Artigo de método

Fluxo de Trabalho Padronizado SDS-PAGE para Perfil Personalizado de Corona de Proteínas na Detecção Precoce de Câncer

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DOI:

10.3791/69090

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19 de dezembro de 2025

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1NanoDelivery Lab, Department of Molecular Medicine, Sapienza University of Rome

Neste artigo

Resumo

Este protocolo padroniza a análise SDS-PAGE para perfilamento personalizado de corona proteica em nanopartículas, permitindo a detecção reprodutível, escalável e de baixo custo de assinaturas específicas do câncer. Projetado para o diagnóstico precoce do adenocarcinoma ductal pancreático, oferece uma alternativa prática e alinhada ao REASSURED aos métodos proteômicos complexos tanto em pesquisas quanto em ambientes clínicos.

Resumo

A formação de uma coroa proteica personalizada (PC) em nanopartículas (NPs) após exposição a fluidos biológicos emergiu como uma estratégia promissora e minimamente invasiva para a detecção precoce do câncer. Este estudo introduz um protocolo padronizado para perfilar a coroa proteica usando eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), otimizado para garantir robustez, reprodutibilidade e automação. O método foi rigorosamente validado em diversas plataformas de nanopartículas (NP), fontes de plasma e condições experimentais, demonstrando perfis consistentemente reproduzíveis com variabilidade mínima dependente do operador. Em comparação com as técnicas convencionais de proteômica, essa abordagem oferece uma solução mais rápida e econômica, que atende aos critérios REASSURED da Organização Mundial da Saúde para diagnóstico. Quando aplicado ao adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), uma malignidade altamente agressiva com biomarcadores precoces limitados, esse fluxo de trabalho alcançou precisão de classificação de até 90%, mesmo em pacientes em estágio inicial. Essa plataforma padronizada representa um avanço significativo rumo a ferramentas diagnósticas escaláveis, clinicamente traduíveis e acessíveis para rastreamento do câncer.

Introdução

Corona de proteína de nanopartículas (NP-PC)

A caracterização do PC que se forma na superfície dos NPs após sua exposição a fluidos biológicos emergiu como uma estratégia poderosa para diagnóstico de doenças e medicinapersonalizada 1. Essa camada de proteínas adsorvidas, dinâmica e específica de doença em sua composição, transforma a identidade sintética dos NPs e impulsiona suas interaçõesbiológicas 2. A composição do PC não é aleatória, mas depende fortemente tanto das propriedades fisicoquímicas dos NPs quanto do ambiente biológico no qual sãointroduzidos 3. Fatores como tamanho, forma, carga superficial e composição do NP podem influenciar significativamente a afinidade, cinética e arranjo estrutural das proteínas adsorvidas. Da mesma forma, o fluido biológico, sua fonte, complexidade e estado da doença desempenham um papel fundamental na determinação da composição final dacorona 4,5,6.

A natureza dinâmica da coroa complica ainda mais sua análise, à medida que sua estrutura evolui ao longo do tempo de uma camada externa macia e frouxamente unida para um núcleo interno mais estável e fortementeadsorvido 7,8. Essa arquitetura em evolução, resultante de eventos competitivos de adsorção proteica, requer abordagens padronizadas e resolvidas no tempo para ser caracterizada de formasignificativa 9. Apesar dessa complexidade, hoje é amplamente reconhecido que o PC não é apenas um artefato, mas uma camada biologicamente informativa capaz de capturar alterações sistêmicas da doença de maneira não invasiva. O objetivo do método descrito neste artigo é padronizar o uso do SDS-PAGE para o perfil robusto, reproduzível e acessível do PC personalizado, especialmente para a detecção precoce do câncer por meio de biópsiaslíquidas 10.

