente se seu efeito de melhoria está relacionado à regulação da via de sinalização JAK3/STAT3.

Este estudo tem como objetivo validar se a inibição in vitro da sinalização JAK2/STAT3 e a ativação do eixo LC7A11-GSH-GPX4 podem mitigar danos induzidos por OXA em células DRG de ratos. Além disso, explora os potenciais efeitos antiferroptóticos da AC e examina o papel dos principais alvos identificados por meio da farmacologia em redes na modulação da inflamação nas células DRG.

As abordagens terapêuticas atuais para neurotoxicidade induzida por oxaliplatina focam principalmente na quelação de íons de platina livres para mitigar danos nervosos, como o uso de complexos de cálcio e magnésio, com o principal objetivo de aliviar neuropatias periféricas agudas (por exemplo, dormência e formigamento nas mãos e pés)24. No entanto, os mecanismos exatos permanecem incertos. Esses tratamentos não têm capacidade de reverter condições crônicas como degeneração axonal e deterioração das fibras nervosas causadas pela oxaliplatina, e demonstram eficácia limitada na prevenção da neurotoxicidade cumulativa. Neste experimento, o efeito neuroprotetor de 4 μM de CA sob tratamento com 5 μM de OXA foi explorado combinando mecanismos anti-inflamatórios e anti-ferroptose. Os achados confirmam que a ativação desse mecanismo serve como um passo inicial crítico na OINP. A descoberta de inibidores específicos pode substituir as abordagens inespecíficas existentes, aumentando assim tanto a precisão quanto a eficácia das intervenções terapêuticas.

O modelo in vitro usado neste experimento envolve neurônios isolados do gânglio dorsal da raiz (DRG) de rato para o estudo do OINP. No entanto, esse modelo difere significativamente das células primárias humanas em base genética, características metabólicas e sensibilidade à toxicidade, o que pode dificultar a aplicação clínica direta das conclusões de pesquisa. Além disso, a manutenção funcional dos tecidos neurais in vivo depende da regulação precisa da coordenação multicelular e dos microambientes dinâmicos – fatores complexos que são desafiadores de replicar totalmente os modelos in vitro .

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Protocolo

NOTA: A linhagem celular foi derivada de linhagens celulares de ratos.

1. Análise de farmacologia de redes

NOTA: Os links podem ser encontrados na Tabela de Materiais.

  1. Encontrando possíveis alvos da CA
    1. Recupere informações estruturais do banco de dados PubChem e explore os potenciais mecanismos biológicos da AC. Em seguida, realize a análise de previsão de alvos usando o SwissTargetPrediction, aproveitando suas avançadas capacidades computacionais.
    2. Para aumentar a precisão e a abrangência da análise, cruze as metas previstas com bancos de dados específicos da Medicina Tradicional Chinesa, incluindo TCMSP e TCMIP.
    3. Revise a literatura relevante para identificar outros alvos potenciais. Duplique a lista consolidada de alvos para criar um conjunto de dados abrangente, servindo como referência crítica para estudos futuros de atividade biológica e desenvolvimento de medicamentos envolvendo AC.
  2. Identificação de potenciais alvos da dor neuropática (NP)
    1. Utilizando o banco de dados GeneCards e o banco de dados TTD, realize uma busca extensa usando as palavras-chave "dor neuropática" e "ferroptose". Priorize os alvos gênicos do banco de dados GeneCards com uma "Pontuação de Relevância" superior à mediana, pois esses genes demonstram maior pertinência ao foco da pesquisa.
    2. Integre os alvos gênicos previamente selecionados com dados retirados do TTD (Banco de Dados de Alvos Terapêuticos). Garantir a identificação abrangente dos potenciais alvos durante o processo de integração, cruzando todos os alvos gênicos selecionados com entradas de banco de dados TTD. Remova sistematicamente entradas duplicadas do conjunto integrado de alvos gênicos. Verifique se o conjunto de dados resultante contém uma lista única de potenciais alvos.
  3. Identificação dos alvos de interseção da "CA-NP- Ferroptose"
    1. Determine a interseção dos alvos para CA, NP e ferroptose usando um diagrama de Venn gerado online.
    2. Esses alvos de interseção foram designados como candidatos potenciais para a "via NP-ferroptose regulada pela CA."
  4. Construindo a rede de Interação Proteína-Proteína (PPI)
    1. Para investigar mais a fundo, submeta os alvos comuns para "CA-NP-ferroptose", "CA-NP" e "CA-ferroptose" ao banco de dados STRING.
    2. Defina o limite de pontuação de interação em "maior confiança > 0,4" e resfrenga o número máximo de interatores a 10 tanto para a primeira quanto para a segunda camada de interação. Aplique as configurações padrão para todos os outros parâmetros e construa uma rede de 4,5 PPI para "CA-NP-ferroptose".
  5. Análises de enriquecimento GO e KEGG
    1. Envie os alvos de interseção para "CA-NP-ferroptose" na plataforma DAVID com os seguintes parâmetros: "selecionar identificador: símbolo oficial do gene", "tipo de lista: genelista" e "espécie: Homo sapiens." A análise de enriquecimento da Ontologia Gênica (GO) foi realizada em três categorias: Processo Biológico (BP), Componente Celular (CC) e Função Molecular (MF).
    2. Realize a análise de enriquecimento de vias KEGG e visualize os dados resultantes usando gráficos de barras criados na plataforma Hiplot.

