Artigo de método

Pré-condicionamento térmico durante a perfusão pulmonar ex-vivo para a reabilitação de enxertos pulmonares danificados antes do transplante

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DOI:

10.3791/69084

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31 de outubro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Service of Thoracic Surgery, Department of Surgery and Anesthesiology Services, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University, 2Service of Adult Intensive Care Medicine, Department of Interdisciplinary Centers and Logistics, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta um modelo de perfusão pulmonar ex-vivo de ratos incorporando uma exposição transitória a um estresse térmico calibrado, promovendo mecanismos protetores endógenos para o recondicionamento terapêutico de enxertos pulmonares danificados. A abordagem é escalável e reprodutível e apóia o desenvolvimento de terapias não medicamentosas para melhorar o sucesso do transplante de pulmão.

Resumo

A perfusão pulmonar ex-vivo (PPEV) surgiu como um avanço no transplante pulmonar, permitindo tanto a avaliação funcional dos pulmões do doador quanto as intervenções terapêuticas para reabilitar enxertos marginais. As estratégias de recondicionamento incluem abordagens farmacológicas e não farmacológicas. Entre os últimos, demonstramos que o estresse térmico transitório e controlado ("Pré-condicionamento Térmico", TP) é um meio eficaz de restaurar pulmões danificados, induzindo uma resposta protetora endógena ao choque térmico. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo para um modelo de PPEV em ratos que incorpora TP para recondicionar pulmões submetidos a isquemia quente, simulando doação após morte circulatória (DCD). O protocolo detalha a preparação pulmonar, canulação, perfusão e indução da resposta ao choque térmico. A TP consiste em um aumento de 30 min na temperatura do perfusato para 41,5 °C no início da PPEV, seguido por um rápido retorno a 37 °C para o restante da perfusão. Em um modelo de PPEV de 6 h, os pulmões tratados com TP (n = 30) mostraram aumento da expressão da proteína 70 de choque térmico, melhora da complacência pulmonar estática, redução do edema, menor liberação do fator de von Willebrand (um biomarcador de lesão endotelial) e dano histológico atenuado em comparação com os controles (n = 30). O protocolo permite o monitoramento em tempo real da resistência vascular, pressões das vias aéreas, complacência pulmonar e oxigenação, além de oferecer suporte a análises moleculares e morfológicas tanto no perfusato quanto no tecido. Este protocolo reprodutível e escalável é adaptável a sistemas maiores de EVLP animal ou humano, fornecendo uma plataforma translacional prática para estudar intervenções não farmacológicas destinadas a melhorar os resultados do transplante.

Introdução

A perfusão pulmonar ex-vivo (PPEV) representou um grande avanço no campo do transplante pulmonar. Seu principal impacto reside na expansão do conjunto de enxertos pulmonares de doadores disponíveis, permitindo a avaliação funcional dos pulmões marginais para permitir o uso de órgãos que, de outra forma, seriam descartados para transplante 1,2. Os pulmões marginais (ou critérios estendidos) referem-se a um ou mais dos seguintes critérios: idade do doador superior a 55 anos, PaO2/FiO2 inferior a 300, tempo de isquemia superior a 6 h, microbiologia positiva do escarro, radiografia anormal3. Além da avaliação fisiológica, a PPEV pode servir como uma plataforma para a aplicação de várias intervenções terapêuticas que visam melhorar a qualidade do enxerto antes do transplante (conceito de recondicionamento terapêutico)4. Como tal, a PPEV oferece a oportunidade única de reabilitar pulmões danificados (marginais) e reduzir o risco de disfunção primária do enxerto (PGD), uma complicação importante que prejudica os resultados precoces e de longo prazo após o transplante de pulmão 5,6. O PGD é a expressão clínica do processo de lesão de isquemia-reperfusão (IRI), cuja fisiopatologia se baseia no estresse oxidativo, na inflamação, na ativação do complemento e das cascatas de coagulação e na indução de processos de morte celular 7,8,9. Em última análise, esses mecanismos contribuem para interromper as funções normais do endotélio e do epitélio pulmonar, levando ao edema pulmonar não cardiogênico com capacidade de oxigenação reduzida, as duas principais características do PGD 6,10,11,12.

Um número crescente de estudos experimentais, tanto pré-clínicos quanto clínicos, demonstrou a eficácia de várias estratégias terapêuticas ex-vivo para aliviar a IRI durante o transplante de pulmão. Exemplos incluem agentes farmacológicos direcionados a oxidantes e radicais livres, vias de morte celular, mediadores inflamatórios, bem como terapias celulares e genéticas, para citar apenas alguns 13,14,15,16,17,18,19,20 . Além dessas abordagens terapêuticas, a PPEV também pode servir como uma plataforma para a aplicação de estresse fisiológico diretamente no enxerto pulmonar, para eliciar mecanismos de proteção intrínsecos que proporcionam uma tolerância adaptativa a insultos fisiopatológicos subsequentes. Uma dessas estratégias envolve a aplicação de estresse térmico transitório e não letal ao enxerto pulmonar durante a PPEV. De fato, sabe-se há muito tempo que condições de estresse térmico promovem uma resposta adaptativa ao choque térmico, resultante da expressão de uma série de proteínas de choque térmico (HSPs) atuando como chaperonas moleculares e conferindo resistência à exposição adicional a vários estímulos estressantes21. Além da indução de HSP, algumas adaptações celulares adicionais foram identificadas após a exposição ao calor, incluindo (a) a via antioxidante e citoprotetora do fator 2 relacionado ao NF-E2 (NRF2), cuja ativação após o estresse térmico regula notavelmente o gene citoprotetor heme oxigenase 22,23; (b) a resposta proteica desdobrada (UPR), que lida com o estresse proteotóxico no retículo endoplasmático (estresse RE), e cuja ativação pelo calor pode ser protetora ou prejudicial, dependendo da intensidade do estresse térmico 24,25,26; (c) autofagia, um processo citoprotetor que promove a degradação lisossômica de organelas e macromoléculas danificadas, que podem ser ativadas ou inibidas pelo calor de maneira dependente da temperatura e do tempo27,28.

Demonstramos que esse "pré-condicionamento térmico" oferece grandes benefícios em termos de redução do estresse oxidativo, inflamação, morte celular e disfunção endotelial, levando a uma proteção significativa contra a IRI pulmonar. Portanto, propusemos que o pré-condicionamento térmico pode representar um novo método não farmacológico para reabilitação terapêutica ex-vivo de enxertos pulmonares danificados antes do transplante 29,30,31. O pré-condicionamento térmico pode oferecer várias vantagens sobre as estratégias farmacológicas e não farmacológicas existentes. Ao provocar uma resposta endógena celular integrada, ele pode fornecer simultaneamente proteção contra vias fisiopatológicas distintas pertencentes ao IRI, enquanto outras estratégias geralmente visam uma única via. Além disso, evita o risco de potenciais efeitos colaterais associados ao uso de compostos farmacológicos. O objetivo do presente artigo é apresentar um protocolo detalhado passo a passo de pré-condicionamento térmico durante a perfusão pulmonar ex-vivo de pulmões de ratos danificados, que pode ser aplicado em diversos ambientes, principalmente em modelos animais maiores ou pulmões humanos para fins de pesquisa.