O PC personalizado e sua relevância na detecção do câncer

A base científica desse método está no conceito de PC personalizado. Após a incubação com plasma do paciente, os NPs adsorvem uma impressão digital única de proteínas que reflete o estado fisiológico ou patológico doindivíduo 11,12. Esse conceito foi comprovado por estudos que mostraram alterações significativas na composição do PC na presença de doenças, incluindo adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), câncer depulmão 13, meningioma14 e glioblastoma multiforme15. Especificamente, no PDAC, PCs derivados do plasma do paciente diferem substancialmente dos de doadores saudáveis. Essas diferenças foram exploradas em modelos de classificadores que alcançam até 90% de precisão diagnóstica. Assim, o PC serve como um concentrador em nanoescala de sinais específicos dedoença 16.

Trabalhos recentes demonstraram que PCs de pacientes com câncer são enriquecidos em proteínas envolvidas na inflamação, coagulação, ativação do complemento e transporte de vesículas extracelulares, vias biológicas conhecidas por serem desreguladas namalignidade 17. Esses padrões proteicos são altamente reprodutíveis dentro de classes individuais de pacientes, mas claramente distintos entre diferentes estados de doença, sugerindo que a corona pode funcionar não apenas como um sensor geral da doença, mas também como um classificador específico da doença. No contexto do PDAC, uma das malignidades mais mortais e insidiosas, nosso grupo foi pioneiro em testes sanguíneos NP-habilitados (NEB) baseados na caracterizaçãoPC 18,19,20. Essa abordagem minimamente invasiva aproveita a capacidade dos NPs de enriquecer seletivamente proteínas plasmáticas de baixa abundância e alteradas pela doença, tornando-as detectáveis por meio de separação eletroforética simples e de laboratório.

Vantagens em relação às técnicas proteômicas convencionais

A justificativa para o desenvolvimento dessa abordagem decorre das limitações das técnicas convencionais de proteômica, como a espectrometria de massa (EM), que, embora ofereçam cobertura profunda de proteoma, são caras, demoradas e pouco adequadas para triagem de alto rendimento ou diagnósticos no pontode atendimento 21. Outro desafio chave está na complexidade intrínseca da EM, onde variações na preparação da amostra, calibração do instrumento, parâmetros de aquisição e fluxos de trabalho de análise de dados contribuem para diferenças significativas entre laboratórios na composição relatada do PC22. Em contraste, a análise SDS-PAGE do PC oferece um meio rápido e econômico de capturar padrões proteômicos relacionados a doenças. Crucialmente, a leitura do SDS-PAGE não depende da identificação absoluta de biomarcadores individuais, mas sim da detecção de mudanças sistemáticas no perfil global de proteínas, que podem ser analisadas por densitometria e estatísticas multivariadas.

Ao contrário dos ensaios baseados em anticorpos, que são limitados a alvos conhecidos e propensos à reatividade cruzada, o SDS-PAGE oferece uma visão imparcial do cenário proteico, preservando a integridade da amostra original e permitindo a integração posterior com plataformas complementares como LC-MS/MS para identificação de proteínas. Além disso, como o SDS-PAGE não exige etapas de fracionamento ou depleção da amostra, ele é especialmente adequado para análise de amostras biológicas de baixo volume, uma característica essencial para aplicações que envolvem diagnóstico precoce ou triagem de populaçõesfrágeis 23. Por todas essas razões, esse protocolo é consistente com vários dos critérios ASSEGURADOS da OMS (Conectividade em tempo real, Facilidade de coleta de amostras, Acessível, Sensível, Específico, Fácil de Usar, Robusto, Sem Equipamentos e Entregável), tornando-o uma ferramenta prática para diagnósticosescaláveis 24. Com base nessas evidências, foi hipotetizado que NPs incubados com plasma do paciente adsorvem um PC reproduzível e específico para doença, que pode ser sistematicamente perfilado usando SDS-PAGE. Sugerimos ainda que a análise eletroforética padronizada dessas coroas personalizadas possa distinguir pacientes com câncer de indivíduos saudáveis, fornecendo assim uma ferramenta diagnóstica robusta e clinicamente traduzível.