2. Acoplamento molecular

  1. Para elucidar a interação entre compostos ativos e seus alvos associados à doença, obtenha informações estruturais para substâncias ativas do banco de dados PubChem como pequenas moléculas, enquanto recupere as estruturas 3D das proteínas-alvo do Banco de Dados de Proteínas (PDB) como modelos proteicos.
  2. Utilize o PyMOL para pré-processar as estruturas dos receptores proteicos removendo moléculas de água e ligantes não essenciais. Em seguida, prepare as proteínas-alvo e substâncias ativas para acoplamento usando o AutoDock Tools 1.5.7, e execute o acoplamento molecular semi-flexível usando o AutoDock Vina.
  3. Analise as energias de ligação e os sítios ativos de ligação de substâncias nas proteínas receptoras. Para a proteína JAK2, sua estrutura (ID PDB: 3e64) foi selecionada do banco de dados PDB com base em dados cristalográficos de raios X e resolução ideal.
  4. Use o software PyMOL para preparar a estrutura JAK2 eliminando ligandos, removendo moléculas de água e adicionando hidrogênios. As estruturas de pequenas moléculas dos compostos ativos foram obtidas do PubChem.
  5. Carregue tanto as estruturas de proteínas quanto compostas no AutoDock Tools 1.5.7, defina as caixas de acoplamento e realize o acoplamento molecular com o AutoDock Vina.

3. Cultura celular

NOTA: Os seguintes passos serão repetidamente usados no experimento de validação. Siga técnicas rigorosas de asséptica. Essa parte do experimento utilizava uma centrífuga de rotor horizontal de baixa velocidade.

