Este protocolo padroniza a análise SDS-PAGE para perfilamento personalizado de corona proteica em nanopartículas, permitindo a detecção reprodutível, escalável e de baixo custo de assinaturas específicas do câncer. Projetado para o diagnóstico precoce do adenocarcinoma ductal pancreático, oferece uma alternativa prática e alinhada ao REASSURED aos métodos proteômicos complexos tanto em pesquisas quanto em ambientes clínicos.
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Artigo de método
Fluxo de Trabalho Padronizado SDS-PAGE para Perfil Personalizado de Corona de Proteínas na Detecção Precoce de Câncer
Neste artigo
Resumo
Resumo
A formação de uma coroa proteica personalizada (PC) em nanopartículas (NPs) após exposição a fluidos biológicos emergiu como uma estratégia promissora e minimamente invasiva para a detecção precoce do câncer. Este estudo introduz um protocolo padronizado para perfilar a coroa proteica usando eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), otimizado para garantir robustez, reprodutibilidade e automação. O método foi rigorosamente validado em diversas plataformas de nanopartículas (NP), fontes de plasma e condições experimentais, demonstrando perfis consistentemente reproduzíveis com variabilidade mínima dependente do operador. Em comparação com as técnicas convencionais de proteômica, essa abordagem oferece uma solução mais rápida e econômica, que atende aos critérios REASSURED da Organização Mundial da Saúde para diagnóstico. Quando aplicado ao adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), uma malignidade altamente agressiva com biomarcadores precoces limitados, esse fluxo de trabalho alcançou precisão de classificação de até 90%, mesmo em pacientes em estágio inicial. Essa plataforma padronizada representa um avanço significativo rumo a ferramentas diagnósticas escaláveis, clinicamente traduíveis e acessíveis para rastreamento do câncer.
Introdução
Corona de proteína de nanopartículas (NP-PC)
A caracterização do PC que se forma na superfície dos NPs após sua exposição a fluidos biológicos emergiu como uma estratégia poderosa para diagnóstico de doenças e medicinapersonalizada 1. Essa camada de proteínas adsorvidas, dinâmica e específica de doença em sua composição, transforma a identidade sintética dos NPs e impulsiona suas interaçõesbiológicas 2. A composição do PC não é aleatória, mas depende fortemente tanto das propriedades fisicoquímicas dos NPs quanto do ambiente biológico no qual ....
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Protocolo
Este protocolo fornece um fluxo de trabalho detalhado e padronizado para a preparação, incubação com plasma humano (HP), isolamento e análise do PC formado em vários tipos de NPs. A Figura 2 é uma representação gráfica de todo o protocolo, descrevendo os passos experimentais sequenciais desde a síntese de NP até a análise multivariada SDS-PAGE dos perfis proteicos. Importante destacar que a metodologia foi padronizada por nosso grupo, como demonstrado em trabalhosanteriores 18,26, garantindo reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados. Os re....
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Resultados
Um dos principais desafios na padronização dos experimentos de PC está em minimizar a variabilidade técnica e dependente do operador, como já destacado neste estudo26. Ainda persistem questões em aberto sobre a influência de variáveis experimentais como viés do operador e o impacto de ferramentas automatizadas nareprodutibilidade 18,28.
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Discussão
Versatilidade e reprodutibilidade dos métodos entre tipos de NP
O protocolo apresentado aqui fornece um fluxo de trabalho padronizado e reprodutível para isolar e caracterizar o PC formado em NP após a incubação com HP. Como demonstrado em estudos anteriores e atuais, o método possibilita a geração de impressões digitais moleculares baseadas em SDS-PAGE que capturam características biologicamente e diagnosticamente rele.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.