Utilizamos o sistema pulmonar perfundido isolado de rato IPL-2 para EVLP. A configuração é descrita na Figura 1 e inclui o seguinte: Reservatório de perfusato (Figura 1-1); duas bombas de rolos, para circulação de perfusato (Figura 1-2A) e amostragem de perfusato (Figura 1-2B); banho-maria termostático (Figura 1-3) para manutenção da temperatura de perfuso; um trocador de gás de membrana (Figura 1-4) conectado a um tanque de gás (não mostrado) contendo uma mistura de 6% de O2, 10% de CO2 e 84% de N2 para desoxigenar e carboxilar o perfusato de entrada; dois sensores de pressão (Figura 1-5) para monitorar as pressões do átrio esquerdo (AE) e da artéria pulmonar (AP) (o sensor de pressão AP não é visível na figura); uma câmara aquecida e selada (Figura 1-6) que abriga o bloco coração-pulmão com conexões dedicadas para AP, AE e cânulas traqueais; um ventilador (Figura 1-7) conectado à cânula traqueal para ventilação pulmonar e para a medida da pressão das vias aéreas e complacência pulmonar estática; um termômetro eletrônico (Figura 1-8) para exibir a temperatura do perfusato no nível do fluxo de entrada do PA. Uma plataforma de conexão (Figura 1-9) cujos elementos são apresentados em detalhes na Figura 2: Conexão para as cânulas PA (Figura 2-1), AE (Figura 2-2) e traqueal (Figura 2-3); conexão a um módulo de peso (Figura 2-4) para o monitoramento contínuo do peso do bloco coração-pulmão; Um sensor de temperatura (Figura 2-5) para o monitoramento da temperatura do perfusato no fluxo de entrada do PA. Uma descrição esquemática detalhada do circuito pode ser encontrada em outro lugar18.

Protocolo

NOTA: Ratos Sprague-Dawley machos adultos foram usados para este estudo (n = 60; idade, 8-11 semanas de idade; peso, 300-450 g). Os animais foram alojados (2 ratos/gaiola) em nosso biotério local, mantidos sob um ciclo de 12 h de luz / 12 h de escuridão com acesso ilimitado a comida e água. Todos os animais foram tratados de acordo com as "Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" (Publicação NIH nº 96-23), e todos os experimentos foram realizados de acordo com o protocolo experimental aprovado pelo nosso comitê local de cuidados com os animais (Direction Générale de l'Agriculture, la Viticulture et Affaires Vétérinaires de l'Etat de Vaud (autorizações 3456a e 3456x1). O tamanho e o peso dos animais foram selecionados com base em nossos estudos anteriores no modelo de PPEV de ratos e por conveniência anatômica (tamanho dos pulmões e vasos). A cepa de Sprague-Dawley foi escolhida, uma vez que outras cepas (notadamente ratos Wistar) podem apresentar reações de hipersensibilidade à solução de dextrana presente na solução de perfusato 1,32.

1. Descrição geral do circuito EVLP

NOTA: A configuração é descrita na Figura 1 e os elementos da plataforma de conexão (Figura 1-9) são exibidos em detalhes na Figura 2. Uma descrição esquemática detalhada do circuito foi descrita anteriormente18.

  1. Use uma solução extracelular tamponada acelular para a perfusão ex-vivo . Certifique-se de que o perfusato flui do reservatório através do trocador de gases e é direcionado através da cânula PA para perfusão pulmonar e, em seguida, sai pela cânula LA de volta ao reservatório. Monitore continuamente as pressões de entrada (PA) e saída (LA).
  2. Conecte todos os transdutores (pressão PA, pressão LA, peso pulmonar, velocidade da bomba) à caixa conversora analógica/digital (Figura 3). Abra o Software Básico de Aquisição de Dados (BDAS). Calibre os sinais de pressão usando calibração de dois pontos (0; 10 cm H2O) usando uma coluna de água. Calibre o módulo de peso usando calibração de dois pontos (0 g e 1 g). Calibre a velocidade da bomba usando uma amostragem de perfusato de 1 min a 10 mL/min. Controle a qualidade dos sinais aplicando pressões conhecidas e velocidade da bomba e avaliando a adequação dos resultados (protocolo detalhado e vídeo para calibração de sinais podem ser encontrados em materiais suplementares).
  3. Registre todos os parâmetros-chave (PA, pressões de AE, peso pulmonar e fluxo) em tempo real pelo software do sistema e observe sua exibição visual em um computador pessoal.
    NOTA: Os sinais fisiológicos registrados pelo BDAS são exportados para um arquivo de texto usando o comando File export na barra de menus. Os dados extraídos em pontos de tempo selecionados (a cada 60 minutos) são transferidos para uma planilha e, em seguida, copiam/colam no software para análise estatística.
  4. Calcule a resistência vascular pulmonar (RVP) usando a equação (1):
    figure-protocol-1Características (1)
  5. Obtenha amostras (1-2 mL) do perfusato em pontos de tempo dedicados para as medições de vários marcadores biológicos.

2. Aplicação de pré-condicionamento térmico

  1. Conecte um banho-maria termostático (Figura 4-1) para garantir uma temperatura de água constante, precisa e ajustável para aquecimento de perfusato. Use uma bomba motorizada integrada dentro do banho-maria para circular a água aquecida.
  2. Use um recipiente de vidro de parede dupla como reservatório (Figura 4-2) para manter a temperatura de perfusato circulando água aquecida entre as paredes do recipiente.
  3. Use uma serpentina de aquecimento com tubo serpentino dentro de um recipiente de água aquecida (Figura 4-3) para acionar o perfusato, permitindo a troca de calor da água para o perfusato imediatamente antes de entrar na preparação pulmonar ex-vivo.
  4. Alojar o bloco coração-pulmão na câmara do órgão (Figura 4-4), um recipiente de parede dupla cheio de água que circula do banho-maria termostático para manter um ambiente quente.
  5. Para o sensor de temperatura e o termômetro (Figura 2-5 e Figura 4-5), aplique com segurança e firmeza um sensor de ar/superfície de esferas Tipo K contra a cânula de entrada para monitoramento contínuo da temperatura real do perfusato que entra na artéria pulmonar (PA). A temperatura é exibida em um termômetro digital.
  6. Para manter a temperatura do fluxo de entrada em 37 °C, ajuste o banho-maria em 38-38.5 °C.
    NOTA: Para compensar as perdas de calor do perfusato ao longo de seu curso na tubulação, determinamos em nossas condições que a temperatura do banho-maria deveria ser ajustada em 38-38,5 ° C para manter 37 ° C no fluxo de entrada. Dependendo das perdas de calor do perfusato, essas configurações podem ter que ser adaptadas para garantir a temperatura desejada na entrada.
  7. Inicie o protocolo de aquecimento ex-vivo após 60 min de EVLP aumentando a temperatura do banho-maria até 43 °C para atingir uma temperatura de entrada de 41,5 °C, que é obtida em 5 min e mantida por mais de 30 min.
    NOTA: Em nosso trabalho anterior29, determinamos a temperatura ideal para pré-condicionamento térmico (TP), usando uma faixa de temperaturas de 40 °C a 43,5 °C e um protocolo EVLP de 3 h, conforme ilustrado na Figura 5. A temperatura de aquecimento que fornece proteção ideal sem quaisquer efeitos nocivos (conforme resumido na Figura 5B) foi de 41,5 °C. Essa temperatura foi, portanto, usada em todos os nossos experimentos subsequentes, com durações de EVLP de até 6 h29,30,31.
  8. Após este aquecimento transitório, adicione gelo ao banho-maria para reduzir rapidamente (em 5 min) a temperatura do banho-maria de volta para 38 °C para obter a temperatura do perfusato na cânula de entrada de volta para 37 °C e manter essa temperatura até o final do protocolo EVLP.
  9. Determinar variáveis fisiológicas (complacência pulmonar), formação de edema e desfechos moleculares (expressão de proteínas de choque térmico, enzimas antioxidantes, citocinas inflamatórias e biomarcadores de apoptose, autofagia, estresse do retículo endoplasmático e dano às células endoteliais).