  1. Desinfete as embalagens externas e os frascos de cultura de células estéreis compradas com álcool 75%, e então transfera para recipientes de cultivo em uma bancada de trabalho super limpa para subcultura até que as células estejam espalhadas por cinco placas de Petri de 10 cm de diâmetro para garantir estoque celular suficiente.
  2. Criopreserve as células a -80 °C para experimentos subsequentes.
    1. Prepare DMEM, DMSO de grau de cultura celular, soro fetal bovino (FBS), tubos centrífugos de 15 mL, pipetas, crioviais e um banho de gelo. Misture 1 mL de DMSO, 1 mL de FBS e 8 mL de DMEM para alcançar um volume total de 10 mL. Resfrie o DMSO no gelo por 15 minutos. Primeiro, transfira o meio base para o tubo da centrífuga e, em seguida, adicione lentamente o DMSO pré-resfriado enquanto giro. Misture bem com uma pipeta, depois adicione o FBS suavemente e misture novamente. Armazene a mistura no banho de gelo para uso posterior.
      NOTA: Uma concentração de 20%-50% de DMSO resultou em um aumento significativo na liberação de LDH, indicando que altas concentrações de DMSO são citotóxicas, enquanto 10% de DMSO é relativamente segura. Isso não afetou nossoexperimento 25.
    2. Pegue células que crescem logarítmicamente, lave-as 3 vezes com PBS e depois adicione 0,25% de tripsina em placas de 400 μL/10 cm.
      NOTA: Uma vez que ocorre retração citoplasmática, as conexões ficam soltas ou, se houver sinais de flutuação em grande escala, o processo de digestão é imediatamente interrompido.
    3. Preparação pré-digestão: Preaqueça os reagentes-chave (0,25% solução de tripsina-EDTA e meio completo DRG) a 37 °C. Remova o frasco de cultura celular da incubadora e descarte o meio antigo usando uma pipeta estéril para evitar que o meio residual afete a eficiência digestiva. Enxágue suavemente as células cultivadas em camada única duas vezes com 5 mL de PBS estéril para remover o soro residual enquanto evita a elusão celular.
    4. Adicione 2 mL de solução pré-aquecida de tripsina-EDTA a 0,25% ao vaso de cultura, garantindo que cubra completamente a camada de célula única. Incube em temperatura ambiente por 1 a 3 minutos. Durante esse período, observe as células sob um microscópio invertido a cada 30 segundos. Pare imediatamente a digestão quando a maioria das células começar a se contrair, ficar arredondada e apresentar espaços intercelulares distintos (para evitar excesso de digestão e danos celulares).
    5. Adicione rapidamente 4 mL de meio totalmente pré-aquecido ao vaso de cultura. Pipetee suavemente a mistura 5 vezes com uma pipeta estéril para dispersar o agrupamento celular em uma suspensão de célula única. Transfira toda a suspensão de célula única para tubos centrífugos estéreis de 15 mL e colete o pellet da célula por centrifugação a 300 x g 5 min usando uma centrífuga de rotor horizontal de baixa velocidade a 25 °C.
    6. Descarte o sobrenadante e adicione 5 mL do meio de criopreservação preparado. Sopra suavemente com uma pipeta para misturar as células de forma uniforme. Distribua-os uniformemente em 5 frascos.
    7. Rotule o criovial com o nome da célula, data de congelamento e operador; Coloque em um recipiente congelante e armazene em um freezer a -80 °C, depois transfira para nitrogênio líquido após o armazenamento durante a noite.
  3. Reanimação celular
    1. Use luvas, retire o frasco do recipiente de nitrogênio líquido e imediatamente mergulhe-o em água morna a 37 °C, agitando-o ocasionalmente para garantir o descongelamento rápido (em até 1 minuto).
    2. Retire o frasco do banho-maria a 37 °C, abra a tampa, aspire a suspensão da célula com uma pipeta, transfira para um tubo centrífuga, adicione 10 vezes o volume do meio de cultivo, misture bem e centrifuge a 300 x g por 5 minutos (25 °C).
    3. Descarte o sobrenadante, adicione 5 mL de meio de cultura suplementado com soro fetal bovino a 10% (o meio completo para essa condição de cultura celular), inocule o prato de cultura e incube estaticamente em uma incubadora de 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2 .
    4. Substitua o meio de cultivo no dia seguinte (para remover DMSO residual e células mortas) e continue observando a cultura para as condições de crescimento. Se a densidade celular for alta, realize a subcultura rapidamente para experimentos subsequentes.
  4. Contagem de células
    NOTA: Esta parte do experimento usou uma centrífuga de rotor horizontal de baixa velocidade.
    1. Prepare álcool 75% com antecedência para limpar a câmara de contagem e cobrir a barbatana, depois seque para uso posterior.
    2. Resuspenda as células digeridas e centrifugadas em 1 mL de meio e dilua 50 μL da suspensão celular com 150 μL de meio em um tubo EP de 1,5 mL para fazer uma diluição de 4 vezes.
    3. Oscile uniformemente, tome 10 μL e injete entre o deslizamento de cobertura e a câmara de contagem para preencher completamente a câmara evitando bolhas. Coloque sob o microscópio para observação e contagem. Princípios de contagem: Não omitir nem recontar; conte as células que toquem as bordas superior e esquerda, mas exclua aquelas que tocam as bordas inferior e direita.
    4. De acordo com os requisitos experimentais, calcule o volume de células com base na contagem desejada para a produção ou semeadura em pratos e os resultados da contagem, e então complemente o volume total do meio com meio completo.

4. Protocolo de ensaio de viabilidade celular

NOTA: A duloxetina foi selecionada como agente de controle da medicina ocidental porque é um medicamento amplamente utilizado e clinicamente validado para o tratamento da dor neuropática periférica. Sua eficácia estabelecida nessa indicação (apoiada por diretrizes de prática clínica e ensaios clínicos randomizados) garante que o grupo controle possa fornecer uma referência confiável para avaliar a eficácia relativa da intervenção teste.

