Método para Privação Seletiva de Sono REM usando o Movimento Setivo do Nariz para Esquecer o REM (SNiFFer)

Summary

Apresentamos um protocolo inovador para a privação seletiva do sono Rapid Eye Movement (REM) em roedores.

Abstract

O sono é amplamente categorizado em estágios de Movimento Rápido Ocular (REM) e não-REM, e várias técnicas de privação de sono foram desenvolvidas para estudar suas funções. Métodos tradicionais — como estimulação mecânica ou deixar o animal cair durante o sono REM — frequentemente levam a uma rápida habituação e efeitos não intencionais do estresse, dificultando a interpretação. Aqui, apresentamos um método novo, leve e gentil para privação de sono REM em roedores: SNiFFer. Sabe-se que roedores são altamente sensíveis a estímulos nasais. Nesse método, um pincel macio acaricia suavemente o nariz do animal durante o sono REM, desencadeando a excitação de forma confiável. Para aplicar seletivamente essa técnica durante o sono REM, utilizamos um sistema de classificação de estágios do sono baseado em IA em tempo real por Eletroencefalografia (EEG). A intervenção foi acionada apenas durante episódios de REM, e um grupo controle com jugo foi incluído, recebendo o mesmo padrão de estimulação independentemente do estado de sono. Aplicamos ainda SNiFFer em um paradigma de Condicionamento de Medo Traçado para testar se a privação de sono REM dentro de 6 horas após o aprendizado interfere na consolidação da memória. Comparados aos controles com jugo, os animais tratados com SNiFFer apresentaram uma diminuição significativa no total de episódios de REM e na duração dos episódios de REM, indicando a especificidade e eficácia do método. Em conclusão, a técnica SNiFFer oferece uma abordagem tátil altamente seletiva e minimamente invasiva para privação de sono REM em camundongos. Ele permite o controle preciso das condições experimentais e abre novas possibilidades para investigar o papel do sono REM na memória e cognição — com um toque delicado.

Introduction

O sono com movimento rápido dos olhos (REM) desempenha um papel fundamental em processos cognitivos como a consolidação da^{memória 1,2}. Para investigar a importância funcional do sono REM no cérebro, a privação de sono REM é comumente empregada como uma abordagem experimental. Atualmente, quatro métodos principais são amplamente usados para induzir privação de sono REM em roedores: o método do disco^{giratório 1}, o método do vaso^{de flores 3}, o método do sopro^{de ar 4} e as técnicas de estimulação^{física 5,6}. Embora os métodos de disco giratório e vaso de flores sejam altamente eficazes para eliminar o sono REM, eles frequentemente introduzem um estresse substancial ao animal, como exposição à água ou fadiga^{física 7}, o que pode confundir a interpretação dos resultados comportamentais e fisiológicos. Da mesma forma, os métodos de sopro de ar e de estimulação física convencionais tendem a fornecer estímulos amplos e inespecíficos ao corpo, resultando em variabilidade na intensidade do estímulo e escolha limitada de grupos^{controle 4,8}.

Realizamos uma comparação abrangente da literatura abrangendo mais de seis décadas de pesquisa sobre privação de sono REM, fornecida no Arquivo Suplementar 1 e na Tabela Suplementar 1. Incorporamos estudos históricos, mecanicistas, neuroquímicos, hormonais e comportamentais fundamentais das principais linhas de pesquisa, incluindo Jouvet, Rechtschaffen, Bergmann, Tufik, Andersen e Borbély. A Tabela Suplementar 1 organiza os principais trabalhos em ordem cronológica. Ele traça a evolução metodológica das técnicas de privação do sono REM e resume seus principais achados biológicos, neuroquímicos, hormonais, imunológicos, termorreguladores e comportamentais. Como o presente manuscrito é estruturado como um artigo de métodos em vez de uma revisão histórica abrangente, isso foi adicionado como informação suplementar.

