O colesterol e a estearamida medeiam a apoptose de linfócitos e a secreção de citocinas no lúpus eritematoso sistêmico

Resumo

Aqui, apresentamos um estudo que integra randomização mendeliana de duas amostras, validação metabolômica baseada em cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) e ensaios funcionais usando linfócitos derivados de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (LES) para avaliar as respostas de apoptose e citocinas após estimulação de metabólitos, com o objetivo de identificar biomarcadores relacionados a lipídios e investigar seus papéis imunorreguladores no LES.

Resumo

Alterações na composição de metabólitos séricos têm sido cada vez mais associadas ao lúpus eritematoso sistêmico (LES), mas os efeitos diretos desses metabólitos na função das células imunes permanecem mal definidos. Este estudo teve como objetivo identificar metabólitos do sangue periférico associados ao LES e avaliar seu impacto na apoptose e secreção de citocinas em linfócitos derivados de pacientes com LES.

Realizamos uma análise de randomização mendeliana (RM) de duas amostras para investigar a relação entre 565 metabólitos séricos e LES, usando o modelo ponderado de variância inversa como abordagem analítica primária. Achados significativos foram validados usando dados metabolômicos não direcionados publicados anteriormente com base em cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS). Em experimentos funcionais, linfócitos isolados de pacientes com LES foram estimulados com metabólitos alvo, seguidos de avaliação de apoptose e secreção de citocinas.

A análise de RM identificou 28 metabólitos significativamente associados ao LES. Destes, colesterol (OR = 1,462, IC 95%: 1,100-1,940, P = 0,008) e estearamida (OR = 0,125, IC 95%: 0,020-0,660, P = 0,014) foram validados por LC-MS e considerados elevados em pacientes com LES. A análise das características operacionais do receptor demonstrou forte desempenho diagnóstico (AUC = 0,999 para colesterol; AUC = 1,000 para a estearamida). Funcionalmente, ambos os metabólitos induziram aumento da apoptose e secreção elevada de TNF-α, IFN-γ e TGF-β1 nos linfócitos do LES.

Em resumo, nossa abordagem integrada combinando associação genética, perfil de metabólitos e ensaios funcionais revela que o colesterol pode contribuir para a desregulação imunológica no LES. Embora a estearamida tenha mostrado uma associação negativa com o risco de LES na análise de RM, seus efeitos in vitro refletiram os do colesterol, sugerindo um papel complexo e dependente do contexto. Esses achados ressaltam a importância do metabolismo lipídico no LES e apoiam uma investigação mecanicista e clínica adicional de seu impacto imunológico.

Introdução

O Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença autoimune crônica, caracterizada por patogênese complexa e diversas manifestações clínicas, que acomete milhões de pessoas em todo o^mundo1. A heterogeneidade do LES - onde os sintomas diferem amplamente entre os indivíduos e evoluem ao longo do tempo - cria desafios significativos no diagnóstico, monitoramento da atividade da doença e adaptação de planos de tratamento personalizados ^2,3. Embora os critérios de classificação do LES da Liga Europeia Contra o Reumatismo e do Colégio Americano de Reumatologia (EULAR/ACR) de 2019 tenham melhorado a precisão diagnóstica⁴, esses critérios não capturam todas as manifestações da doença e muitas vezes dependem de procedimentos invasivos como biópsia renal, que podem ser impraticáveis e onerosos para os pacientes.