  1. Primeiro, descarte o meio de cultura antigo do vaso de cultura e enxágue a superfície celular com 5 mL PBS para remover o soro residual. Depois, adicione 2 mL de solução de tripsina-EDTA a 0,25% e incube em temperatura ambiente por 1 a 3 minutos. Quando a observação microscópica revelar encolhimento, arredondamento e descolamento celular, adicione imediatamente 4 mL de Meio Completo DRG para terminar a digestão e ressuspender as células por pipeteamento.
  2. Transfira a suspensão da célula para um tubo centrífuga e colete o pellet da célula centrifugando a 300 x g por 5 minutos usando uma centrífuga de rotor horizontal de baixa velocidade a 25 °C. Descarte o sobrenadante e resuspenda a célula em um tubo centrífugo de 15 mL, depois ressuspenda completamente e misture a suspensão.
  3. Pegue um tubo EP de 1,5 mL e primeiro adicione 150 μL de meio de cultura, seguido por 50 μL de suspensão celular. Misture bem para obter uma diluição de 4 vezes.
  4. Depois, use álcool 75% para limpar a câmara de contagem e cobrir o vidro, secar e agitar o tubo EP de forma uniforme novamente.
  5. Retire 10 μL de suspensão de célula e injete-os entre o vidro da tampa e a câmara de contagem, garantindo que o líquido preencha a câmara sem gerar bolhas.
  6. Observe ao microscópio e conte o número de células de acordo com o princípio da contagem, evitando omissões ou duplicados.
    NOTA: Se o número contado de células for n, então a concentração de células no tubo centrífuga é n/mL.
  7. De acordo com os requisitos experimentais, semeia as células em uma placa de 96 poços com uma densidade de 2.000 células por poço, conforme necessário.
  8. Primeiro, injete 200 μL de PBS em cada poço do círculo periférico de uma placa de 96 poços, depois adicione meio de cultivo contendo células de acordo com o agrupamento.
  9. Após incubar em incubadora de 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2 por 24 horas, aspire o meio antigo e lave duas vezes com 200 μL de PBS. De acordo com a configuração experimental, diluir o CA passo a passo (0 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 32 μM) e adicionar 200 μL a uma placa de 96 poços.
  10. Pré-trate as células com OXA (5 μM) por 24 horas, depois trate células DRG com concentrações variáveis de CA (0 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 32 μM) por 24 horas, respectivamente.
    NOTA: Esta seção do experimento tem como objetivo determinar a concentração ideal de fármacos para a AC.
  11. Lave a placa de 96 poços três vezes com o buffer PBS e depois adicione 200 μL de solução de trabalho CCK-8 recém-preparada em cada poço. Essa etapa é realizada no escuro, e o tempo do experimento é controlado para ser concluído em até 10 minutos. Incube a solução por 4 horas em uma incubadora de 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2 . Por fim, meça os valores de absorção usando um leitor de microplaca. Repita todos os experimentos pelo menos três vezes sob condições idênticas.

5. MDA

  1. Semeie 10 ×10 6 células DRG em um recipiente de 15 cm e cultive durante a noite em uma incubadora de 37 °C, 95% de umidade e 5% deCO-2 . Remova o meio de cultura, adicione medicamentos e incube por 24 horas em uma incubadora de 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2 .
  2. Remova o meio de cultura e lave uma vez com 5 mL de PBS. Após a digestão, colete as células em um tubo cônico usando meio DMEM.
  3. Adicione as células DRG tratadas a microtubos de 5 mL, respectivamente. Centrifuge a 300 x g por 5 minutos com uma centrífuga de rotor horizontal de baixa velocidade e remova o sobrenadante. Depois, adicione 1 mL de PBS, misture pipetando e transfira para um novo microtubo de 1,5 mL. Centrifuge a 300 x g por 5 minutos com uma centrífuga de rotor horizontal de baixa velocidade e remova o sobrenadante.
  4. Adicione 100 μL de solução antioxidante de PBS, pipete para misturar e prepare a suspensão celular. Prepare a solução padrão MDA.
    NOTA: Veja a preparação da solução padrão de MDA usando o método de fluorescência; consulte a seção "Componentes do Kit" do kit para procedimentos detalhados.
  5. Adicione 100 μL de Lysis Buffer ao tubo de amostra e ao tubo padrão, respectivamente, e misture cuidadosamente usando um oscilador de vórtice. Deixe em temperatura ambiente por 5 minutos.
  6. Adicione 250 μL da solução de trabalho preparada a cada tubo e misture cuidadosamente usando um misturador de vórtice. Aqueça o banho-maria a 95 °C em um ambiente com luz natural por 15 minutos e depois coloque no banho de gelo por 5 minutos para esfriar. Centrífuga de rotor angular de alta velocidade a 10.000 x g por 10 min (4 °C).
  7. Pegue 100 μL de sobrenadante e adicione-o a uma placa preta de 96 poços. Meça a intensidade da fluorescência usando um leitor de microplacas de fluorescência (Ex: 540 nm, Em: 590 nm). Calcule a concentração de MDA na amostra com base na curva padrão.