Para enfrentar essas limitações, desenvolvemos um método inovador que oferece alta seletividade para privação de sono REM. Essa técnica foi projetada para privar seletivamente os roedores do sono REM de maneira precisamente controlada. Nessa abordagem, limitamos o estímulo ao nariz do animal — uma das áreas mais sensíveis em^{roedores 9}. Além disso, empregamos um sistema de classificação de estágios do sono em tempo real criado por IA para detectar e interromper episódios de sono REM com especificidade temporal¹⁰. Este sistema de IA refere-se ao sinal de EEG nos últimos 4 s de um único canal e avalia os estágios atuais de sono do camundongo. Essa configuração também permite a implementação de grupos de controle ligados ao yugo, possibilitando intervenções temporárias e adaptadas. Embora categorizado como uma técnica de privação de sono REM baseada em estimulação física, nosso protocolo difere dos métodos convencionais. Primeiro, aplicamos análise em tempo real dos estágios do sono usando IA para uma intervenção precisa e consistente específica do REM. Segundo, limita a região de estimulação apenas ao topo do nariz, que é uma das áreas mais sensíveis em^{camundongos 6}, resultando em variação mínima na duração e intensidade da estimulação. Por fim, montamos recentemente um grupo controle ligado que recebeu quantidades idênticas de estímulo para controlar fatores de confusão. Este protocolo propõe um método para investigar funções específicas do sono REM.

Para avaliar a utilidade desse método, aplicámo-lo para investigar o papel do sono REM na consolidação da memória de medo traço. Estudos anteriores relataram que a privação de sono REM prejudica a consolidação da memória de medo dependente do hipocampo, incluindo as memórias de medo^{atrasadas 11,12}. No entanto, há evidências conflitantes quanto ao impacto da privação do sono REM nos processos de memória que envolvem circuitos cerebrais distribuídos e^{complexos 5,13}. A consolidação da memória de traço do medo requer a associação de um choque no pé (estímulo incondicionado), um sinal auditivo (estímulo condicionado) e o intervalo de traço entre eles — um processo conhecido por recrutar múltiplas regiões cerebrais, incluindo o hipocampo, córtex pré-frontal medial e^{amígdala 14}. Portanto, privamos os camundongos do sono REM por 6 horas imediatamente após o condicionamento de medo^{traço 15}, uma janela de tempo conhecida por ser crítica para a consolidação^{da memória 16}. Usando esse protocolo, avaliamos o efeito da privação de sono REM na consolidação dos traços de memória que dependem da atividade coordenada dos sistemas neurais distribuídos. Este artigo apresenta um método inovador que descreve um protocolo experimental detalhado que testa os efeitos.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Tsukuba. Ratos machos e fêmeas C57BL/6J (11–13 semanas de idade, 20–35 g) foram usados neste estudo. A lista completa de materiais e instrumentos utilizados neste estudo está fornecida na Tabela de Materiais.