Nos últimos anos, as pesquisas sobre metabólitos como biomarcadores no LES têm aumentado, demonstrando seu enorme potencial no diagnóstico precoce da doença, tipagem e avaliação prognóstica ^5,6,7. No entanto, o potencial translacional da pesquisa baseada em metabólitos no LES permanece limitado por vários desafios importantes. Em primeiro lugar, amostras pequenas são uma grande restrição⁸. A maioria dos estudos metabolômicos até o momento envolveu relativamente poucos participantes, o que limita sua capacidade de capturar a heterogeneidade clínica total do LES. Dado que o LES pode variar de envolvimento cutâneo leve a manifestações renais ou neurológicas graves, estudos com diversidade amostral insuficiente podem sofrer de baixa reprodutibilidade e generalização limitada⁹. Em segundo lugar, continua faltando profundidade mecanicista. Embora estudos anteriores tenham demonstrado associações entre metabólitos específicos e atividade da doença, danos a órgãos ou características clínicas específicas, a maioria dos achados permanece de natureza descritiva¹⁰. Essas investigações se concentraram amplamente nas diferenças quantitativas nos níveis de metabólitos e suas correlações estatísticas com indicadores clínicos, sem explorar os papéis causais dos metabólitos na imunopatologia do LES. Como a desregulação imunológica - incluindo apoptose aberrante de linfócitos e secreção desequilibrada de citocinas - é central para a patogênese do LES, entender como os metabólitos influenciam esses processos é crucial¹¹. Atualmente, poucos estudos investigaram diretamente como metabólitos específicos modulam a apoptose de células imunes ou a produção de citocinas no contexto do LES.

Aqui, este estudo tem como objetivo identificar biomarcadores metabólicos associados ao LES por meio da integração de análises de randomização mendeliana (MR) e metabolômica não direcionada LC-MS e elucidar os papéis funcionais desses metabólitos candidatos na modulação da apoptose de linfócitos e na produção de citocinas inflamatórias usando ensaios baseados em células-alvo, conforme mostrado na Figura 1.

Este é o primeiro estudo a integrar RM, validação metabolômica e ensaios funcionais in vitro para investigar os papéis causais e mecanicistas dos metabólitos lipídicos - particularmente colesterol e estearamida - na patogênese do LES. Ao combinar evidências genéticas, metabólicas e experimentais, este trabalho fornece uma visão abrangente e multifacetada de como alterações lipídicas específicas podem influenciar a desregulação imunológica no LES. Essa abordagem integrativa oferece uma nova estrutura para identificar potenciais biomarcadores metabólicos e alvos terapêuticos em doenças autoimunes¹².

Protocolo

Este estudo foi conduzido de acordo com os critérios de classificação EULAR/ACR de 2019. Este estudo foi aprovado pelo Hospital Popular de Shenzhen (Número de Aprovação do Comitê de Ética LL-KY-2019514).

Análise de randomização mendeliana (RM)

Fontes de dados GWAS
Os dados de associação genética para LES e 565 metabólitos foram obtidos do banco de dados OpenGWAS (https://gwas.mrcieu.ac.uk/). Os conjuntos de dados GWAS da doença estão resumidos na Tabela 1, enquanto as fontes e tamanhos de amostra para os dados GWAS de metabólitos são detalhados na Tabela 2. Esses conjuntos de dados forneceram a base para a análise de RM para explorar as relações causais entre metabólitos e LES 13,14,15,16.

Seleção de variáveis instrumentais
Variantes genéticas associadas a metabólitos sanguíneos e LES foram selecionadas como variáveis instrumentais (IVs) para a análise de RM. Os IVs foram escolhidos com base nos três pressupostos centrais da RM: relevância, independência e restrição de exclusão¹⁷. Especificamente, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) associados a metabólitos em um limiar de significância em todo o genoma de P < 5 × ^10-8 foram selecionados¹⁸. Para garantir a independência entre os IVs, foi realizada a agregação de desequilíbrio de ligação (LD) com um limiar de r² < 0,001 e uma distância física de 10.000 kb usando a população europeia como painel de referência¹⁹. Esse processo minimizou a redundância e garantiu que cada IV fornecesse informações exclusivas para a análise de RM.

Análises estatísticas
A principal abordagem estatística para a análise de RM foi o método ponderado de variância inversa (IVW), que combina os efeitos de múltiplos IVs para estimar o efeito causal dos metabólitos no LES²⁰. Para explicar a potencial pleiotropia, foram realizadas análises de sensibilidade usando regressão MR-Egger²¹. A força de cada IV foi avaliada usando estatísticas F, com apenas SNPs exibindo F > 10 retidos para garantir uma força robusta do instrumento²². SNPs com estatísticas F mais baixas foram excluídos para evitar viés de instrumento fraco. As análises finais de RM foram realizadas somente quando não foi detectada heterogeneidade ou pleiotropia significativa, garantindo a confiabilidade das estimativas causais²³.