6. Conteúdo de Fe2+ em células medido usando umkit de detecção de Fe2+

  1. Pré-aqueça o banho-maria com antecedência e aumente a temperatura para 37 °C. Use luvas, retire as células DRG do nitrogênio líquido, envolva-as em uma camada de saco plástico e depois submerga-as em água morna a 37 °C enquanto agita suavemente de forma intermitente para garantir o descongelamento completo em 1 minuto.
  2. Após o descongelamento, retire o frasco do banho-maria de 37 °C, abra a tampa, aspire a suspensão da célula, transfira-a para um tubo centrífugo de 15 mL e adicione 10 mL de meio de cultivo em gotas em gota, misturando bem. Centrífuga horizontal de rotor de baixa velocidade a 300 x g por 5 min (25 °C).
  3. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante, adicione 10 mL de meio de cultivo fresco, pipete para misturar bem e centrifuge novamente. Repita esse procedimento 3 vezes antes de inocular em novos recipientes de cultura.
  4. Cultive as células estaticamente em uma incubadora de 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2 . Troque o meio no dia seguinte para remover o DMSO residual e as células mortas, e então continue o cultivo. Se a densidade celular for alta, subcultivo oportuno. Subsequentemente, colete células na fase de crescimento logarítmico, digere-as, centrifuge e ressuspenda. Semeie as células ressuspensas em placas de 12 poços com densidade de 70%-80%, depois coloque as placas de volta na incubadora de 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2 para cultivo posterior.
  5. Observe o estado celular no dia seguinte, administre os tratamentos correspondentes conforme o sistema experimental e depois coloque novamente no incubador de 37 °C, 95% de umidade e 5% deCO-2 para cultivo contínuo.
  6. Após 24 horas de administração do medicamento, descarte o meio de cultivo original e lave as células uma vez com PBS. Adicione 300 μL/poço de sonda FerroOrange (1 μM) diluída em HBSS e incube a 37 °C, 95% de umidade e 5% dióxido de carbono por 30 minutos.
  7. Depois, adicione a solução de coloração de células vivas Hoechst 33342 (100x) na placa celular na proporção de 1:100, incube em temperatura ambiente no escuro por 5 minutos para colorir os núcleos celulares.
  8. Observe o efeito de coloração sob um microscópio de fluorescência e tire fotografias para documentação. Subsequentemente, use o ImageJ para calcular a intensidade média de fluorescência, repetindo o experimento três vezes para análise estatística.

7. Kit de detecção ROS

  1. Pegue células na fase de crescimento logarítmico, digera, centrifuge-as e ressuspenda-as, então semeia as células em uma placa de 12 poços com densidade (70%-80%). Após misturar cuidadosamente as células, coloque-as na incubadora de 37 °C, 95% de umidade e 5% deCO-2 para continuar o cultivo.
    NOTA: Para as etapas de digestão, centrifugação e ressuspensão, consulte o passo 4.1.
  2. Observe o status celular no dia seguinte, administre tratamentos correspondentes conforme o sistema experimental e então coloque as células de volta na incubadora de 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2 para continuar a cultura. Após 24 horas de administração do medicamento, descarte o meio de cultivo original e lave as células duas vezes com HBSS.
  3. Adicione 200 μL de solução de trabalho com corante DCFH-DA altamente sensível, depois incube a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2 por 30 minutos.
  4. Descarte o sobrenadante, lave duas vezes com HBSS e tinga com 2 μL da solução de coloração de células vivas Hoechst 33342 (100x) por 5 minutos, depois examine sob um microscópio de fluorescência. Repita o experimento três vezes com análise estatística.

8. Morfologia mitocondrial das células observadas usando TEM

  1. Descarte o meio de cultivo das células bem cultivadas, adicione 1 mL de solução fixadora de glutaraldeído 2,5% em temperatura ambiente e fixe as células no escuro em temperatura ambiente por aproximadamente 5 minutos. Raspe suavemente as células em uma direção usando um raspador de células.
  2. Transfira a suspensão da célula para um tubo centrífuga e centrífuga a 25 °C, 600 x g por 3 minutos usando uma centrífuga de rotor horizontal de baixa velocidade.
  3. Após descartar o sobrenadante da solução fixativa, adicione um novo fixador de microscopia eletrônica (use 1 mL por poço para uma placa de 12 poços) e fixe à temperatura ambiente, longe da luz por 30 minutos, depois transfira para 4 °C para armazenamento.
  4. Infiltração por desidratação: Insira a amostra na placa de embedding e coloque-a em um forno a 37 °C durante a noite.
  5. Polimerize o meio de infundimento em um forno a 60 °C por 48 s. Corte seções ultrafinas de 60-80 nm usando um ultramicrônomo.
  6. Tinga as seções com solução álcool saturada em acetato de uranila a 2% por 15 minutos, depois com citrato de chumbo por mais 15 minutos. Seque as partes manchadas durante a noite em temperatura ambiente. Observe e fotografe as seções sob um microscópio eletrônico de transmissão.

