Os Tregs CD8+CD103+ atenuam a doença do olho seco por meio da supressão da inflamação mediada por células T CD4+ e proteção da integridade da superfície ocular em camundongos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo demonstrando a transferência adotiva das células T regulatórias CD8+CD103+ como uma intervenção imunoterapêutica para amenizar a doença do olho seco induzida por estresse e desidratação, por meio da modulação abrangente das respostas patogênicas das células T CD4+.

Resumo

As células T regulatórias CD8+CD103+ representam uma população imunossupressora especializada com potencial terapêutico demonstrado em doenças autoimunes; No entanto, seu papel na inflamação da superfície ocular permanece inexplorado. Este protocolo descreve uma abordagem sistemática para isolar células T CD8+CD103+ de camundongos expostos ao estresse dessecante e avaliar sua eficácia terapêutica por meio de transferência adotiva em doença experimental de olho seco. A metodologia abrange a separação celular ativada magneticamente para purificação de células T CD8+CD103+, indução padronizada de estresse dessecante e avaliações funcionais abrangentes, incluindo medição de produção de lágrimas, testes de permeabilidade da barreira corneal e análise molecular de mediadores inflamatórios. Resultados representativos demonstram que a terapia com células T CD8+CD103+ restaurou significativamente a produção de lágrimas, preservou populações de células do cálice conjuntival e manteve a integridade da barreira epitelial corneana. O tratamento alcançou supressão substancial da expressão da metaloproteinase da matriz, reduziu a morte celular apoptótica e modulou os perfis de citocinas de padrões pró-inflamatórios para protetores teciduais. O protocolo reduziu efetivamente a infiltração de células T CD4+ nos tecidos oculares, ao mesmo tempo em que suprimiu simultaneamente a produção patogênica de IL-17A e IFN-γ e aumentou os níveis protetores de IL-13. Essa abordagem fornece uma estrutura experimental robusta para investigar a imunomodulação mediada por células T CD8+CD103+ em distúrbios da superfície ocular e estabelece uma metodologia fundamental para o desenvolvimento de novas terapias celulares para o manejo da doença do olho seco.

Introdução

A doença do olho seco (DED) representa um distúrbio da superfície ocular prevalente e debilitante que se tornou uma preocupação significativa de saúde global, afetando de 10 a 30% da população mundial e comprometendo substancialmente a qualidade de vida, a produtividade no trabalho e o bem-estar psicológico dos^{pacientes 1,2,3}. A fisiopatologia da DED envolve uma interação complexa entre instabilidade do filme lacrimal, inflamação da superfície ocular e anomalias neurossensoriais, que coletivamente perpetuam um ciclo vicioso de danos teciduais e comprometimento^{funcional 4}. No nível molecular, a hiperosmolaridade lacrimal atua como um mecanismo patogênico central, desencadeando eventos inflamatórios em cascata que ativam vias de resposta ao estresse, induzem a liberação de mediadores proinflamatórios e, por fim, comprometem o delicado equilíbrio homeostático do microambiente da superfície^{ocular 5,6,7}.

O cenário imunológico da DED é dominado por respostas imunes adaptativas, com a imunidade mediada por células T CD4+ desempenhando um papel fundamental na orquestração da deterioração da superfície ocular e na perpetuação da inflamação^{crônica 8}. As células T CD8+ constituem um componente essencial da população imune homeostática normal nos tecidos oculares, mantendo a vigilância imune e a integridade dos tecidos sob condições^{fisiológicas 9}. Investigações seminais demonstraram que o estresse dessecante (DS) ativa células apresentadoras de antígeno e, subsequentemente, prepara as células T CD4+ para fenótipos patogênicos, que podem induzir autoimunosamente ceratoconjuntivite lacrimal seca (KCS) quando transferidas adotivamente para camundongos nus deficientes em células T, recapitulando assim as principais características da DED^{humana 10,11}.