Fluxo de trabalho e aplicabilidade clínica

O protocolo de perfil de coroa baseado em SDS-PAGE sistematiza cada etapa: desde a preparação e incubação de NPs com plasma diluído, até o isolamento de corona, eletroforese em gel e análise densitométrica quantitativa (Figura 1). Parâmetros-chave como tempo de incubação, diluição plasmática e tipo NP25 são finamente ajustados para garantir captura ideal de proteínas e resolução da imagem em gel. O protocolo também aborda questões práticas como taxa de transferência de amostras, estabilidade de armazenamento e consistênciabatch a batch 26. Além disso, por ser uma técnica não destrutiva, o SDS-PAGE pode ser combinado de forma fluida com abordagens proteômicas complementares como a MS para identificar a composição molecular das bandas proteicasindividuais 15. O fluxo de trabalho foi otimizado para alta reprodutibilidade entre operadores, incluindo compatibilidade com plataformas de pipetagem manual e automatizada, e é robusto em diferentes químicas de NP e concentrações de plasma. Essas características garantem que o método possa ser aplicado em diversos ambientes laboratoriais, tornando-o adequado tanto para centros de diagnóstico centralizados quanto para laboratórios de pesquisa descentralizados. Assim, essa técnica é particularmente adequada para pesquisadores e clínicos envolvidos em diagnósticos precoces, descoberta de biomarcadores e nanomedicina translacional. É aplicável a uma ampla gama de patologias e adaptável a diversos fluidos biológicos além do plasma, incluindo saliva ou urina. A flexibilidade e robustez desse protocolo o tornam um forte candidato para integração em pipelines de validação clínica, estudos de triagem em grande escala e plataformas de ponto de atendimento.

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Protocolo

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho detalhado e padronizado para a preparação, incubação com plasma humano (HP), isolamento e análise do PC formado em vários tipos de NPs. A Figura 2 é uma representação gráfica de todo o protocolo, descrevendo os passos experimentais sequenciais desde a síntese de NP até a análise multivariada SDS-PAGE dos perfis proteicos. Importante destacar que a metodologia foi padronizada por nosso grupo, como demonstrado em trabalhosanteriores 18,26, garantindo reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação e caracterização de NPs

  1. Nanofolhas GO
    1. Dilua uma solução de estoque de 4 mg/mL em água ultrapura até a concentração desejada. Sonice por 2 minutos com 28% de amplitude (pulso: 0,8/0,6 s) para garantir a dispersão adequada.
    2. Quantifique a concentração usando espectroscopia UV-Vis
    3. Mede o tamanho hidrodinâmico e o potencial zeta por espalhamento dinâmico da luz (DLS) usando um laser He-Ne de 633 nm. Prepare as amostras por diluição em água ultrapura com base nos limites de detecção de cuvetas (por exemplo, diluição 1:100 para cuvetas de 1 mL). Média de registro ± desvio padrão (SD) de três réplicas.
  2. Parceiras Nacionais de Ouro
    1. Use NPs de ouro estabilizados em citrato de 100 nm (concentração a partir do estoque: 3,8E+9 partículas/mL) sem modificações adicionais.
    2. Mede o tamanho hidrodinâmico e o potencial zeta por espalhamento dinâmico da luz (DLS) usando um laser He-Ne de 633 nm. Prepare as amostras por diluição em água ultrapura com base nos limites de detecção de cuvetas (por exemplo, diluição 1:100 para cuvetas de 1 mL). Média de registro ± SD de três réplicas.
  3. Lipossomos DOTAP
    1. Dissolva o pó de 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP) em clorofórmio dentro de uma capela química certificada, usando o EPI adequado (jaleco, luvas, óculos). Evapore sob vácuo por 2 horas, ressuspenda o filme lipídico com água ultrapura para atingir a concentração final de 1 mg/mL e hidrate durante a noite a 4 °C. Por fim, extruda a solução de lipossomo 20 vezes através de um filtro de policarbonato de 0,1 μm.
    2. Mede o tamanho hidrodinâmico e o potencial zeta por espalhamento dinâmico da luz (DLS) usando um laser He-Ne de 633 nm. Prepare as amostras por diluição em água ultrapura com base nos limites de detecção de cuvetas (por exemplo, diluição 1:100 para cuvetas de 1 mL). Média de registro ± SD de três réplicas.
      ATENÇÃO: Manuseie o clorofórmio em uma exaustão com EPI completo. Descarte resíduos de solventes orgânicos de acordo com os procedimentos institucionais de segurança química.
      NOTA: Para GO com distribuições de tamanho centradas aproximadamente em 300 nm, sonicar por 10 minutos a 125 W, centrifugar a 7.700 x g por 30 minutos a 4 °C, coletar sobrenadante, centrifugar novamente a 18.620 x g por 30 minutos e ressuspender o pellet. Para GO com distribuições de tamanho centradas aproximadamente em 100 nm, sonice 3 × 180 min a 4 °C, centrifugando a 10.000 x g por 30 min, a 4 °C após cada rodada e coletando o supernadante final.