9. Western blotting

  1. Extraia a proteína total das células
    1. Trate e inocule as células em uma placa de Petri de 6 cm até que atinjam 70% de densidade.
      NOTA: Consulte o passo 3.3 para instruções sobre revivificação celular e inoculação.
    2. No prato de cultura, adicione 3 mL de OA (5 μM) e, após 4 horas, adicione o CA (4 μM).
    3. Prepare uma caixa de gelo, PBS pré-resfriado, raspadores de células, tampão de lise preparado e vários tubos EP rotulados com antecedência.
    4. Após o tratamento medicamentoso, remova o meio de cultura das células e lave-as duas vezes com PBS pré-resfriado. Realize esse processo no gelo e aspire qualquer PBS residual usando uma centrífuga a vácuo.
    5. Rotule cada placa de Petri, depois adicione 300 μL de tampão de lise e deixe sobre gelo por 5 minutos com agitação constante para evitar lise incompleta e congelamento.
    6. Depois, use um raspador de células pré-resfriadas para destacar as células aderentes, coletando 300 μL em um tubo EP após cada raspagem. Use um novo raspador de célula para cada raspagem e não o reutilize.
    7. Segure a tampa do tubo EP e misture bem em um mixer de vórtice, depois continue colocando no gelo por 25 minutos. Nesse momento, ligue a centrífuga de rotor angular de alta velocidade de 4 °C com antecedência, pois o pré-resfriamento da centrífuga requer um certo tempo de tempo.
    8. Após o término do temporizador, vórtice novamente, depois centrífuga de rotor angular em alta velocidade a 4500 x g por 15 minutos em uma centrífuga de 4 °C.
    9. Agora ligue o aquecedor do banho seco e ajuste a temperatura para 100 °C.
    10. Pegue o kit de quantificação de proteínas BCA, adicione amostras e reagentes à placa de 96 poços, misture bem e reaja em uma incubadora de 37 °C, 95% de umidade e 5% deCO-2 por 30 minutos. Meça o conteúdo proteico extraído usando um leitor de microplacas multifuncional, depois ajuste com o tampão de lise restante com base nos resultados para garantir que a concentração de cada amostra seja consistente.
    11. Por fim, com base no conteúdo de cada sobrenadante, adicione 1/5 de volume do 6× Loading Buffer para preparar o sistema de carregamento de proteínas. Aspire cuidadosamente 150 μL de sobrenadante em um novo tubo EP. Adicione 30 μL de buffer de carga de 6× ao sobrenadante e misture cuidadosamente (tipicamente na proporção 1:5). Guarde a mistura no gelo.
    12. Depois, aqueça a 100 °C no aquecedor por 6 minutos, segurando a tampa do tubo EP para evitar que ele se abra. Depois de aquecer, esfrie em um banho de gelo.
  2. Prepare um gel de proteína com concentração de 10%.
    1. Enxágue a placa de gel com água pura, seque ao ar, limpe o excesso de umidade e evite manchas de água e poeira o máximo possível.
    2. Retire o suporte de gel, com as placas curtas das duas placas de vidro na frente e as placas longas atrás, alinhando a base para garantir que o espaço entre as placas de vidro se encaixe firmemente com a fita de vedação na parte inferior do suporte para evitar vazamentos, depois prenda as placas com uma presa firme para preparar a fundição em gel.
    3. Prepare o gel inferior com 6 mL de água pura, 3,75 mL de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,15 mL de 10% SDS, 5 mL de 30% Acry/bis, 75 μL de 10% APS e 7,5 μL de TEMED.
    4. Gire suavemente para evitar espuma, depois adicione rápida e uniformemente entre as duas placas de vidro, deixando espaço para o gel superior. Em seguida, achate a superfície líquida com 1 mL de isopropanol e deixe repousar por aproximadamente 30 minutos.
    5. Enxágue o pente para preparação em gel com água pura, sece ao ar e reserve. Depois que o gel inferior estiver completamente solidificado, despeje o isopropanol, enxágue cuidadosamente 2-3 vezes com água pura, absorva o líquido e inverta a placa de gel para esvaziar o líquido restante.
    6. Prepare o gel de empilhamento superior com 6 mL de água pura, 2,5 mL de 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,1 mL de SDS 10%, 1,34 mL de Acry/bis 30%, 50 μL de APS 10% e 10 μL de TEMED.