3. Protocolo EVLP detalhado para pré-condicionamento térmico

  1. Preparação animal
    1. Prepare os materiais necessários, incluindo cânulas e instrumentos cirúrgicos (Figura 6A, B e Tabela de Materiais).
    2. Pese o animal para calcular as dosagens apropriadas para todas as substâncias administradas, fluxo de perfusato e parâmetros de ventilação.
    3. Prepare a mistura anestésica: 80 mg/kg de cetamina e 8 mg/kg de xilazina na mesma seringa.
      NOTA: Os agentes anestésicos devem ser armazenados em um gabinete seguro.
    4. Prepare heparina 1,7 U/g de peso corporal em solução salina isotônica (seringa de 1 mL).
    5. Anestesiar o animal, utilizando isoflurano a 5% (vaporizado em câmara de indução dedicada), seguido de injeção intraperitoneal da mistura anestésica preparada. Mantenha a anestesia com isoflurano a 1-2% por meio de uma máscara facial.
      NOTA: É importante manter anestesia profunda para evitar ofegar durante a exsanguinação.
      Use uma configuração com um sistema de extração de isoflurano para proteger o operador.
      Descarte todas as agulhas e seringas em recipientes apropriados de risco biológico e resíduos pontiagudos. Recipientes selados e de risco biológico são então descartados através de fluxos de resíduos designados.
    6. Raspe o animal da garganta até a área do pênis e remova qualquer pelo restante usando papel úmido e quente.
    7. Verifique a profundidade da anestesia beliscando a pata traseira; aumentar a concentração de isoflurano se houver reflexos.
    8. Coloque o animal em decúbito dorsal e prenda os quatro membros com fita adesiva.
  2. Extração do bloqueio coração-pulmão para PPEV
    NOTA: O procedimento requer treinamento intensivo para realizar as diferentes etapas de maneira oportuna, atraumática e altamente reprodutível. A etapa mais delicada é a canulação da artéria pulmonar, que deve ser realizada sob magnificação usando um microscópio operatório especular para obter os melhores resultados. O procedimento completo pode ser realizado por um único investigador bem treinado. Para alcançar essa independência experimental, é necessário um mínimo de 15 procedimentos completos sob a supervisão de um investigador experiente.
    1. Levante suavemente a pele na linha média da garganta e faça uma incisão longitudinal de 5 cm ao longo do eixo caudal a cefálico usando uma tesoura pequena.
    2. Separe os lobos das glândulas salivares e disseque cuidadosamente a fáscia sobre os músculos esterno-hióideos usando uma pinça curva até que a laringe e a traqueia estejam claramente expostas.
    3. Passe uma sutura de seda 4-0 por baixo da traqueia e prepare um nó pré-amarrado, deixando a pinça no lugar sob a traqueia.
    4. Calcule o volume corrente (Vt) para ventilação in vivo e aquisição pulmonar usando a fórmula de Stahl33:
      figure-protocol-2× figure-protocol-3
    5. Defina o ventilador dedicado para ventilação in vivo e aquisição pulmonar (consulte a Tabela de Materiais) para o volume corrente calculado com uma frequência respiratória de 70 respirações/min, uma fração inspirada de oxigênio (FiO2) de 0.5 e uma pressão expiratória final positiva (PEEP) de 3 cm H2O.
      NOTA: Para definir a PEEP em 3 cm H2O, conecte o braço expiratório do ventilador a um tubo de silicone curado com platina inserido 3 cm abaixo da superfície de um recipiente cheio de água.
    6. Faça uma incisão transversal entre dois anéis cartilaginosos, insira uma cânula de diâmetro externo de 2 mm (14 mm de comprimento, cânula de ventilação EVLP, Figura 6B) para ventilação e prenda-a apertando a sutura.
    7. Conecte a cânula ao ventilador e confirme a ventilação eficaz pela presença de bolhas no recipiente cheio de água conectado ao braço expiratório do ventilador.
    8. Usando uma tesoura de ponta romba, incise a pele ao longo do abdômen e entre na cavidade peritoneal, continue incisando os músculos da parede abdominal da linha média até o diafragma.
    9. Mova suavemente os intestinos para o lado usando cotonetes para expor a veia cava inferior.
    10. Injete a solução de heparina preparada na veia e deixe-a circular por 5 min. Em seguida, faça o transecto da veia cava e da aorta para exsanguinação.
    11. Assim que o animal estiver totalmente exsanguinado e confirmado morto, interrompa a ventilação e desconecte o ventilador da cânula traqueal para permitir que os pulmões esvaziem, marcando o início da isquemia quente. Manter o tempo isquêmico quente total (WIT) em 1 h.
      NOTA: Embora a mediana relatada de WIT na doação de pulmão DCD clínica seja de 33 min, não foram relatados efeitos prejudiciais de durações de WIT de até 60 min na sobrevida de 1 ano. Portanto, a maioria dos centros atualmente concorda com 60-90 min como um limite superior aceitável de WIT34. Conforme detalhado anteriormente, o uso de 1 h WIT em nosso modelo de rato é, portanto, relevante para o cenário clínico35.
    12. Quinze minutos antes do final do tempo isquêmico quente total de 1 h (ou seja, após 45 min de isquemia quente), encha uma seringa de 60 mL (fixada em um suporte) com solução de preservação fria (4 ° C, armazenada na geladeira) (ver composição na Tabela 1).
      NOTA: O fundo da seringa é colocado a 20 cm acima do animal. Conecte a seringa à cânula PA, usando um tubo de silicone imerso em água gelada (Figura 6C).
    13. Realize uma esternotomia mediana usando uma tesoura de Lister de ponta romba para evitar danos ao tecido e retraia cuidadosamente a parede torácica usando afastadores rombos presos a faixas elásticas e um hemostático de micromosquito preso ao diafragma para expor os pulmões. Evite qualquer contato direto com o parênquima pulmonar.
      NOTA: A partir desta etapa, para evitar o ressecamento do tecido, aplique uma pequena quantidade de soro fisiológico na superfície do pulmão quando necessário.
    14. Faça uma incisão em "X" no ápice do ventrículo esquerdo do coração e deslize a tesoura dentro do coração até o átrio esquerdo para facilitar a inserção posterior da cânula do AE.
    15. Passe uma sutura de seda 5-0 sob o PA principal e prepare um nó duplo pré-amarrado e segure a sutura de um lado com um suporte caseiro (Figura 6D e Figura 7A).
    16. Prepare uma sutura adicional ao redor do coração para posterior fixação da cânula do AE (Figura 7B).
    17. Faça uma pequena incisão no PA principal e insira a cânula PA, garantindo que nenhuma bolha de ar seja introduzida.
    18. Perfundir imediatamente os pulmões com 25 mL da solução de preservação fria através da cânula PA, iniciando o tempo de isquemia fria.
      NOTA: Use pressão passiva da altura da seringa no suporte descrito acima para esta perfusão.
    19. Prenda a cânula no lugar com a sutura pré-amarrada.
    20. Imediatamente após a canulação do PA, reconecte a cânula traqueal ao ventilador e retome a ventilação com as configurações iniciais, reduzindo a frequência respiratória para 25 respirações/min.
    21. Insira a cânula do AE através da incisão no ventrículo esquerdo no átrio esquerdo.
    22. Prenda a cânula com a segunda sutura pré-amarrada (ao redor do coração), tomando cuidado para evitar que o fluxo seja impedido do átrio esquerdo e permita a passagem de todo o volume de 25 mL de solução de preservação fria (leva ~ 15 min).
    23. No final da perfusão da solução de preservação, clampeie a cânula PA com uma pinça bulldog (Figura 7C, círculo azul) e desconecte-a do tubo.
    24. Disseque cuidadosamente a traqueia e os tecidos circundantes para mobilizar os pulmões.