2. Preparação de plasma humano

  1. Plasma humano comercial (HP)
    1. Diluir plasma liofilizado comercial com água ultrapura conforme necessário.
    2. Centrifuge o plasma reconstituído a 18620 x g por 15 minutos a 4 °C, recolha o sobrenadante e armazene a -80 °C até o uso.
  2. HP derivada do paciente
    1. Centrifuge amostras de sangue a 1216 x g por 10 minutos a 4 °C e colete o sobrenadante para separação do plasma.
    2. Amostras de plasma de 450 μL em tubos de baixa ligação proteica de 0,5 mL e armazenados a -80 °C até o uso.
      NOTA: Todas as amostras de plasma humano são coletadas de acordo com as diretrizes éticas institucionais, e o consentimento informado foi obtido de todos os participantes.
      ATENÇÃO: Plasma humano é bio-perigoso. Controle dentro de um armário de biossegurança (BSC) usando luvas, jaleco e óculos de proteção. Descarte todos os materiais contendo plasma conforme as regulamentações institucionais de biossegurança e descarte de resíduos.

3. Formação do PC

  1. Manuseio manual de líquidos
    1. Determine a razão ideal NP:plasma quantificando a concentração de proteínas por meio do ensaio de Ácido Bicincinínico (BCA) para ajustar a diluição plasmática.
    2. Adicione 100 μL de suspensão NP a 100 μL de plasma para atingir as concentrações desejadas do plasma.
    3. Incube a 37 °C por 1 hora.
      NOTA: Para o ensaio de BCA, misture os Reagentes A e B (50:1), prepare diluições padrão de BSA, adicione 10-25 μL de amostra/reagente padrão + 200 μL, incube por 30 min a 37 °C e meça a absorção a 562 nm. As concentrações plasmáticas são tipicamente ajustadas entre 0,5% e 50% v/v em relação ao volume NP, dependendo do tipo de NP. Para GO, use concentrações menores (de 0,5% a 5% recomendada); para NPs DOTAP/ouro, use concentrações mais altas (até 50%). Use tubos de proteína de 1,5 mL de baixa ligação.
  2. Protocolo automatizado de incubação
    1. Carregue o protocolo de software de manuseio de líquidos na plataforma automatizada de pipetagem (20 μL + 200 μL cabeças)
    2. Dispense 100 μL de cada tipo de NP em tubos de baixa ligação de 1,5 mL.
    3. Adicione plasma reconstituído preparado como em 2.1 e 2.2, de acordo com a seguinte fórmula:
      onde VNP é o volume de suspensão NP. Para 100 μL de NP:
      figure-protocol-1
      5%: 5,3 μL HP
      20%: 25 μL de HP
      50%: 100 μL HP
    4. Adicione água ultrapura para atingir 200 μL:
      5%: 94,7 μL
      20%: 75 μL
      50%: nenhum
    5. Samples de mixagem:
      5%: ciclos de 15 μL
      20%: ciclos de 50 μL
      50%: ciclos de 100 μL 3,2,6. Incubar a 37 °C por 1 hora
      NOTA: A Figura Suplementar 1 ilustra a interface gráfica da configuração automatizada usada para preparar misturas NP-HP em três concentrações finais de plasma (5%, 20% e 50% v/v), cada uma em triplicado. O layout do deck inclui racks de ponta, um reservatório de resíduos e um rack de tubos de baixa ligação 3 × 4 contendo suspensões NP (GO, nanosferas de ouro e lipossomo DOTAP) (NP), HP e água ultrapura (H2O). Use tubos de baixa ligação proteica.