    7. Preencha a camada superior e insira cuidadosamente um pente de 15 poços e 1,5 mm de espessura. Após 1-2 minutos, reabasteça os espaços, tomando cuidado para minimizar a formação de bolhas durante esse processo. Use um gel totalmente polimerizado.
  3. Eletroforese em gel proteico
    1. Pré-configure o Running Buffer e o Transfer Buffer, com o Transfer Buffer pré-resfriado em uma geladeira de 4 °C.
    2. Enxágue o gel de proteína com água ultrapura, retire um tanque de eletroforese limpo, prenda as duas placas curtas do gel proteico para dentro e opostas, despeje o Running Buffer e verifique se há algum vazamento.
    3. Remova cuidadosamente o pente, carregue 10 μL por poço com um total de 4 grupos de amostras. Carregue 3 grupos de amostra por gel, separados por um marcador proteico de 4 μL entre cada grupo, totalizando 15 poços.
    4. Após carregar as amostras, despeje todo o buffer de corrida restante no tanque de eletroforese, cubra-o com a tampa, ajuste a tensão para 140 V e execute eletroforese de tensão constante por 20 minutos.
    5. Quando as bandas proteicas entrarem no gel de separação após a concentração, ajuste a voltagem para 120 V para eletroforese em tensão constante. Durante esse processo, deixe a membrana NC de molho em Transfer Buffer. Pare a eletroforese quando o azul de bromofenol indicar que a amostra chegou à borda inferior do gel, e prepare-se para a transferência de membrana.
    6. Encha uma caixa de espuma até a metade com gelo, retire a grampa de transferência, o Transfer Buffer pré-resfriado e a membrana NC embebidida. Despeje metade do Transfer Buffer em um recipiente quadrado e plano.
    7. Retire o gel de proteína, enxágue bem com água ultrapura, coloque o lado preto voltado para baixo e o lado transparente para cima. No meio, organize uma camada de esponja, uma camada de papel filtrante, o gel proteico, a membrana NC, depois coloque outra camada de papel filtro e esponja.
    8. Após pressionar para remover bolhas de ar, prenda a fita de transferência e coloque-a no tanque de transferência. Quando ambos os géis proteicos estiverem totalmente inseridos, despeje todo o Transfer Buffer no tanque de transferência, depois adicione duas bolsas de gelo para resfriamento e cubra com a tampa.
    9. Envolva o fita de transferência com gelo e transfira em uma tensão constante de 120 V por 90 minutos. O processo de transferência gera calor significativo, então é necessário um banho de gelo para o resfriamento.
    10. Retire a membrana NC, imerga e tinga em 20 mL de solução de coloração Ponceau S, marque o tamanho do marcador com um lápis e corte a membrana com lápis de acordo com o tamanho da proteína alvo a ser detectada.
    11. Recupere a solução de coloração Ponceau S. Lave a solução de coloração com PBS e incube a membrana NC com 20 mL de tampão bloqueante, depois bloqueie em temperatura ambiente em um shaker em baixa velocidade por 1-2 horas.
    12. Descarte a solução bloqueante, enxágue rapidamente a membrana duas vezes com PBS em um shaker descolorizante para remover completamente a solução bloqueante, depois adicione os anticorpos correspondentes de acordo com as proporções de uso do Western Blot de cada anticorpo na caixa de incubação de anticorpos e incube durante a noite a 4 °C.
    13. Separadamente, recupere os anticorpos primários e armazene a -20 °C. As membranas foram rapidamente lavadas 4 vezes com TBST em um shaker descolorizante, 5 minutos a cada vez, para remover completamente os anticorpos primários. Depois, adicione 4 mL do tampão bloqueador com anticorpos secundários e incube as membranas em temperatura ambiente em um agitador lento por 1 hora.
    14. Lave o anticorpo secundário quatro vezes com tampão TBST por 5 minutos cada, depois substitua por tampão PBS para umedecer completamente a membrana NC.
    15. De acordo com o manual de instruções do reagente quimioluminescência da ECL, prepare a solução luminescente e a coloque sobre a superfície da membrana, depois incube por 1-2 minutos antes de revelar com um sistema de imagem em gel.
    16. Processe os dados brutos no sistema de imagem Image J e depois transfira para o software Photoshop para criação de figuras.