Dado o papel central das respostas desreguladas das células CD4+ T na patogênese da DED, estratégias terapêuticas voltadas para a modulação da imunidade patogênica das células T emergiram como abordagens promissoras para o manejo dessa doença. Nesse contexto, as células T regulatórias CD8+ (Tregs), particularmente o subconjunto CD8+CD103+, têm recebido atenção significativa devido às suas potentes capacidades imunossupressoras e funções protetoras de tecidos em diversas condições autoimunes e inflamatórias. Essas populações reguladoras especializadas modulam as respostas imunes por meio de múltiplos mecanismos, incluindo supressão mediada por citocinas, inibição direta do contato celular e regulação metabólica da função dos linfócitos^efetores 12,13,14. A integrina αEβ7 (CD103) atua como um receptor crítico de homing que facilita o posicionamento intraepitelial dos linfócitos através dos tecidos mucosos, permitindo que os Tregs CD8+CD103+ exerçam efeitos imunarregulatórios localizados nos locais de^{inflamação 15}.

Há evidências crescentes de que os Tregs CD8+CD103+ possuem potencial terapêutico significativo para mitigar reações imunes prejudiciais em uma variedade de condições mucosas^autoimunes 16,17,18. Essas células apresentam padrões de tráfego únicos que permitem seu acúmulo preferencial em locais mucosos, onde podem combater efetivamente respostas imunes destrutivas de tecidos, promovendo a cura e a homeostase. Investigações recentes começaram a elucidar o papel das células T CD8+CD103+ na imunidade da superfície ocular, demonstrando sua expansão numérica nos linfonodos cervicais após exposição ao DS e sua capacidade de migrar para os tecidos^conjuntivais 19,20,21,22^. No entanto, apesar dessas observações intrigantes, as contribuições funcionais específicas das células T CD8+CD103+ para a patogênese do olho seco e seu potencial terapêutico na modulação do dano superficial ocular mediado por células T CD4+ permanecem incompletamente compreendidas.

A transferência adotiva de CD8+CD103+ Tregs representa um avanço distinto em relação às abordagens terapêuticas convencionais de DED, incluindo lágrimas artificiais, agentes anti-inflamatórios e medicamentos imunossupressores, ao direcionar os mecanismos imunológicos patogênicos subjacentes em vez de apenas tratar manifestações^{sintomáticas.} Ao contrário das terapias imunossupressoras sistêmicas, que suprimem amplamente a função imunológica, a intervenção baseada em Treg CD8+CD103+ oferece modulação direcionada das respostas patogênicas das células T CD4+, preservando a imunidade^{protetora 24}. Essa abordagem complementa terapias celulares existentes, como aplicações de células-tronco mesenquimais e transferência de Treg CD4+CD25+, fornecendo maior especificidade do tecido mucoso por meio de mecanismos de homing mediados por CD103²⁵.

A lacuna crítica de conhecimento sobre os mecanismos regulatórios pelos quais as células T CD8+CD103+ podem influenciar a patogênese do olho seco representa uma barreira significativa para o desenvolvimento de intervenções imunoterapêuticas direcionadas para essa condição debilitante. Além disso, a complexa interação entre populações de células T regulatórias e efetoras na inflamação da superfície ocular requer investigação sistemática para identificar novos alvos terapêuticos e otimizar estratégias de tratamento. Este estudo tem como objetivo caracterizar de forma abrangente a regulação mediada por células T CD8+CD103+ dos processos patogênicos impulsionados por células T CD4+ em um modelo bem estabelecido de doença ocular seca em camundongos. A inovação metodológica central envolve o isolamento sequencial das células reguladoras CD8+CD103+, seguido por transferência adotiva e avaliação abrangente de leituras funcionais, histológicas e moleculares para estabelecer eficácia terapêutica e elucidar mecanismos subjacentes. O objetivo final era aprimorar nosso entendimento das respostas imunes na superfície ocular e descobrir possíveis estratégias de tratamento para o manejo da DED em humanos.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram conduzidos em estrita conformidade com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e Visual e foram aprovados pelo Comitê de Ética Experimental de Animais do Segundo Hospital Popular de Jinan. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal e reduzir o número de animais usados de acordo com o princípio das 3Rs (Substituição, Redução e Refinamento).