4. Análise PC por SDS-PAGE

  1. Isolamento de PC
    1. Centrifuge as amostras NP-HP a 18.620 x g, 4 °C, por 15 minutos. Um pellet visível deve estar presente no fundo do tubo. Descarte cuidadosamente o sobrenadante, que deve parecer claro antes de prosseguir (veja a Figura Suplementar 2).
    2. Lave o pellet com 200 μL de água ultrapura, ressuspenda e centrifuge novamente. Repita essa etapa duas vezes. Após a lavagem final, um pellet compacto ainda deve ser visível, confirmando o isolamento bem-sucedido dos complexos NP-proteicos (ver Figura Suplementar 2).
    3. Preparar o buffer de carregamento (LB):
    4. Calcule o volume total de LB com base na condição do plasma e no agente redutor da mistura (1:10), SDS do tampão de proteínas de desnaturalização (1:2) e água.
    5. Ressuspenda o pellet no volume apropriado de 1x LB e ferva a 100 °C por 10 minutos.
    6. Centrifuge a 18.620 x g, 4 °C, por 15 minutos. Colete o sobrenadante.
  2. Carregamento de exemplos SDS-PAGE
    1. Prepare a escada diluindo o padrão de peso molar (MW) com o buffer de carga.
    2. Dilua 10x Tris/Glicina/SDS passando o buffer até 1x.
    3. Monte a câmara de eletroforese com gel gradiente livre de manchas de 4%-20% e adicione o buffer de corrida até atingir o nível recomendado indicado pelo fabricante.
    4. Carregue amostras de 10 μL e uma escada de 7 μL em cada poço. Faça gel a 150 V por ~90 min em temperatura ambiente.
      NOTA: O volume de LB deve ser calculado com base na concentração plasmática selecionada em 3.1.1 para garantir a visualização ideal da proteína na imagem do gel (tipicamente proteínas de 10 μg em 20 μL LB).
      ATENÇÃO: Para reprodutibilidade ideal, realize a análise SDS-PAGE usando amostras de plasma NP recém-preparadas. O armazenamento de pellets lavados a -80 °C por 24 horas resultou em alterações detectáveis tanto nas propriedades fisicoquímicas (após resscontrosão e medições de potencial DLS/zeta) quanto nas impressões digitais da coroa proteica (quando os pellets foram processados a partir do Passo 4.3.1 do protocolo; veja a Figura Suplementar 3).