    25. Clampeie a traqueia usando um clipe de aneurisma (Figura 7C, círculo vermelho), enquanto os pulmões estão totalmente inflados (um volume corrente).
    26. Disseque a aorta descendente e outros vasos de suporte para liberar o bloqueio coração-pulmão, levantando-o segurando suavemente a traqueia.
    27. Colocar o bloqueio coração-pulmão numa cápsula contendo a solução de conservação em decúbito ventral e conservar a 4 °C durante um tempo total de isquemia fria de 1 h.
      NOTA: No final da cirurgia, coloque os restos biológicos em sacos de descarte de resíduos para posterior eliminação pelo serviço dedicado.
  3. Ex-vivo perfusão pulmonar e pré-condicionamento térmico
    NOTA: Consulte o fluxograma que descreve as principais etapas para orientar a progressão pelos diferentes estágios do protocolo (Figura 8).
    1. Coloque um balde de gelo no banho-maria termostático para reduzir a temperatura do perfusato para 15 °C.
    2. Encha o reservatório com 100 mL de perfusato e deixe-o circular pelo sistema. Use a solução de perfusão à base de albumina humana (ver composição na Tabela 1) como a solução extracelular tamponada acelular para a perfusão ex-vivo .
    3. Meça o pH do perfusato e mantenha-o em um nível fisiológico (7,35-7,45), adicione tampão tris (hidroximetil) aminometano (THAM) de acordo.
    4. Pese o bloco coração-pulmão e monte-o no sistema EVLP, começando com a cânula de ventilação, mantendo o clipe de aneurisma no lugar na traqueia.
    5. Conecte a cânula PA, evitando cuidadosamente a introdução de bolhas de ar na vasculatura pulmonar (certifique-se de que a caixa de bolhas esteja cheia).
    6. Deixe algumas gotas de solução de perfusão saírem e conecte a cânula do AE.
    7. Defina a pressão do átrio esquerdo em 3 mm Hg ajustando a altura da linha de saída conectada ao circuito de drenagem.
    8. Zero o módulo de peso e monitore a mudança no peso do bloco coração-pulmão durante a PPEV.
    9. Calcule o débito cardíaco teórico (DC) usando a fórmula desenvolvida por Lindstedt e Schaeffer:
      figure-protocol-4
    10. Inicie a perfusão (2% do CO teórico) e aumente gradualmente o fluxo de perfusato (7,5% do CO teórico) e a temperatura de acordo com os parâmetros especificados, conforme descrito na Tabela 2.
      NOTA: Durante a PPEV, o fluxo de perfusato é definido entre 2% e 7,5% do CO teórico calculado. Esse baixo fluxo de perfusato permite manter a pressão arterial pulmonar dentro dos limites normais e reduzir o risco de edema pulmonar precoce, especialmente em pulmões danificados por isquemia quente. Isso permite que os usuários mantenham a preparação por longos períodos de tempo. Outros pesquisadores usaram fluxos comparáveis para EVLP de rato, enquanto outros usaram fluxos de até 20% do CO teórico38.
    11. Ajuste a temperatura do perfusato aumentando progressivamente a temperatura do banho-maria.
      NOTA: Tome cuidado para manter as mãos afastadas de todos os equipamentos de aquecimento para evitar possíveis ferimentos.
    12. Quando a temperatura do perfusato atingir 35 °C, inicie a ventilação mecânica removendo o clipe de aneurisma da traqueia e iniciando o ventilador dedicado à ventilação ex-vivo (consulte a Tabela de Materiais).
      NOTA: A calibração da pressão é realizada a cada 14 dias usando calibração de dois pontos (0 e 30 cm H2O). A calibração do tubo é realizada a cada utilização de acordo com um protocolo programado, para corrigir fatores externos relacionados à resistência dos tubos e da cânula.
      1. Use o software referenciado para configurações do ventilador e aquisição de dados, pois ele fornece registros contínuos de sinais respiratórios e complacência pulmonar em pontos de tempo dedicados (ver fluxograma, Figura 8), de acordo com um protocolo programado de aumento gradual do volume pulmonar com medição concomitante da pressão das vias aéreas.
      2. A complacência é então calculada automaticamente por uma equação ajustada ao ramo de deflação do loop de volume de pressão (equação de Salazar-Knowles).
      3. Exiba todos os dados ventilatórios, armazene-os em um computador pessoal dedicado e exporte-os para uma planilha. Extraia dados em pontos de tempo selecionados, transfira-os para outra planilha e copie/cole-os no software de análise estatística.
    13. Defina a frequência respiratória e o volume corrente em 7 golpes/min e 3 mL/kg, respectivamente, por 10 min, e depois aumente para 15 golpes/min e 6 mL/kg por 10 min e, finalmente, 30 golpes/min e 6 mL/kg até o final da PPEV. Ajuste a pressão expiratória final positiva (PEEP) em 3 cm H2O durante toda a PPEV (Tabela 2).
    14. Aplique uma manobra de recrutamento a cada 30 minutos de PPEV para evitar atelectasia, ajustando a pressão das vias aéreas em 15 cm H2O por 6 s.
    15. Em 1 h, 2 h, 3 h, 4,5 h e 6 h EVLP, aplique uma insuflação pulmonar gradual até um volume pulmonar total de 10 mL/kg de peso corporal para determinar a complacência pulmonar e a pressão inspiratória de pico (Pmax).
      NOTA: As medições de conformidade são realizadas após uma manobra de recrutamento descrita acima.
    16. Aumente a temperatura do perfusato para atingir 37 °C na cânula PA de entrada após 60 min de EVLP.
    17. Inicie o protocolo de aquecimento ex-vivo após 60 min de EVLP.
    18. Aumente a temperatura do banho-maria até 43 °C para atingir 41.5 °C na cânula PA de entrada (isso leva ~ 5 min), conforme exibido na Figura 2, Figura 3 e Figura 4-5.
    19. Mantenha esta temperatura de 60 min a 90 min EVLP (total de 30 min).
      NOTA: Em nosso trabalho anterior, mostramos que 41,5 °C por 30 min não promoveu lesão térmica ao nível de todo o pulmão29. Não realizamos ensaios específicos de viabilidade celular in vitro para testar a lesão térmica nessas condições.
    20. Após 30 min de aquecimento, adicione gelo ao banho-maria para rapidamente (5 min) ajustar a temperatura na cânula de entrada de volta para 37 °C.
      NOTA: No grupo de controle, a temperatura do perfusato é mantida a 37 ° C durante toda a EVLP, sem aplicação de pré-condicionamento térmico (consulte a Tabela 2). Não incorporamos um grupo de "aquecimento simulado" (por exemplo, ajuste de calor em banho-maria sem aumento de temperatura).
    21. Manter a temperatura do perfusato a 37 °C na cânula PA de entrada até ao final da PPEV.
    22. Colete amostras de solução de perfusato em 1 h, 2 h, 3 h, 4,5 h (1-2 mL em cada ponto de tempo) e 6 h (10 mL) de EVLP, de uma das portas de amostragem conectadas ao circuito (a montante ou a jusante da preparação pulmonar), conforme mostrado na Figura 1-2B. Utilizar amostras imediatamente para análises de gases (medição de pH, PCO2 e PO2, utilizando o cartucho CG4+). Para outras medições bioquímicas, centrifugar as amostras (500 × g, 10 min a 4 °C) e manter o sobrenadante límpido a -80 °C até à utilização.
    23. Após 6 h de EVLP, reaplique o clipe do aneurisma na traqueia (assim que o pulmão estiver totalmente inflado) e clampeie a cânula PA com uma pinça bulldog.
    24. Pesar o bloco coração-pulmão para obter seu peso final.
      NOTA: o aumento de peso durante a PPEV pode ser avaliado como a diferença entre os pesos final e inicial ou pode ser monitorado continuamente durante a PPEV com o módulo de peso descrito acima.
    25. Disseque cuidadosamente os pulmões, separando os lobos individuais.
    26. Preserve o tecido para aplicações a jusante: congele em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C para análises bioquímicas ou fixe em paraformaldeído (PFA) para avaliação histológica. O pulmão esquerdo pode ser mantido e preparado para transplante de pulmão.