Análises de sensibilidade
Várias análises de sensibilidade foram empregadas para avaliar a robustez dos achados da RM. A heterogeneidade entre os IVs foi avaliada pelo teste Q de Cochran, enquanto a pleiotropia foi avaliada pela regressão MR-Egger²⁴. Além disso, uma análise leave-one-out foi conduzida para determinar se os resultados de RM foram desproporcionalmente influenciados por qualquer SNP²⁵ único. Gráficos de floresta foram gerados para visualizar os efeitos individuais e combinados dos IVs. Essas análises coletivamente garantiram que os resultados de RM não fossem influenciados por efeitos pleiotrópicos ou SNPs discrepantes.

Fonte de dados metabolômica
Os dados metabolômicos utilizados neste estudo foram derivados de um estudo publicado anteriormente por nosso grupo de pesquisa¹⁰. Nesse estudo, realizamos análises metabolômicas em amostras de soro de 121 pacientes com LES e 106 indivíduos saudáveis. O perfil metabolômico não direcionado foi realizado usando cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massa (UHPLC-MS). Os dados foram processados usando fluxos de trabalho metabolômicos padrão, incluindo detecção de pico, alinhamento e normalização, para identificar metabólitos significativamente associados ao LES. Esses metabólitos foram então cruzados com os resultados da análise de RM para identificar metabólitos sobrepostos. Informações mais detalhadas podem ser encontradas na publicação anterior¹⁰. Os metabólitos significativamente associados na análise metabolômica e aqueles com associações causais significativas na análise de RM foram mapeados para seus respectivos IDs HMDB usando a plataforma MetaboAnalyst. Os metabólitos comuns foram então identificados cruzando os dois conjuntos de IDs HMDB.

Medições de citocinas e ensaio de apoptose
Um total de 3 pacientes com LES foram incluídos (Tabela 3), de acordo com os critérios de classificação EULAR/ACR de 2019.

Coleta de amostras de sangue periférico e isolamento de linfócitos
Amostras de sangue periférico (3-6 mL) foram coletadas dos participantes usando tubos a vácuo contendo heparina sódica como anticoagulante. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas por centrifugação com gradiente de densidade Ficoll-Paque (400-800 × g por 20-30 min). As células isoladas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS, HyClone) por centrifugação de baixa velocidade (250 × g por 10 min) e ressuspensas em meio RPMI-1640 completo suplementado com 10% de soro fetal bovino. A densidade celular foi ajustada para 1 × 10⁶ células/mL, conforme verificado por um contador automático de células. A suspensão celular foi semeada em placas de cultura e pré-incubada por 2 horas a 37°C em atmosfera de CO₂ a 5% para promover a aderência. Após a pré-incubação, as células não aderentes no sobrenadante da cultura foram cuidadosamente coletadas e submetidas ao isolamento de linfócitos. A suspensão coletada foi suavemente colocada sobre Ficoll-Paque e centrifugada novamente a 400 × g por 20 min sem freio. A camada de células mononucleares na interface plasma-Ficoll foi cuidadosamente aspirada, lavada duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e ressuspensa em meio RPMI-1640 contendo 10% de soro fetal bovino. A viabilidade e a concentração celular foram avaliadas usando o contador automático de células, e os linfócitos foram posteriormente usados para aplicações a jusante.