5. Análise de padrões de proteínas

  1. Processamento de imagem
    1. Gel de imagem usando um imageador de quimioluminescência.
    2. Processe a imagem do gel da seguinte forma:
      1. Importe a imagem do gel e salve-a como um arquivo TIFF, corrija para efeitos indesejados, por exemplo, distorções oblíquas nas faixas que afetam particularmente as faixas periféricas. Detecte todas as linhas de gel. Subtraia o sinal de fundo da imagem.
      2. Calibre os deslocamentos verticais convertendo unidades de pixel em unidades de peso molecular, com base em um ajuste exponencial de duplo prazo da faixa do marcador. Gerar saídas gráficas para visualizar perfis de intensidade e distribuições de sinais específicas por faixa.
    3. Exporte os dados processados, ou seja, os perfis unidimensionais calculados.
    4. Calcule as distribuições de peso molecular normalizando os perfis e calcule áreas integrais nas faixas desejadas de MW para cada faixa.
    5. Exporte os dados de saída, ou seja, as áreas integrais dentro das faixas de peso molecular especificadas.
  2. Análise multivariada para diagnóstico
    1. Aplicar análise discriminante linear (LDA) ou outros métodos multivariados para análise de classificação.
    2. Calcule precisão, sensibilidade, especificidade e realize a análise ROC.
      NOTA: Os scripts empregados para processamento de imagens, normalização de perfis, ajuste e classificação estão disponíveis apartir do 27, onde o manual do usuário correspondente também é fornecido.
      ATENÇÃO: Siga os protocolos de biossegurança ao manusear plasma humano.

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Resultados

Um dos principais desafios na padronização dos experimentos de PC está em minimizar a variabilidade técnica e dependente do operador, como já destacado neste estudo26. Ainda persistem questões em aberto sobre a influência de variáveis experimentais como viés do operador e o impacto de ferramentas automatizadas nareprodutibilidade 18,28.

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Discussão

Versatilidade e reprodutibilidade dos métodos entre tipos de NP

O protocolo apresentado aqui fornece um fluxo de trabalho padronizado e reprodutível para isolar e caracterizar o PC formado em NP após a incubação com HP. Como demonstrado em estudos anteriores e atuais, o método possibilita a geração de impressões digitais moleculares baseadas em SDS-PAGE que capturam características biologicamente e diagnosticamente rele...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.

Agradecimentos

A pesquisa foi parcialmente financiada pelo MUR, Plano Nacional de Investimentos Complementares ao NRRP, financiado pela União Europeia-NextGenerationEU, Projeto "D3 4 HEALTH-Digital Driven Diagnostics, prognostics and therapeutics for sustainable Health care". PNC0000001, Spoke 3 Linea tematica 2, missione 4, componente 2 CUP: B53C22006120001. Esse trabalho também foi apoiado pela Fundação AIRC no âmbito do projeto IG 2020-ID. 24521, P.I. Pozzi Daniela.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