4. Estatísticas

  1. Alocar os animais em grupos de tratamento específicos (controle versus pré-condicionamento térmico, n = 5 / grupo para cada endpoint experimental).
    NOTA: Não atribuímos animais aleatoriamente a um ou outro grupo, mas os grupos são alternados a cada dia. O protocolo (calor vs controle) não pode ser realizado de forma cega, devido à necessidade de conhecer rigorosamente a temperatura do perfusato durante os experimentos. Em contraste, as análises biológicas e histológicas são feitas de forma cega, sem identificação do grupo de tratamento alocado.
  2. Analise os dados.
  3. Expresse os resultados como meio ± SEM.
  4. Verificar a distribuição normal dos dados utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnov.
  5. Para experimentos de ponto de tempo, avaliar os efeitos da alocação de tempo e grupo usando ANOVA de duas vias, seguido pelo teste post-hoc de Sidak para efeitos de grupo e correção de Bonferroni para efeitos de tempo, usando 1 h como referência. Considere um valor de p < 0,05 como estatisticamente significativo. Considere a transformação logarítmica dos dados em caso de distribuição não normal antes de aplicar ANOVA.
  6. Para análises histológicas, determinar (de forma cega) o escore de lesão pulmonar de cada amostra, quantificando o edema perivascular em 10 campos/seção.
    1. Use o número relativo de vasos com edema perivascular (A): 0: ausente; 1: leve (<25%); 2: moderado (25-50%); 3: grave (>50%).
    2. Utilizar a espessura do edema perivascular (B), calculada como uma porcentagem dos diâmetros dos vasos internos (0: sem edema; 1: <25%; 2: 25-50%; 3: >50%).
    3. Use a soma de A + B nas 10 seções examinadas para calcular a pontuação31.
    4. Realizar comparações estatísticas utilizando o teste não paramétrico de Mann-Whitney (devido à distribuição não normal dos dados), com significância atribuída a p < 0,05.

Resultados

As variáveis fisiológicas pulmonares são monitoradas continuamente durante todo o procedimento, incluindo pressão da artéria pulmonar (PAP), resistência vascular pulmonar calculada e parâmetros ventilatórios, incluindo complacência pulmonar estática (CPS) e pressão de pico nas vias aéreas (Pmáx). Além disso, o módulo de peso permite a avaliação da formação de edema, fornecendo uma medida indireta do acúmulo de líquido no pulmão. Os benefícios do pré-condicionamento térmico (TP) em relação aos pulmões de controle (Ctrl) incluem uma melhora do SPC (Figura 9A, expressa como a razão entre o SPC em cada ponto de tempo e o valor inicial do SPC, n = 5 / grupo) e uma redução do ganho de peso pulmonar (Figura 9B, n = 5 / grupo) durante a EVLP. Os dados são apresentados como meios ± SEM.

O fluido perfusato pode ser analisado para vários biomarcadores. Por exemplo, o pré-condicionamento térmico está associado a uma liberação significativamente reduzida de von Willebrand (vWF), um biomarcador de células endoteliais no final da EVLP (Figura 9C, n = 5 / grupo, significa ± SEM).

As análises morfológicas do tecido pulmonar obtidas no final da PPEV incluem histologia e imuno-histoquímica. Exemplos de cortes corados com hematoxilina e eosina (H & E) são mostrados na Figura 9D, mostrando redução do dano histológico em pulmões expostos ao pré-condicionamento térmico, expresso como um escore de lesão pulmonar (Figura 9E, n = 5 / grupo). A pontuação foi estabelecida quantificando o edema perivascular em 10 campos/seção (ver etapas 4.6.1 e 4.6.2 do protocolo). A soma A + B nas 10 seções examinadas foi utilizada para calcular o escore31.

As análises moleculares no tecido pulmonar no final da EVLP incluem perfil de expressão de RNA ou proteína. Como exemplo, os níveis de expressão proteica da proteína de choque térmico induzível HSP70 podem ser medidos por ELISA, para mostrar o desenvolvimento da resposta ao choque térmico em pulmões expostos ao pré-condicionamento térmico (Figura 9F, mostrando um experimento de curso de tempo com diferentes durações de EVLP, n = 5 / grupo em cada ponto de tempo). A expressão de HSP70 no grupo TP atingiu o pico após 3h de PPEV, ou seja, 90 min após o término da PPA, e permaneceu estável até o final da PPEV. Os dados são apresentados como meios ± SEM.