1. Preparação animal e desenho experimental

1. Obtenha fêmeas C57BL/6 camundongos de 6 a 8 semanas de uma instalação aprovada para animais de laboratório (código da cepa: 027) com um estado de saúde específico livre de patógenos.
2. Animais domésticos em ambiente controlado, mantendo ciclos de luz e escuro de 12 horas (luzes acesas das 06:00 às 18:00), temperatura de 22 ± 2 °C e umidade relativa de 50-60% usando sistemas de monitoramento ambiental.
3. Permita que os animais se aclimatem por 1 semana antes dos procedimentos experimentais, enquanto fornece comida e água padrão de laboratório à vontade.
4. Randomize 32 camundongos em quatro grupos experimentais (n = 8 por grupo) usando randomização gerada por computador: controles não estressados (NS), estresse dessecante isoladamente (DS), estresse dessecante com controle veicular (DS + VC) e estresse dessecante com tratamento com células T CD8+CD103+ (DS + CD8+CD103+).
   NOTA: Monitore os animais diariamente em busca de sinais de sofrimento, como redução de atividade ou perda de peso superior a 10%.

2. Indução de estresse dessecante

1. Prepare a solução de hidrobrometo de escopolamina dissolvendo 0,5 mg em 0,2 mL de soro óso estéril tamponado com fosfato (PBS) imediatamente antes do uso, atingindo uma concentração final de 2,5 mg/mL.
2. Administre escopolamina subcutâneamente em uma dose de 0,5 mg/kg de peso corporal (aproximadamente 0,04 mL por camundongo de 20 g) quatro vezes ao dia, às 8h, 12h00, 15h00 e 18h00 por cinco dias consecutivos, usando agulhas 27-G.
3. Posicione ventiladores de velocidade variável para gerar uma tiragem contínua de ar com velocidade padronizada de 15 m/s medida no nível da gaiola usando calibração de anemômetro digital.
4. Mantenha a umidade ambiente abaixo de 40% usando câmaras dessecantes contendo gel de sílica ativada (grade 40, malha 6-12) enquanto monitora continuamente as condições ambientais com higrômetros digitais (precisão ±2% HR).
5. Mantenha a temperatura em 22 ± 1 °C durante todo o período de exposição utilizando sistemas de controle ambiental de precisão com monitoramento contínuo.
6. Monitore os animais duas vezes ao dia em busca de sinais de desidratação, perda de peso (>15% justifica exclusão) ou comportamentos de estresse, incluindo cuidados excessivos ou redução da atividade.

3. Isolamento e purificação de células T CD8+CD103+

1. Sacrificar camundongos doadores previamente expostos ao estresse dessecante usando asfixia por CO₂, seguida por luxação cervical, de acordo com protocolos aprovados de eutanásia.
2. Colhe baços e linfonodos cervicais superficiais em condições estéreis usando instrumentos estéreis em um armário de segurança biológica, colocando tecidos em meio RPMI-1640 gelado suplementado com soro fetal bovino a 10%.
3. Prepare suspensões de célula única interrompendo mecanicamente os tecidos através de peneiras de células de 70 μm usando êmbolos de seringa estéreis, lavando as células duas vezes com PBS contendo 2% de FBS e 1 mM de ácido etilenediaminotetraacético (EDTA).
4. Isole as células T CD8+ usando separação celular ativada magneticamente com microesferas magnéticas conjugadas com anticorpos anti-CD8, conforme as instruções do fabricante.
5. Avalie a viabilidade celular usando o ensaio de exclusão de tripan blue (solução de 0,4%), contando células viáveis e não viáveis usando um contador celular automatizado, prosseguindo apenas com preparações que excedam 95% de viabilidade.
6. Enriquecer para expressão de CD103+ por incubação sequencial com anticorpo anti-CD103-APC em diluição 1:100 por 30 minutos a 4 °C no escuro.
7. Realize separação magnética secundária usando microesferas anti-aloficocianina (anti-APC) com colunas LS para obter células CD8+CD103+ duplamente positivas seguindo os protocolos do fabricante.
8. Valide a pureza celular usando citometria de fluxo colorindo as alíquotas com anticorpos anti-CD8-FITC e anti-CD103-APC, garantindo uma população de >CD8+CD103+ células duplamente positivas antes de prosseguir.