TUBO de Ligação de Proteína de 1,5MLeppendorf22431081
10x Tris/Glicina/SDSBiorad1610732
CentrífugaLabortechnikZ 216 MK HermleUsado a 18.620 RCF por 20 minutos em 4 graus; C
Sistema de imagem ChemiDocBio-Rad12003153Usado para aquisição de imagens em gel
ClorofórmioSigma AldrichC2432-1LSolvente para DOTAP
Corning 1-200 & micro; Pontas de pipeta L Universal Fit Bulk PackedCorning4845
Criterion TGX Géis pré-moldados Sem ManchasBiorad5678095
Água Destilada 6 x 1LThermo Fisher15230001
DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano)Lípidos polares Avanti890890P-200mgUsado para preparar lipossomos catiônicos; dissolvido no clorofórmio, evaporado, hidratado e extrudado
Fonte de Alimentação Enduro 300V Labnet E0303-230V
Leitor de Microplacas GloMax DiscoverPromegaGM3000
Nanopartículas de ouro (estabilizadas com citrato)Sigma-Aldrich742031-25MLUsado como nanomaterial; Usado sem purificação adicional
Gel de poliacrilamida gradiente (4– 20% TGX)Bio-Rad5678095Usado para SDS e ndash; PAGE
Instrumento de Subvenção  Termoshaker HC24N (24 microtubos de 1,5mL)Fisher científicaPHMT-PSC24N
Solução de óxido de grafeno (GO)GrafeneaGO-4-1000Usado como nanomaterial; diluído para 0,25 mg/mL e sonicado
Plasma Humano (HP)Sigma-AldrichP9523-5MLUsado para incubação de nanopartículas
ImageLab SoftwareBio-Rad. Versão 6.1.0.07/Usado para exportar imagens de gel como arquivos tiff
Buffer de carregamento de Laemmli 2xBiorad1610737Usado para resuspensão de pellets
MATLABMathWorks. Versão R2022a/Usado para processamento de imagens, análise de dados e computação de perfis
Mini-extrusorLípidos polares Avanti610020Usado para preparação de lipossomos
Agente Redutor de Amostras NuPAGE (10X)Termo CientíficaNP004
Tamponador de Soro FosfatadoCorning 21-031-cmUsado para amostras DOTAP-HP
Kit de Ensaio de Proteína Pierce BCA, 1 Kit (1 L)ThermoFisher23225
Pontas de pipeta 0,5-10ul de claridadeAxygenT-300-STK
PIPETMAN L P10L, 0,5-10 & micro; L, Ejetor de MetalGilsonFA10002M
PIPETMAN P20, 2-20 & micro; L, Ejetor de MetalGilsonF144056M
PIPETMAN P200, 20-200 & micro; L, Ejetor de MetalGilsonF144058M
Sistema automatizado de pipetagem PIPETMAXGilsonGSYS0021Usado para manuseio automatizado de amostras
Filtro de policarbonato (0.1 & micro; m)Lípidos polares Avanti610005-1EAUsado para extrusão de lipossomos
Padrões de Proteína Precision Plus All Blue PrestainedBiorad1610373
Padrões Precision Plus Protein Uncolored & nbsp;Biorad1610363EDU
Sonicador de célula vibra VC505Sonics and Materials inc.VC505
ZetaSizerMalvernZS90Usado para medições de espalhamento dinâmico da luz (DLS) e microeletroforese (ME)