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Figura 1: Descrição da plataforma EVLP. (1) Reservatório de parede dupla para perfusato. (2A) Bomba de rolos para circulação de perfusato. (2B) Bomba de rolos para amostragem de perfusato (medições bioquímicas e análises de gases). (3) Banho-maria termostático. (4) Permutador de gás de membrana ligado a um depósito de gás (não mostrado). (5) Sensor de pressão atrial esquerda. (6) Câmara aquecida e selada. (7) Ventilador EVLP. (8) Sonda de temperatura e termômetro. (9) Plataforma de conexão para o bloqueio coração-pulmão, cujos elementos estão detalhados na Figura 2. (Nota: o sensor de pressão PA não está visível). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Plataforma de conexão para o bloqueio coração-pulmão. (1) Cânula de entrada para a artéria pulmonar. (2) Cânula de saída do átrio esquerdo. (3) Conexão para a cânula traqueal. (4) Módulo de peso. (5) Sonda de temperatura projetada internamente firmemente presa à cânula de entrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Transdutores/amplificadores de sinal e caixa conversora analógica/digital. (A). Transdutor/amplificador de pressão da artéria pulmonar. (B). Controlador de fluxo de velocidade da bomba. (C). Transdutor/amplificador de pressão do átrio esquerdo. (D). Módulo de peso pulmonar. (E). Conversor analógico/digital. (F). Computador pessoal para exibição e gravação de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Manutenção da temperatura do perfusato durante a PPEV. (1) Banho-maria termostático. (2) Reservatório de perfusato com recipiente de vidro de parede dupla por onde circula a água do banho-maria termostático. (3) Tubulação da serpentina de aquecimento dentro de um recipiente de água aquecida conectado ao banho-maria termostático. (4) Câmara de órgão com recipiente de vidro de parede dupla para circulação de água quente do banho-maria. (5) Termômetro eletrônico e sonda de temperatura projetada internamente firmemente presa à cânula de entrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Identificação da temperatura ótima para pré-condicionamento térmico. (A) Protocolo EVLP para avaliação de diferentes temperaturas de aquecimento. De 60 min a 90 min de PPEV, a temperatura do perfusato foi aumentada nas temperaturas indicadas. Aos 90 min de PPEV, a temperatura foi retornada a 37 °C por 90 min até o final da PPEV, onde várias medidas fisiológicas e moleculares foram realizadas. (B) Resumo dos resultados dos efeitos das diferentes temperaturas de aquecimento nos parâmetros fisiológicos e moleculares (verde indica efeitos favoráveis; vermelho indica efeitos desfavoráveis; e laranja indica efeitos mistos). A temperatura de aquecimento de 41,5 °C proporcionou os efeitos mais protetores. Abreviaturas: PPEV = perfusão pulmonar ex-vivo ; TP = pré-condicionamento térmico. Essa figura foi modificada de Ojanguren et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 6: Material cirúrgico. (A) Instrumentos para a extração do bloqueio coração-pulmão: Porta-clipe de aneurisma e microclipe de aneurisma (sistema Yasargil), pinça de buldogue, tesoura, microtesoura, afastadores presos a faixas elásticas. (B) Cânulas de PPEV para a artéria pulmonar (AP), o átrio esquerdo (AE) e a traqueia. (C) Sistema de perfusão caseiro para descarga de perfusato frio dos pulmões. A distância entre o nível do PA no animal e o fundo da seringa é fixada em 20 cm. (C) Suporte caseiro. (Não mostrado: microscópio cirúrgico, ventilador e configuração de anestesia). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Fotos representativas do preparo cirúrgico (A) Nó pré-amarrado ao redor da artéria pulmonar. (B) Nó pré-amarrado ao redor da ponta do coração. (C) Grampo Bulldog (círculo azul) na cânula PA e clipe de aneurisma (círculo vermelho) na traqueia. Abreviatura: PA = artéria pulmonar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Fluxograma. Principais etapas para orientar a progressão pelas diferentes etapas do protocolo. O período entre 1 h e 1,5 h de PPEV é ampliado para indicar o protocolo de tratamento de acordo com a atribuição do grupo (controle vs pré-condicionamento térmico). Abreviaturas: IC = isquemia fria; PPEV = perfusão pulmonar ex-vivo ; AP = artéria pulmonar; CPS = complacência pulmonar estática; TP = pré-condicionamento térmico; WI = isquemia quente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9: Resultados representativos dos efeitos do pré-condicionamento térmico em pulmões de ratos danificados. Os pulmões danificados por 1 h de isquemia quente foram perfundidos em um sistema de PPEV por 6 h. De 60 a 90 min de PPEV, um grupo de pulmões foi submetido ao pré-condicionamento térmico a 41,5 °C (grupo TP). Um grupo controle de pulmões foi mantido a 37 °C durante toda a PPEV. (A) Complacência pulmonar estática (CPS), expressa como a razão entre o valor inicial, nos pulmões controle (Ctrl, n = 5) e TP (n = 5). O CPS foi melhor preservado nos pulmões TP. (B) Ganho de peso dos pulmões durante a PPEV nos pulmões controle (n = 5) e TP (n = 5). Houve uma redução significativa na formação de edema no grupo TP. (C) A liberação no perfusato do biomarcador de células endoteliais do fator de von Willebrand foi suprimida no grupo TP (n = 5) em comparação com os controles (n = 5). (D) Aspecto macroscópico e microscópico do pulmão (coloração de hematoxilina-eosina) no final da PPEV nos pulmões controle (n = 5) e TP (n = 5). (E) O escore de lesão pulmonar (para a quantificação do dano histológico) foi menor no grupo TP (n = 5) em comparação com o grupo controle (n = 5). (F) Níveis de proteína da proteína de choque térmico induzível HSP70 em extratos de tecido pulmonar medidos após 1, 2, 3, 4,5 e 6 h EVLP nos grupos controle e TP (n = 5 / grupo em cada ponto de tempo), mostrando resposta acentuada ao choque térmico no grupo TP. A expressão de HSP70 no grupo TP atingiu o pico após 3 h de EVLP (90 min após o final do TP) e permaneceu estável até o final da EVLP.
Todos os gráficos mostram médias ± SEM. Para experimentos de curso de tempo (A-C,F), as comparações estatísticas foram realizadas usando ANOVA de duas vias seguida do teste de Sidak para o efeito de grupo e ajustes de Bonferroni para o efeito de tempo (com tempo 1 h como referência). Para o escore de lesão pulmonar (E), as comparações estatísticas foram feitas por meio do teste de Mann-Whitney. * p < 0,05 (diferenças intergrupos), † p < 0,05 vs 1 h EVLP. Abreviações: Ctrl = controle; PPEV = perfusão pulmonar ex-vivo; HSP70 = proteína de choque térmico 70; CPS = complacência pulmonar estática; TP = pré-condicionamento térmico. Modificado de Parapanov et al.23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Composição das soluções utilizadas no protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Configurações de PPEV para fluxo de perfusão, temperatura de entrada (ao nível da cânula da artéria pulmonar) e ventilação ao longo do tempo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Solução de problemas. Clique aqui para baixar esta tabela.