4. Protocolo de transferência adotiva

1. Prepare suspensões CD8+CD103+ células T a uma concentração de 5 × 10⁶ células/mL em soro salino estéril tamponado com fosfato, centrifugando células a 300 × g por 5 minutos e ressuspendendo em volume apropriado.
2. Injete 1 × 10⁶ células em 200 μL de PBS estéril intraperitonealmente nos dias -2, 0 e +2 em relação ao início do estresse dessecante, garantindo uma mistura suave antes de cada injeção.
3. Administrar volumes equivalentes de PBS estéril aos grupos de controle do veículo usando o mesmo esquema e técnica de injeção para manter a consistência experimental.
4. Mantenha as preparações celulares no gelo e complete as transferências dentro de 2 horas após o isolamento para preservar a viabilidade e função ideais.
5. Gire os locais de injeção entre o abdômen inferior esquerdo e direito para minimizar a inflamação local e monitore os animais por 24 horas após a injeção para detectar reações adversas.

5. Procedimento de avaliação funcional

1. Medição da produção de lágrimas
   1. Realize medições consistentemente às 20h para levar em conta as variações circadianas na produção de lágrimas.
   2. Imobilize suavemente o rato usando dispositivos de contenção adequados, sem anestesia, para evitar interferência nos mecanismos naturais de produção de lágrimas.
   3. Coloque fio de algodão impregnado de fenol vermelho na fórnia conjuntival inferior por exatamente 15 segundos usando pinças de ponta fina.
   4. Meça imediatamente o comprimento da rosca molhada usando pinças digitais de precisão (precisão ± 0,01 mm) sob condições padronizadas de iluminação fluorescente.
2. Avaliação da função da barreira^{corneal 26}
   1. Anestesie brevemente o camundongo com inalação de isoflurano a 2% durante a aplicação do traçador para garantir uma instalação precisa.
   2. Injete 0,5 μL de solução de 50 mg/mL de verde-dextrano Oregon na superfície central da córnea usando uma micropipeta de precisão com pontas de deslocamento positivo.
   3. Enxágue as córneas cuidadosamente com soro fisiológico estéril cinco vezes após 1 minuto de incubação para remover o excesso de traçantes, garantindo a remoção completa da fluorescência superficial.
   4. Fotografe as córneas imediatamente usando microscopia de fluorescência com um conjunto de filtros de isotiocianato de fluoresceína (FITC) (excitação 490 nm, emissão 525 nm) e parâmetros de exposição padronizados.
   5. Quantifique a intensidade da fluorescência usando o software ImageJ com protocolos consistentes de seleção de regiões de interesse e subtração de fundo.
      1. Converta imagens para tons de cinza de 8 bits, defina uma região circular padronizada de interesse (ROI) que cobre o diâmetro central de 3 mm da córnea.
      2. Meça o valor cinza médio, subtraia a fluorescência de fundo medida de uma região não corneal adjacente e expresse os resultados como fluorescência total corrigida (CTF) calculada como: CTF = Densidade Integrada - (Área de ROI × Fluorescência média de fundo)²².

6. Processamento e análise histológica

1. Remova os olhos e as estruturas ao redor imediatamente após a eutanásia, depois fixe em paraformaldeído a 4% por 24 horas ou insome em composto de temperatura de corte ideal (OCT) para seções congeladas, garantindo a orientação adequada para a secção sagital.
2. Prepare seções sagitais seriadas (6 μm para congelados, 5 μm para parafina) usando marcos anatômicos padronizados (nervo óptico como ponto de referência) para planos de seção consistentes em todos os espécimes.
3. Realize coloração periódica de ácido-Schiff (PAS) para quantificação de células caliciformes usando protocolos padronizados com controles positivos e negativos apropriados.
4. Execute a coloração por imunofluorescência usando anticorpos primários: anti-MMP-3 (1:200), anti-MMP-9 (1:100), caspase-3 antiativada (1:300), caspase-8 antiativada (1:200) e anti-CD4 (1:100) com incubação noturna a 4 °C.
5. Quantifique as células de cálice por milímetro de comprimento conjuntival usando métodos sistemáticos de amostragem, contando células em cinco campos de alta potência não sobrepostos por seção e fazendo a média dos resultados.