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Resultados

Farmacologia de Rede e Acoplamento Molecular
Identificação de potenciais alvos da AC: Na investigação abrangente da atividade farmacológica da CA, 60 potenciais alvos foram cuidadosamente selecionados a partir de uma extensa revisão da literatura relevante. Para expandir ainda mais o escopo da análise, mais 12 alvos potenciais associados à CA foram identificados por meio do banco de dados TCMSP. Para maior precisão e detalhe, as avançadas capacidades preditivas da pla...

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Discussão

A ferroptose, um modo recentemente identificado de morte celular, é caracterizada por acúmulo excessivo de ferro intracelular e peroxidação lipídica. Morfologicamente, a ferroptose se manifesta como retração mitocondrial, perda ou redução das estruturas das cristas e aumento da densidade da membrana, enquanto a membrana celular e a morfologia nuclear permaneceminalteradas 26. Mecanisticamente, a ferroptose é impulsionada pela depleção da glutationa (GSH) e pela at...

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Divulgações

Não há conflitos financeiros de interesse a serem divulgados

Agradecimentos

Expressamos nossa sincera gratidão pelas condições superiores proporcionadas pelo hospital e seus departamentos, que nos permitiram alcançar esses resultados. Ao mesmo tempo, também expressamos nosso sincero agradecimento aos muitos membros do laboratório por seus incansáveis esforços e valiosas contribuições ao longo dos anos. O trabalho árduo de cada participante é parte indispensável do nosso sucesso e, no futuro, continuaremos a trabalhar juntos para avançar no progresso na área da medicina. Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82104838), Programa Spark da China Promotion Foundation (XH-D001), Programa Chave de Pesquisa e Desenvolvimento da Província de Liaoning (2024JH2/102500062) e Fundação Provincial de Ciências Naturais de Liaoning (2025-MSLH-490).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
  GlicinaBiofroxx1275KG001
  Tris-baseBiofrooxx1115KG001
0,5  M  Buffer Tris-HCl (pH  6,8)Biorad1610799
1 M Tris-Hcl (PH 7,5)BeyotimeST775
1,5  M  Buffer Tris-HCl (pH  8,8)Biorad1610798
APSBeyotimeST005
Fonte básica de energia por eletroforeseBIO-RAD PowerPac Básico
Kit de Quantificação de Proteínas BCABeyotimeP0012
Anticorpo recombinante beta actinaHuabio81115-1-RR
Incubadora de dióxido de carbonoTermodinâmica150L
Kit de ensaio CCK-8ApexbioK1018
Kit de Ensaio de Atividade Celular e CitotoxicidadeBeyotimeC2015M
Cinnamaldeído (CA)MacklinC805134pureza 98%
Shaker descolorizadorKylin-BellTS-100
DMEM (Eagle Medium Modificado da Dulbecco)BasalMediaL110KJ
DMSOSigmaD2650
Gânglio da raiz dorsal (DRG)Biografia de FuhengFH165Número de série: 20211227-1
Meio completo DRGBiografia de FuhengFH-DRG
Solução luminescente ECLTermodinâmica34580
ErbB-1Proteintech06-8471:2000
Fetal  Bovino  SoroMacklinFO193
Sonda de detecção de íons ferrosos - FerroOrangeDojindoF374
FTH1Tecnologia de Sinalização Celular4393S1:1000
Sistema de imagem em gelBIO-RAD ChemiDoc Touch
Solução Salída Balanceada de Hanks (HBSS)SolarbioH1025
Centrífuga refrigerada de alta velocidadeEppendorf5804R
Hoechst 33342 Solução de Coloração de Células VivasBeyotimeC1028
Kit de imunohistoquímicaBiosharpBS-24-PB
Sistema de microscópio de fluorescência invertidaLeicaLeica Dmi 8
Anticorpo Monoclonal Recombinante do Coelho JAK2 [SY0245]HuabioET1607-351:2000
Microscópio de contraste de fase invertido de laboratórioLeicaLeica Dmi 1
Centrífuga de baixa velocidadeEppendorf5804
Kit de Detecção de Conteúdo MDASangonD799762
Leitor de microplacasNASCER DO SOL&NBSP;TECAN
Leitor de microplacas multifuncionalBMGLABTECH PHERAstar FS
NF-κ Anticorpo policlonal B p65Proteintech10745-1-AP1:1000
ParaformaldeídoMacklinP804536
Solução de coloração de PonceauBeyotimeP0022
Marcador de ProteínaTermodinâmica26617
P-STAT3 (Ser727)Tecnologia de Sinalização Celular9134S1:1000
P-STAT3 (Tyr705)Tecnologia de Sinalização Celular9145S1:2000
Anticorpo recombinante anti-glutationa peroxidase 4[EPNCIR144]Abcamab1250661:1000
Anticorpo Recombinante Anti-XCT[EPR27115-64]AbcamAB3076011:1000
Kit de Ensaio ROSDojindoR252
Buffer de Carregamento de Proteína SDS-PAGE (6X)BeyotimeP0289
Leite em pó desnatadoBiosharpBS102-500g
SDS de sulfato de dodecil de sódioBiofrooxx3250GR500
STAT3 (F-2)Santa CruzSC-80191:200
TEMEDSolarbio    T8090   
TFRCInvitrogen13-68000,5 & micro; g/mL
Tween80SelleckS6702
Bancada de trabalho ultra-limpaHDLDL-CJ-2NDI
Microscópio verticalOlympusCX 31
Eletroforese verticalBIO-RAD Mini Tetra Proteico
Tanque de transferência úmidoBIO-RAD Mini Trans Blot
α-Tubulinaα-TubulinaER130905
GraphPad PrismaAnálise estatística
Software ImageJObtenha o valor cinza do blot proteico

Referências

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