Materiais complementares. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O desenvolvimento de um modelo de PPEV de rato reprodutível e fisiologicamente relevante representa um avanço significativo na pesquisa de transplante de pulmão. Apesar das diferenças significativas entre as espécies entre o pulmão de rato e o pulmão humano (recentemente revisado em1), notadamente a maior vulnerabilidade do pulmão de rato, o modelo de PPEV de rato oferece intervenções farmacológicas e não farmacológicas com alta reprodutibilidade e baixo custo. A PPEV oferece uma plataforma única para avaliar a função pulmonar do doador, simular cenários clínicos de lesões, como lesão de isquemia-reperfusão, e implementar intervenções terapêuticas antes do transplante 2,39,40. Nesse contexto, o modelo EVLP de rato permite investigações mecanicistas de alto rendimento sob condições rigidamente controladas33. Nos últimos anos, vários grupos têm contribuído para o refinamento das técnicas de PPEV em ratos. Nelson et al. forneceram orientação processual fundamental39. Wang et al. propuseram uma configuração modular de EVLP adaptada para imitar a simulação de doação após morte circulatória (DCD)41. Gouchoe et al. exploraram novas formulações de perfusato usando transportadores artificiaisde oxigênio 42 e Oliveira et al. focaram na inflamação após longa preservação de isquemia fria38. Com base nesse conhecimento existente, nosso protocolo atual introduz uma nova estratégia não farmacológica, ou seja, o pré-condicionamento térmico, projetado para ativar mecanismos de proteção endógena para o recondicionamento de enxertos de pulmão de rato danificados por isquemia quente. Nosso modelo de pulmão danificado, que simula condições de DCD, foi realizado em ratos Sprague-Dawley machos33.

O estabelecimento desse protocolo exigiu atenção cuidadosa a várias etapas tecnicamente exigentes que influenciam criticamente a viabilidade e a reprodutibilidade pulmonar. A recuperação pulmonar deve ser realizada com manipulação mínima para evitar lesão parenquimatosa. A profundidade da anestesia é fundamental para evitar congestão pulmonar induzida por respiração ofegante e exsanguinação deficiente. Evitar rigorosamente bolhas de ar durante a canulação e o priming do circuito é essencial, pois mesmo pequenos êmbolos podem precipitar edema43. Conselhos específicos de solução de problemas para desafios comuns de protocolo são indicados na Tabela 3. Embora as configurações de ventilação e perfusão possam ser ajustadas dentro de limites seguros, estratégias de proteção pulmonar devem ser mantidas para prevenir barotrauma ou volutrauma44. O fluxo de perfusato pode ser aumentado em até 20% do débito cardíaco estimado em ratos, em comparação com 40% em modelos maiores, como porcos e humanos, mas deve ser cuidadosamente titulado45. Em nosso protocolo, utilizamos menor fluxo de perfusato (7,5% do débito cardíaco teórico), para evitar picos de pressão da artéria pulmonar e o desenvolvimento de edema pulmonar precoce em pulmões lesados isquêmicos quentes, permitindo assim um preparo prolongado. Embora alguns laboratórios administrem corticosteróides durante a perfusão para reduzir a inflamação46,47, seus conhecidos efeitos anti-inflamatórios podem confundir alguns resultados experimentais e, portanto, não os usamos em nosso modelo para preservar a capacidade de estudar lesões pulmonares e processos inflamatórios.

O pré-condicionamento térmico requer um controle preciso da temperatura. Como o calor é perdido ao longo da tubulação do reservatório ao pulmão, a temperatura do perfusato deve ser monitorada na cânula de entrada e a configuração do banho-maria mantida ligeiramente acima da temperatura de entrada desejada para atingir a meta dentro da preparação. Os sensores são calibrados anualmente usando um termômetro digital PCE-T 1200 multicanal para garantir a precisão.

Nossas descobertas também abordam as principais limitações da terapia de calor convencional. A aplicação sistêmica de calor é limitada pela regulação imprecisa da temperatura, efeitos colaterais sistêmicos e falta de especificidade do órgão. A EVLP contorna essas barreiras, fornecendo um ambiente controlado e localizado, permitindo a entrega precisa de estresse térmico diretamente ao tecido pulmonar29. Este método permite a modulação rigorosa da magnitude e duração do estresse térmico, dois parâmetros críticos para otimizar a resposta celular protetora sem desencadear lesão térmica. Além disso, nossa plataforma EVLP permite várias avaliações downstream, incluindo análises moleculares, histológicas e funcionais. É importante ressaltar que os pulmões submetidos à PPEV também podem ser transplantados, permitindo a avaliação direta da função do enxerto pós-PPEV in vivo29. Assim, o modelo suporta a avaliação tanto no nível de órgão isolado quanto no pós-transplante. Nesse contexto, a integração do pré-condicionamento térmico, uma exposição transitória a 41,5 °C durante a PPEV, surge como uma intervenção promissora. Ao estimular uma resposta ao choque térmico e outras vias adaptativas ao estresse, esse método aumenta a resiliência do enxerto sem fatores de confusão farmacológicos. Nossos resultados mostram que o pré-condicionamento térmico melhora a fisiologia do enxerto pulmonar, reduz a formação de edema e a liberação de mediadores inflamatórios e biomarcadores de lesão celular (como exemplificado pelos níveis reduzidos do fator de von Willebrand na perfusato de EVLP de pulmões tratados termicamente). As análises morfológicas reforçam ainda mais o efeito protetor dessa intervenção, com redução do dano estrutural e preservação da integridade do tecido. A maioria dos dados experimentais de EVLP em ratos foi gerada em machos, limitando a percepção específica do sexo; Dois estudos relataram desfechos divergentes em mulheres - redução da lesão de reperfusão em um e aumento da inflamação em outro48,49. Embora nosso estudo tenha usado homens, observamos anteriormente benefícios de PT em um modelo de PPEV porcino usando mulheres29, sugerindo relevância entre os sexos.

Restrições e desvantagens importantes do nosso método precisam ser enfatizadas. Primeiro, para garantir que os pulmões sejam perfundidos com a temperatura real desejada, esta última deve ser monitorada na cânula de entrada aplicando firmemente o sensor de temperatura. Em segundo lugar, é obrigatório que as mudanças de temperatura sejam obtidas em períodos de tempo muito curtos, o que requer o uso de um banho-maria termal de resposta rápida para aquecimento e a adição de gelo ao banho-maria para resfriamento rápido. Em terceiro lugar, a resposta fisiológica ao estresse térmico pode diferir de acordo com a espécie usada e é altamente dependente do nível e da duração do estresse. Portanto, é obrigatório realizar experimentos piloto usando várias temperaturas de aquecimento por várias durações, caso este protocolo seja aplicado a diferentes espécies animais ou pulmões humanos e avaliar parâmetros específicos relativos aos efeitos protetores e potenciais prejudiciais do estresse térmico aplicado. Em quarto lugar, devido à expressão cinética de genes responsivos ao calor, os efeitos do pré-condicionamento térmico dependem do tempo de recuperação após a aplicação do estresse térmico. Experimentos usando diferentes durações de estresse pós-calor (ou seja, com diferentes durações de EVLP) são necessários para avaliar esses efeitos dependentes do tempo da aplicação de calor, conforme mostrado em nossa recente publicação sobre este tópico30.