1. Implantação cirúrgica de eletrodos de EEG¹⁷

1. Anestesia e preparação do animal
   1. Induza anestesia com 4% de isoflurano misturado com ar em 3 minutos. A anestesia adequada foi confirmada pela ausência do reflexo de retirada dos pedais e do tônus muscular, juntamente com padrões respiratórios estáveis.
   2. Raspe a região dorsal da cabeça e do pescoço, da nuca até a área entre os olhos, usando uma máquina de barbear elétrica. Quando um camundongo indica vigília, como movimento de bigode, induza anestesia novamente.
2. Fixação da cabeça e exposição ao crânio
   1. Prenda o animal em uma estrutura estereotáxica, garantindo alinhamento nasal e craniano. A partir desse momento até o fim de todo o procedimento cirúrgico, a anestesia foi mantida continuamente por meio de um sistema de bomba vaporizadora de isoflurano.
   2. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea. Remova qualquer pelo restante com um creme depilatório.
   3. Faça uma incisão no couro cabeludo na linha média e retraia suavemente a pele para expor o crânio desde a linha posterior da orelha até a linha anterior dos olhos. Remova o tecido mucoso com cotonete.
3. Identificação e nivelamento de marcos
   1. Identificar bregma e lambda; ajuste o braço estereotáxico para que esses pontos fiquem nivelados dentro de ±0,05 mm. Verifique se as coordenadas laterais ±3,0 mm do bregma também estão niveladas (±0,05 mm).
4. Perfuração e posicionamento do parafuso
   1. Marque as seguintes coordenadas em relação ao bregma. Fure quatro furos piloto como essas coordenadas. Anterior–Posterior / Medial–Lateral: +1,5 mm / ±1,5 mm, –3,0 mm / ±1,7 mm.
   2. Implante parafusos de gravação EEG em cada furo e fixe-os com cola gel à base de cianoacrilato. Envolva e cubra o crânio exposto e os chumbos com uma fina camada de cimento dental.
5. Cuidados pós-operatórios
   1. Administre 0,5 mL de solução glicosica a 5% e 0,13 mL de ibuprofeno (ou analgésico equivalente).
   2. Retorne o rato à sua gaiola de origem, uma gaiola cilíndrica de Plexiglas (21,9 cm de diâmetro, 31,6 cm de altura) colocada dentro de uma câmara isolada (45,7 x 50,8 x 85,4 cm). A câmara é mantida a uma temperatura de 23,5 ± 2,0 °C, umidade relativa de 50,0% ± 10,0%, e um ciclo de luz e escuro de 12 horas (fase clara: 9:00 às 21:00).
   3. Coloque o animal em uma gaiola de recuperação aquecida. Espere em frente à gaiola até que um rato acorde. Após a cirurgia, os animais foram mantidos em alojamento individual e não retornaram ao alojamento coletivo durante toda a duração do experimento.

2. Manuseio e habituação

1. Cronograma para experimentação
   1. Comece o manuseio durante a fase leve, 24–48 horas após a cirurgia. Continue por quatro dias consecutivos.
2. Procedimento cirúrgico
   1. No primeiro dia, coloque um mouse na mão por 2 minutos e 2 vezes. Coloque o rato na palma aberta do experimentador com os dedos estendidos e a palma voltada para cima. Posicione a palma da mão um pouco mais acima do antebraço, pois camundongos tendem naturalmente a escalar em superfícies elevadas. Permitir que o mouse se mova livremente sem restrições; Se o rato tentar subir no antebraço, devolva-o suavemente à palma segurando levemente a base da cauda. Cada intervalo tem mais de 20 minutos. Isso deve ser realizado durante a fase de luz.
      NOTA: Se um rato pular da mão ou mordê-la, use pano ou papel de seda para cobrir a mão apenas no primeiro dia. As roupas podem ser reutilizadas e devem ser limpas a cada 2 semanas.
   2. No dia 2–4, coloque um mouse à mão por 2 minutos e 3 vezes. Cada intervalo e o período conduzido são os mesmos do dia 1. Avalie a habituação comportamentalmente: camundongos não habituados normalmente tentam escapar pulando ou mordendo com força, enquanto ratos habituados exploram ativamente a palma da mão com tentativas mínimas de fuga e pouca ou nenhuma mordida forçada.
   3. Ao final da sessão final de manuseio, conecte o mouse ao cabo de gravação EEG.
      NOTA: Quando o material de cama for excessivo para atrapalhar o nariz do rato, retire alguns manualmente e remova-os durante a sessão de manuseio ou no momento da conexão.

3. Registro de EEG de referência

1. Comece nos dias 5 e 6 pós-operatórios. Grave EEG contínuo das 11:00 às 17:00 todos os dias. Se o material da cama obstruir o acesso ao nariz do camundongo, remova gradualmente o excesso de cama para garantir acesso nasal claro, minimizando a perturbação do animal para o processo posterior.

4. Condicionamento do^{medo 18,19}

1. Comece o pós-operatório no dia 7 (ou 8) entre 22h e 23h. Como preparação, borrife 70% de etanol na câmara de condicionamento (30 x 25 x 24 cm), que consiste em paredes acrílicas transparentes e um piso de grade em aço inoxidável (hastes de 2,0 mm de diâmetro espaçadas 6,0 mm).
2. Protocolo de treinamento (total de sessões: 1.100 s)
   1. Entregue cinco pistas auditivas (som ascendente de 20 s, 5–20 kHz a 1,25 Hz, duração de 0,8 s) a 180 s, 400 s, 620 s, 840 s e 1060 s. Combine cada sinal sonoro com o choque de pé (1,0 mA, 2 s) entregue em 218 s, 438 s, 658 s, 878 s e 1098 s.