Referências

  1. Cai, R., Chen, C. The crown and the scepter: Roles of the protein corona in nanomedicine. Adv Mater. 31 (45), 1805740(2019).
  2. Caputo, D., et al. Nanotechnology meets oncology: A perspective on the role of the personalized nanoparticle-protein corona in the development of technologies for pancreatic cancer detection. Int J Mol Sci. 23 (18), 10591(2022).
  3. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: A test study. ACS Nano. 5 (9), 7503-7509 (2011).
  4. Hajipour, M. J., et al. Personalized protein coronas: A "key" factor at the nanobiointerface. Biomater Sci. 2 (9), 1210-1221 (2014).
  5. Quagliarini, E., et al. Protein corona-enabled serological tests for early-stage cancer detection. Sens Int. 1, 100025(2020).
  6. Caracciolo, G., et al. Size and charge of nanoparticles following incubation with human plasma of healthy and pancreatic cancer patients. Colloids Surf B Biointerfaces. 123, 673-678 (2014).
  7. Barrán-Berdón, A. L., et al. Time evolution of nanoparticle-protein corona in human plasma: Relevance for targeted drug delivery. Langmuir. 29 (21), 6485-6494 (2013).
  8. Yu, Y., Luan, Y., Dai, W. Dynamic process, mechanisms, influencing factors, and study methods of protein corona formation. Int J Biol Macromol. 205, 731-739 (2022).
  9. Hadjidemetriou, M., Kostarelos, K. Evolution of the nanoparticle corona. Nat Nanotechnol. 12 (4), 288-290 (2017).
  10. Caputo, D., et al. A protein corona-enabled blood test for early cancer detection. Nanoscale. 9 (1), 349-354 (2017).
  11. Pozzi, D., Caracciolo, G. Exploiting differences in personal nanoparticle corona profiles for cancer diagnostics. , Taylor & Francis. 431-433 (2025).
  12. Vence, M. G., et al. Potential clinical applications of the personalized, disease-specific protein corona on nanoparticles. Clin Chim Acta. 501, 102-111 (2020).
  13. Di Domenico, M., et al. Nanoparticle-biomolecular corona: A new approach for the early detection of non-small-cell lung cancer. J Cell Physiol. 234 (6), 9378-9386 (2019).
  14. Papi, M., et al. Exploitation of nanoparticle-protein interactions for early disease detection. Appl Phys Lett. 114 (16), 163702(2019).
  15. Di Santo, R., et al. Protein corona profile of graphene oxide allows detection of glioblastoma multiforme using a simple one-dimensional gel electrophoresis technique: A proof-of-concept study. Biomater Sci. 9 (13), 4671-4678 (2021).
  16. Caputo, D., et al. Synergistic analysis of protein corona and haemoglobin levels detects pancreatic cancer. Cancers. 13 (1), 93(2020).
  17. Colapicchioni, V., et al. Personalized liposome-protein corona in the blood of breast, gastric and pancreatic cancer patients. Int J Biochem Cell Biol. 75, 180-187 (2016).
  18. Di Santo, R., et al. Personalized graphene oxide-protein corona in the human plasma of pancreatic cancer patients. Front Bioeng Biotechnol. 8, 491(2020).
  19. Digiacomo, L., et al. Efficient pancreatic cancer detection through personalized protein corona of gold nanoparticles. Biointerphases. 16 (1), 011010(2021).
  20. Caputo, D., Caracciolo, G. Nanoparticle-enabled blood tests for early detection of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Lett. 470, 191-196 (2020).
  21. Caracciolo, G., et al. Challenges in molecular diagnostic research in cancer nanotechnology. Nano Today. 27, 6-10 (2019).
  22. Ashkarran, A. A., et al. Measurements of heterogeneity in proteomics analysis of the nanoparticle protein corona across core facilities. Nat Commun. 13 (1), 6610(2022).
  23. Pederzoli, F., et al. Protein corona and nanoparticles: How can we investigate on. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 9 (6), e1467(2017).
  24. Otoo, J. A., Schlappi, T. S. REASSURED multiplex diagnostics: A critical review and forecast. Biosensors. 12 (2), 124(2022).
  25. Papi, M., Caracciolo, G. Principal component analysis of personalized biomolecular corona data for early disease detection. Nano Today. 21, 14-17 (2018).
  26. Giulimondi, F., et al. Reproducibility of biomolecular corona experiments: A primer for reliable results. Part Part Syst Charact. 40 (2), 2200169(2023).
  27. Renzi, S., et al. Structuring lipid nanoparticles, DNA, and protein corona into stealth bionanoarchitectures for in vivo gene delivery. Nat Commun. 15 (1), 9119(2024).
  28. Van Dorpe, S., et al. Integrating automated liquid handling in the separation workflow of extracellular vesicles enhances specificity and reproducibility. J Nanobiotechnology. 21 (1), 157(2023).
  29. Quagliarini, E., et al. The influence of protein corona on graphene oxide: Implications for biomedical theranostics. J Nanobiotechnology. 21 (1), 267(2023).
  30. Jiříčková, A., et al. Synthesis and applications of graphene oxide. Materials. 15 (3), 920(2022).
  31. Saorin, A., et al. A redefined protocol for protein corona analysis on graphene oxide. ACS Nanosci Au. , (2025).
  32. Digiacomo, L., et al. Nanoparticle-protein corona enhances accuracy of Ca-19.9-based pancreatic cancer classification. Nanoscale. 17 (12), 7066-7075 (2025).
  33. Caputo, D., et al. Improving the accuracy of pancreatic cancer clinical staging by exploitation of nanoparticle-blood interactions: A pilot study. Pancreatology. 18 (6), 661-665 (2018).
  34. Quagliarini, E., et al. A decade of the liposome-protein corona: Lessons learned and future breakthroughs in theranostics. Nano Today. 47, 101657(2022).
  35. Wu, S. Y., An, S. S. A., Hulme, J. Current applications of graphene oxide in nanomedicine. Int J Nanomedicine. 10 Suppl 1, 9-24 (2015).
  36. Caputo, D., et al. Multiplexed detection of pancreatic cancer by combining a nanoparticle-enabled blood test and plasma levels of acute-phase proteins. Cancers. 14 (19), 4658(2022).

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