Tratamento e cultura celular
As células foram divididas em cinco grupos para tratamento: Grupo controle: Tratados com igual volume de DMSO. Grupo de tratamento do colesterol: Tratado com colesterol na concentração de 1,5 mmol/L. A concentração de 1,5 mmol/L de colesterol livre utilizada neste estudo foi selecionada para simular um microambiente rico em lipídios além dos níveis fisiológicos. O colesterol livre circulante em indivíduos saudáveis geralmente varia de 0,9-1,3 mmol / L. A concentração ligeiramente elevada usada neste experimento teve como objetivo imitar o acúmulo patológico de lipídios que pode ocorrer em tecidos inflamados ou metabolicamente perturbados no LES. Grupos de tratamento com estearamida: Tratados com estearamida em concentrações de 5 μmol/L e 10 μmol/L. As concentrações de estearamida (5 e 10 μmol/L) foram selecionadas com base em um relatório prévio²⁶, que sugeriu que níveis de estearamida na faixa de 5-10 μmol/L podem mimetizar o acúmulo elevado de lipídios em condições patológicas. A intenção aqui foi explorar os efeitos pró-apoptóticos e imunomoduladores da exposição lipídica de alta concentração nos linfócitos do LES, simulando estados inflamatórios ou metabolicamente desregulados. O colesterol e a estearamida foram primeiro dissolvidos em DMSO para preparar soluções estoque de alta concentração, que foram então diluídas em meio de cultura para atingir as concentrações alvo. A concentração final de DMSO em todos os grupos não excedeu 0,1% (v/v). Após a adição dos respectivos tratamentos, as placas foram agitadas suavemente para garantir uma distribuição uniforme e incubadas por 48 h a 37 °C em um ambiente de 5% de CO₂.

Ensaio de apoptose
Para os experimentos de apoptose, 1 × 10⁶ a 3 × 10⁶ células foram coletadas e lavadas duas vezes com PBS pré-resfriado. Um grupo de controle positivo foi preparado ressuspendendo as células em 500 μL de solução de controle positivo de apoptose pré-resfriada e incubando em gelo por 30 minutos, seguido por outra lavagem com PBS. Os grupos experimentais foram tratados conforme descrito na seção 1.7, com tratamentos controle, colesterol (1,5 mmol/L) e estearamida (10 μmol/L). Após o tratamento, 1-10 × 10⁵ células (incluindo as do sobrenadante de cultura) foram coletadas e ressuspensas em 500 μL de tampão de ligação 1× (preparado pela diluição de 5× solução estoque com água bidestilada Cada amostra foi misturada com um número igual de células vivas não tratadas, e o volume foi ajustado para 1,5 mL com tampão de ligação 1× pré-resfriado. A suspensão foi então dividida em três tubos: um para controle de branco e dois para compensação de mancha única (Anexina V-FITC e PI). A cada tubo experimental, foram adicionados 5 μL de Anexina V-FITC e 10 μL de solução de coloração PI, seguidos de vórtice e incubação em temperatura ambiente no escuro por 5 minutos. A citometria de fluxo foi realizada usando um laser de excitação de 488 nm para detectar Anexina V-FITC (emissão a 530 nm) e PI (emissão a 615 nm). O tubo de controle em branco foi usado para definir as tensões de dispersão direta (FSC), dispersão lateral (SSC) e canal de fluorescência, enquanto os tubos de coloração única foram usados para compensação de fluorescência. A apoptose foi analisada usando gráficos de dispersão de parâmetros duplos para avaliar a proporção de células apoptóticas^27,28.

Detecção de fator imunológico
Após a incubação de 48 h, as suspensões celulares foram centrifugadas (250 × g por 5 min) para coletar os sobrenadantes da cultura, que foram armazenados a -80 °C até a análise. A quantificação de citocinas foi realizada usando um Painel de Resposta Imune Essencial Humana comercial, seguindo as instruções do fabricante com otimizações para o instrumento. Resumidamente, 25 μL de tampão de ensaio e 25 μL de padrões (variando de 2,4 a 10.000 pg/mL) ou amostras foram adicionados a cada poço de uma microplaca. A mistura de grânulos foi vórtice por 30 s e adicionada aos poços, elevando o volume total da reação para 75 μL. A placa foi incubada com agitação (800 rpm) em temperatura ambiente por 2 h no escuro. Após duas lavagens automatizadas (1× tampão de lavagem, 250 × g por 5 min), 25 μL de anticorpo de detecção biotinilado foram adicionados a cada poço e incubados por 1 h. Posteriormente, 25 μL de estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE) foram adicionados por 30 min para amplificar o sinal.