5. Privação de sono REM

1. Grupo de privação de sono REM (grupo RSD)
   1. Imediatamente após o condicionamento do medo (ZT2-ZT8), monitore o EEG em tempo real ativando o sistema de classificação dos estágios do sono baseado em IA para permitir a detecção em tempo real do sono REM. Ao detectar sono REM, faça cócegas suaves no nariz do animal com um pincel macio até que ele se excite novamente, com uma latência média do início do estímulo à excitação de 0,89 ± 0,063 s (média ± SEM).
   2. Durante o experimento, a excitação foi definida como uma resposta comportamental ao estímulo tátil, especificamente ao movimento dos bigodes após a estimulação. Registre o carimbo de hora de cada cócega para análise posterior.
      NOTA: O movimento de cócegas foi realizado sem um padrão direcional fixo (por exemplo, para frente e para trás, para cima ou circular), mantendo uma estimulação tátil leve consistente limitada ao topo do nariz. Se o nariz estiver obstruído, direcione a estimulação para a região vibrissal (bigode), que normalmente fica exposta. Se o camundongo estiver de costas para o pincel, gire a gaiola conforme necessário para garantir acesso livre à região nasal. Ao usar uma gaiola com tampa aberta, a estimulação também pode ser aplicada por cima para garantir acesso nasal ou vibrissal consistente.
2. Grupo de controle com jugo (grupo com jugo)
   1. Parear cada camundongo com yoked com um equivalente privado de REM. Aplique cócegas no nariz no camundongo preso em sincronia com os episódios REM do parceiro, coincidindo tanto com início quanto duração. Cada camundongo usa o mesmo pincel dedicado durante todo o experimento de privação de sono REM. Após cada uso, borrife a escova com água levemente ácida e limpe com papel de papel. Deixe pelo menos 24 horas entre os usos para garantir que o pincel limpo esteja completamente seco.

6. Testes de memória

1. Teste de recordação contextual (Teste A)
   1. Comece a partir de 24 horas (±3 horas) após a privação de sono. Devolva o rato à câmara de condicionamento original (com odor de etanol de 70%). Grave o comportamento de travamento por 5 minutos.
2. Teste de recordação por som (Teste B)
   1. Realize a sessão 3 horas após o Teste A.
   2. Preparação do contexto: Spray de água no contexto B (prisma triangular (30 cm de altura) consistindo em três paredes com comprimentos laterais de 31 cm, 24 cm e 24 cm. Duas das paredes são cobertas com papel branco, e a terceira parede é feita de acrílico transparente, através do qual um retângulo azul é visível ao fundo. A estrutura possui piso plástico e teto transparente de acrílico).
   3. Grave o comportamento de travamento por 6 minutos. Dê um único sinal sonoro de 180 s igual ao treinamento em 180 s.