7. Análise molecular

1. Extraia RNA total de tecidos conjuntivais e corneanos agrupados usando protocolos de extração^{validados 27}.
2. síntese de cDNA e PCR quantitativa em tempo real²⁸
   1. Prepare misturas de reação de transcrição reversa contendo 1 μg de RNA total, primers oligo-dT (50 μM), primers de hexâmero aleatório (100 μM), enzima transcriptase reversa, buffer de reação e água livre de nuclease em volume final de 20 μL.
   2. Incubar misturas de reação em um termificador a 37 °C por 15 minutos para permitir a síntese de cDNA na primeira fita.
   3. Inative a enzima transcriptase reversa aquecendo a 85 °C por 5 segundos, depois esfrie até 4 °C e armazene o cDNA a -20 °C até o uso.
   4. Diluiu cDNA sintetizado 1:10 com água livre de nuclease para uso como molde em reações subsequentes de PCR.
   5. Prepare misturas de reação PCR em tempo real (volume final de 20 μL) contendo 1 μL de molde de cDNA diluído, espolvadores diretos e reversos (concentração final de 0,2 μM cada), mistura master SYBR Green e água sem nuclease.
   6. As amostras se coloquem em triplicado em placas ópticas de reação de 96 poços, incluindo controles sem molde para cada par de primers.
   7. Programe o ciclador térmico com as seguintes condições: desnaturação inicial a 95 °C por 10 minutos, seguida por 40 ciclos de desnaturação (95 °C por 15 s), recozimento (60 °C por 30 s) e extensão (72 °C por 30 s).
   8. Inclua uma etapa da curva de dissociação imediatamente após a amplificação: 95 °C por 15 s, 60 °C por 1 minuto, depois aumento gradual da temperatura para 95 °C a uma taxa de 0,3 °C/s para verificar a amplificação de produto único.
   9. Analise curvas de amplificação e valores de limiar de ciclo (Ct) usando software de instrumento, garantindo eficiência de amplificação entre 90-110% para todos os pares de primers.
   10. Normalize a expressão gênica-alvo (IL-17A, IFN-γ, IL-13, MMP-3 e MMP-9) para o gene doméstico GAPDH usando o método ^2-ΔΔCt .
   11. Use sequências de primer conforme especificado na Tabela 1 para todos os genes-alvo e de referência.
3. Quantifique os níveis de proteínas de citocinas em extratos de tecido usando kits ELISA comercialmente disponíveis, com curvas padrão apropriadas e controles de qualidade.

Resultados

A implementação bem-sucedida desse protocolo resulta na melhoria abrangente da patologia da superfície ocular induzida por estresse dessecante por meio da imunomodulação mediada por células T CD8+CD103+. Resultados positivos demonstram restauração significativa da produção de lágrimas, normalmente alcançando 60-80% de recuperação em comparação com controles não estressados, enquanto animais tratados com veículos apresentam déficits persistentes de lacrima...

Discussão

Esta investigação estabelece que as células T regulatórias CD8+CD103+ são agentes terapêuticos potentes que dessecam a doença ocular seca induzida pelo estresse por meio da modulação abrangente das respostas patogênicas mediadas pelas células T CD4+. Os achados revelam que a transferência adotiva das células T CD8+CD103+ alcança proteção multifacetada da integridade da superfície ocular, abrangendo restauração funcional da produção de lágrimas, preservação da arquitetura mucosa, manutenç...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo anti-CD103-APC	Biolenda	Clone 2E7	Citometria de fluxo e ordenação celular
Microesferas magnéticas anti-CD8	Miltenyi Biotec	-	Separação por células magnéticas
Dextrano verde de Oregon corneano	Invitrogen	D7172	Peso molecular 70.000
Kit ELISA, IFN-& GAMA;	eBiociência	BMS606	Quantificação de citocinas
ELISA kit IL-13	eBiociência	BMS6015	Quantificação de citocinas
ELISA kit IL-17A	eBiociência	BMS6001	Quantificação de citocinas
ImageJ	Institutos Nacionais de Saúde	Versão 1.53K
Fios de algodão vermelho fenol	Zona-Rápido, Yokota	-	Medição da produção de lágrimas
Brometo de escopolamina	Melonepharma	MB5860	Antagonista muscarinico