Agradecimentos
A pesquisa foi parcialmente financiada pelo MUR, Plano Nacional de Investimentos Complementares ao NRRP, financiado pela União Europeia-NextGenerationEU, Projeto "D3 4 HEALTH-Digital Driven Diagnostics, prognostics and therapeutics for sustainable Health care". PNC0000001, Spoke 3 Linea tematica 2, missione 4, componente 2 CUP: B53C22006120001. Esse trabalho também foi apoiado pela Fundação AIRC no âmbito do projeto IG 2020-ID. 24521, P.I. Pozzi Daniela.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| TUBO de Ligação de Proteína de 1,5ML | eppendorf | 22431081 | |
| 10x Tris/Glicina/SDS | Biorad | 1610732 | |
| Centrífuga | Labortechnik | Z 216 MK Hermle | Usado a 18.620 RCF por 20 minutos em 4 graus; C |
| Sistema de imagem ChemiDoc | Bio-Rad | 12003153 | Usado para aquisição de imagens em gel |
| Clorofórmio | Sigma Aldrich | C2432-1L | Solvente para DOTAP |
| Corning 1-200 & micro; Pontas de pipeta L Universal Fit Bulk Packed | Corning | 4845 | |
| Criterion TGX Géis pré-moldados Sem Manchas | Biorad | 5678095 | |
| Água Destilada 6 x 1L | Thermo Fisher | 15230001 | |
| DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano) | Lípidos polares Avanti | 890890P-200mg | Usado para preparar lipossomos catiônicos; dissolvido no clorofórmio, evaporado, hidratado e extrudado |
| Fonte de Alimentação Enduro 300V | Labnet | E0303-230V | |
| Leitor de Microplacas GloMax Discover | Promega | GM3000 | |
| Nanopartículas de ouro (estabilizadas com citrato) | Sigma-Aldrich | 742031-25ML | Usado como nanomaterial; Usado sem purificação adicional |
| Gel de poliacrilamida gradiente (4– 20% TGX) | Bio-Rad | 5678095 | Usado para SDS e ndash; PAGE |
| Instrumento de Subvenção Termoshaker HC24N (24 microtubos de 1,5mL) | Fisher científica | PHMT-PSC24N | |
| Solução de óxido de grafeno (GO) | Grafenea | GO-4-1000 | Usado como nanomaterial; diluído para 0,25 mg/mL e sonicado |
| Plasma Humano (HP) | Sigma-Aldrich | P9523-5ML | Usado para incubação de nanopartículas |
| ImageLab Software | Bio-Rad. Versão 6.1.0.07 | / | Usado para exportar imagens de gel como arquivos tiff |
| Buffer de carregamento de Laemmli 2x | Biorad | 1610737 | Usado para resuspensão de pellets |
| MATLAB | MathWorks. Versão R2022a | / | Usado para processamento de imagens, análise de dados e computação de perfis |
| Mini-extrusor | Lípidos polares Avanti | 610020 | Usado para preparação de lipossomos |
| Agente Redutor de Amostras NuPAGE (10X) | Termo Científica | NP004 | |
| Tamponador de Soro Fosfatado | Corning | 21-031-cm | Usado para amostras DOTAP-HP |
| Kit de Ensaio de Proteína Pierce BCA, 1 Kit (1 L) | ThermoFisher | 23225 | |
| Pontas de pipeta 0,5-10ul de claridade | Axygen | T-300-STK | |
| PIPETMAN L P10L, 0,5-10 & micro; L, Ejetor de Metal | Gilson | FA10002M | |
| PIPETMAN P20, 2-20 & micro; L, Ejetor de Metal | Gilson | F144056M | |
| PIPETMAN P200, 20-200 & micro; L, Ejetor de Metal | Gilson | F144058M | |
| Sistema automatizado de pipetagem PIPETMAX | Gilson | GSYS0021 | Usado para manuseio automatizado de amostras |
| Filtro de policarbonato (0.1 & micro; m) | Lípidos polares Avanti | 610005-1EA | Usado para extrusão de lipossomos |
| Padrões de Proteína Precision Plus All Blue Prestained | Biorad | 1610373 | |
| Padrões Precision Plus Protein Uncolored & nbsp; | Biorad | 1610363EDU | |
| Sonicador de célula vibra VC505 | Sonics and Materials inc. | VC505 | |
| ZetaSizer | Malvern | ZS90 | Usado para medições de espalhamento dinâmico da luz (DLS) e microeletroforese (ME) |
Referências
- Cai, R., Chen, C. The crown and the scepter: Roles of the protein corona in nanomedicine. Adv Mater. 31 (45), 1805740(2019).
- Caputo, D., et al. Nanotechnology meets ....
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Reimpressões e permissões