Ao todo, nosso estudo atual estabelece um protocolo detalhado e reprodutível de EVLP em ratos que incorpora o pré-condicionamento térmico como uma estratégia viável para melhorar a qualidade pulmonar do doador marginal. O protocolo é escalável e adaptável a sistemas EVLP animais ou humanos maiores, reforçando sua relevância translacional. Ao fornecer rigor metodológico e fidelidade fisiológica, este modelo abre novos caminhos para explorar intervenções não farmacológicas destinadas a reduzir a lesão de isquemia-reperfusão e melhorar os resultados do enxerto pulmonar após o transplante.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Apoiado por uma bolsa da Swiss National Science Foundation (Nr 310030_212252) para TK e LL).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento geral
Clipe de aneurisma  B. BraunFE762K
Sensor térmico de esferas de ar/superfícieTES Electrical Electronic Corp/Distrelec AGTP01/176-67-162
Retratores RombosFerramentas Científicas Finas18200-09
Serafinas BulldogFerramenta de Ciência Fina18051-50
Compressas de Olhares Promedical25404
Kit de conexão para anestesiaHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3076
CotonetesAplicação SA6001109
Tesoura DissecadoraB. Braun BC165R
Máscara facial para ratoTem SegaPFM0006
Heparina 5000 U/mLB. Braun3522430
Câmara de indução para anestesiaHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard50-0116
Pinça Dissecante de Íris Totalmente CurvaEsculapa  OC022R
IsofluranProvet AG2222
Vapor de isofluran 19,3Rothacher MedicalCV30-310 O2/Aéreo
Cartucho iSTAT4Axon lab AG03P85-25
Ketasol 100 (100 mg/mL)Dr. E. Graeub AGQN01AX03
Tesoura lister B. BraunBC876R
Micro Tesoura, Curva Romba/RombaEsculape FM011R
Micro-Adson ForcepsFerramenta de Ciência Fina11018-12
Hemostatos Micro-MosquitosFerramenta de Ciência Fina13011-12
Microscópio OPMI MDUZeiss267067
NaCl 0,9 % B. Braun534534
Agulha 23 G x 25 mmBD Microlance 4300800
Agulha 25 G x 25 mmBD Microlance 3300400
Perfadex (solução de preservação)Perfusão AB de Xvivo19811
Seringa de perfusão 60 ml luer lockBD plastik300865
RasorEsculape GT-421
EscalaMettler ToledoPB602-L
Sutura de seda 4-0B. BraunF1134035
Sutura de seda 5-0B. BraunF1134027
Steen (solução de perfusão)Perfusão AB de Xvivo19004
Luvas cirúrgicasAnsell93-843
Seringa 1 mL, Omnifix-FB. Braun9161406V
FitaLeukofix02136-00
TermômetroTES Electrical Electronic Corp1303
Tubos contendo Formol Biosystems Switzerland AG87-0960-00-10113
Ventilador (EVLP) (Ajuste o volume de maré de acordo com o protocolo EVLP)FlexiventFX3
Ventilador (aquisição pulmonar) & nbsp; (Ajuste o volume de maré como: 7,69*(peso corporal (kg))^1,04)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard683
Afastador WEITLANERB. BraunBV073R
Xylasol (1 mg/mL)Dr. E. Graeub AGQN05CM92
Yasargil applierB. BraunFE502T
IPL-2 forte
Adaptador para pressão positivaHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3635
AME 14 - SC0062 tubo de bomba (tygon) com colar de 3 paradas, pacote de 12Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0126
AME 24 - SC0072 tubo de bomba (tygon) com coleira de 3 paradas, pacote de 12Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0155
Unidade básica para o pulmão isolado perfundido tamanho 2 (IPL-2) tipo 829/2Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-2266
Kit de conexão para oxigenador de fibra D150Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3765
Módulo de Equilíbrio de Edema EBM (EBM) com SensorHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-4626
Oxigenador de fibra tipo D150, pacote de 5Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3762
Suporte para clampagem da cânula aórtica ou traqueal para OP-tables tamanho 5Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3855
Suporte para oxigenadoresHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3061
Sistema de Medição de Peso HSEHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-4604
Software básico de aquisição de dados HSE-BDAS para Windows 2000, XP, Windows 7Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-1712
Hardware de aquisição de dados HSE-USB, USB Box independente para Windows 10 ou 11Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3330
Bomba de roletes ISM 827/230 V reglo analógica, 4 canais, 0,003-35 ml/min (2 x)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0114
Cânula do átrio esquerdo (DD 4,0 mm)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0712
Mini eletrodo de oxigênio flow-thru com conexões de 1/16" (Opcional)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-4189
Kit de montagem para oxigenador de fibra tipo D150 em suportesHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3759
Torneira de registro unidirecional tipo 9500 (uma para PA, outra para LA)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0097
OPPM plugsys módulo de pressão parcial de oxigênio tipo 697  (Opcional)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0210
Tipo de caixa básica do sistema Plugsys 603Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0045
pO2 solução zero 20 pacotes de 20 ml  (Opcional)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3812
Transdutor de pressão P75 tipo 379/HSE, faixa de -75 a + 75 mm Hg (PA, LA)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0020
Cânula da artéria pulmonar (OD 2,0 mm, Diâmetro da Cabeça, 2,5 mm)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0711
Reservatório (com jaqueta) para solução tampãoHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3496
Controlador servo SCP plugsys para perfusão tipo 704Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-2806
Gabinete de blindagem para um sensor pO2 ou pCO2 mini sensor  (Opcional)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-4196
Placa de montagem pequena para um único sensor O2 ou CO2   (Opcional)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3000
Módulo amplificador transdutor plugsys TAM-A tipo 705/1 (um para PA, outro para LA)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0065
Circulador termostático E 103 (3 L)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0125
Torneira de registro de três vias tipo 9560 R (uma para PA, outra para LA)Hugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-0096
Conjunto de tubos para reservatório de buffer com macacos com válvulas de corte na linha de fluidoHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3456
Cânula de ventilação (traqueia) DE 2,0 mm, L 14 mmHugo Sachs Elektronik - Aparato de Harvard73-3384
Softwares de computador
Software básico de aquisição de dados HSE-BDAS para Windows 2000, XP, Windows 7Hugo Sachs Elektronik - Aparato de HarvardV2.0
ExcelMicrosoft2502, Microsoft 365
FlexiwareScireq8
GraphPad PrismaGraphPad Software inc.10.0.1
Ratos Sprague-Dawley  Laboratórios Charles River (Saint-Germain-Nuelles, França) & nbsp;

Referências

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