7. Análise de dados

1. Pontuação do Estágio do Sono (Figura 1C-G)¹⁷
   1. Para cada vigília/NREM/REM, calcule o valor total, número de episódios, duração média dos episódios e número de transição do sono com base nos dados avaliados por especialistas humanos. Critérios de cada etapa a seguir.
      Esteira: Baixa amplitude, alta frequência (β/γ)
      NREM: Alta amplitude, baixa frequência (δ)
      REM: De baixa amplitude, dominante theta
2. Qualidade da privação (Figura 1B)
   1. Avalie a fase do sono durante a qual cada estímulo de cócegas é aplicado comparando seu carimbo de tempo com dados de EEG anotados por um especialista humano.
3. Comportamento de congelamento (Figura 1H,J-K)
   1. Use FreezeFrame4 (Actimetrics) para quantificar a imobilidade (excluindo a respiração) durante testes de condicionamento do medo e de recordação.
      1. Inicie o software FreezeFrame 4 e selecione o modo Gravador . No menu Arquivo (canto superior esquerdo), especifique a pasta de destino para salvar os arquivos de gravação. Nos quatro campos de entrada brancos no painel esquerdo, insira identificadores únicos correspondentes a cada mouse, garantindo alinhamento com as quatro janelas de exibição de arquivos no lado direito da tela.
      2. Clique no painel de Protocolo na parte inferior da interface e defina os parâmetros de gravação, incluindo a duração total da gravação e o tempo dos sinais auditivos e choques de pé de acordo com o desenho experimental.
      3. Clique em Referência no centro da tela para obter a imagem de referência de fundo. Coloque o mouse na câmara de condicionamento e clique em Iniciar para começar a gravar.
4. Análise do índice de discriminação (Figura 1L)
   1. Calcule o índice de discriminação pela seguinte fórmula:
      Congelamento em 5 minutos de média no teste A - congelamento nos primeiros 3 minutos de média no teste B) / congelamento máximo em 5 minutos de média no teste A, congelamento nos primeiros 3 minutos de média no teste B.
5. Análise do índice de reatividade de choque (Figura 1I)
   1. Use o rastreamento manual para medir o movimento bidimensional dos animais 2 antes e depois do choque no início da sessão de condicionamento do medo. Calcule o índice de reatividade de choque pela seguinte fórmula:
      Movimento durante o choque - Movimento pré-choque / Movimento durante o choque + Movimento pré-choque

Results

Implantação cirúrgica de eletrodos de EEG
Os camundongos devem ser totalmente anestesiados durante a cirurgia. Se apresentarem sinais de falha da anestesia, como dificuldade, devem ser removidos do protocolo. Da mesma forma, se o sangramento durar mais de 10 segundos, pode causar danos graves ao cérebro do camundongo, e recomenda-se a remoção da experimentação. Após a cirurgia, a maioria dos camundongos normalmente acorda em até 1 hora. A marcha e o movimento ocular d...

Discussion

Esse protocolo permite privação seletiva de sono REM em camundongos com camundongos controle em jugo. Ao contrário de métodos tradicionais como o vaso de flores e as técnicas de disco rotativo, esse sistema permite a implementação de grupos de controle finamente alinhados, nos quais os animais recebem estimulação idêntica no mesmo momento circadiano. Além disso, essa abordagem minimiza a variabilidade na localização da estimulação, uma limitação comum dos métodos convencionais de manusei...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% de glicose	Otsukba	35061410
Cabeçalho de 6 pinos	Hirose	172-0989
Adesivo	Konishi	16351
Máquina anestésica	Shinano Seisakusho	SN-487-0T
Revestimento de crimpadura	Hirose	688-9095
Soquete de crimpadura	Hirose	688-8982
Freezeflame4	Associados de Medicina	RRID:SCR_014429	Versão 4.104
GraphPad Prisma	GraphPad	RRID:SCR_002798	Versão 10.5.0
Ibuprofeno	Indústria Química de Tóquio	I0415
Isoflurano	Viatris	901036504
Loctite454	Henkel	UFI:  MAK2-7WRP-G202-F235
Rato (C57BL/6J)	O Laboratório Jackson	RRID: IMSR_JAX:000664	11,0 - 13,0 semanas de idade na sessão de condicionamento do medo
Pincel	Namurataiseidou	4943668000448	SDflat nº 8, comprimento da ponta: 8,2 mm; Largura: 18,8 mm
Líquido Provinice	Shofu	21400BZZ00451000	250 mL
Pó Provinice	Shofu	21400BZZ00451000	250 g
SleepSignRecorder	KISSEI COMTEC	RRID:SCR_018200	Versão 1.2.10
Parafuso de aço inoxidável	Yamazaki	N/A	φ 1.0 e vezes; 2.0
Instrumentos Estereotaxicos Padrão	ALA Scientific	68038
Óleo de girassol	Sigma-Aldrich	S5007-250ML
Petrolato branco	Taiyo Pharmaceutical	K09-TS