A aquisição dos dados foi realizada por meio de um citômetro de fluxo equipado com um laser de excitação de 488 nm e um filtro de 575/26 nm para detecção de EP. Antes de cada experimento, foram usados cordões de calibração para otimizar as tensões do tubo fotomultiplicador e a compensação espectral. Os dados foram analisados usando o software LEGENDplex v8.0, com concentrações de citocinas determinadas por meio de ajuste de curva logística de cinco parâmetros (5PL). Os limites de detecção para cada citocina variaram de 0,68 pg/mL a 1,97 pg/mL, e os experimentos foram conduzidos em duplicata para garantir a precisão (coeficiente de variação entre poços <10%). Os resultados foram expressos como média ±± desvio padrão, e as diferenças estatísticas entre os grupos foram avaliadas por meio de ANOVA de uma via seguida do teste post-hoc de Tukey em um software de análise estatística apropriado. O período de incubação de 48 horas foi selecionado com base nas mudanças dinâmicas na secreção de citocinas para capturar a resposta imune de forma abrangente. A calibração diária do instrumento e o controle da concentração de DMSO (≤0,1%) garantiram a confiabilidade e reprodutibilidade dos resultados 29,30,31.

Resultados

Associação entre metabólitos chave e manifestações clínicas no LES

Neste estudo, a análise de RM de 565 metabólitos com LES identificou associações causais significativas. Conforme mostrado na Figura 2, foram identificados 28 metabólitos significativamente associados ao LES, englobando categorias como peptídeos, aminoácidos, energia, lipídios, carboidratos e ácidos graxos. Peptídeos como gama-glutamilfenilalanina e pró-hidroxi-pro, aminoácidos inc...

Discussão

Nosso estudo demonstra que 1,5 mmol/L de colesterol, 5 μmol/L de estearamida e 10 μmol/L de estearamida induzem padrões semelhantes de apoptose e secreção de citocinas em linfócitos de pacientes com LES, embora tenham sido observadas variações de magnitude. Especificamente, tanto o colesterol de 1,5 mmol / L quanto a estearamida de 5 μmol / L aumentaram significativamente a apoptose nos linfócitos do LES. Além disso, o tratamento com colesterol 1,5 mmol / L em combinação com 5 μmol / L o...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Apoptose Annexin V-FITC/PI	Multiciências	AP101	Para detecção de apoptose via citometria de fluxo
Colesterol	Shanghai Jinpan Biotech Co., Ltd.	JP1210051	Usado para experimentos de estimulação em PBMCs (10 g)
Inserto de Poço de Contramão	Corning	CBG10001	Usado para separar fisicamente células em experimentos de cocultura
Citômetro de Fluxo	Beckman Coulter	CytoFLEX	Análise citométrica de fluxo
GraphPad Prism Software	GraphPad		Análise estatística e elaboração gráfica
LEGENDplex Painel de Resposta Imunológica Essencial Humana	BioLegend	740390	Detecção multiplex de citocinas relacionadas ao sistema imunológico
Conjunto de Micropipetas	Eppendorf	Vário	Manuseio de líquidos e transferência de volume (0.1– 10 & mu; L, 10 e ndash; 100 & mu; L, 100 e traço; 1000 & mu; L)
Meio de Separação de Linfócitos do Sangue Periférico	Fabricante Doméstico	B1.1420A	Usado para isolamento PBMC (200 mL)
RPMI-1640 Médio	Gibco	C22400500BT	Meio de cultura para PBMCs
Stearamida	Shanghai Jinpan Biotech Co., Ltd.	1267285	Usado para estimulação lipídica de PBMCs (100 g)
Placa estéril de 24 poços	Fabricante Doméstico	BLJ182A	Para cultura celular
CountStar	Shanghai Ruiyu Biotechnology	CS200	Contador automático de células
PBS	Hyclone	10010023	Lavagem de células
Ficoll-Paque & nbsp;	Cytiva	17-5442-03	Isolamento de células sinoviais
LEGENDplex software	BioLegend	Versão 8	Análise de dados de citometria de fluxo
GraphPad Prism 9.0	GraphPad Software	Versão 9	Análise estatística