Artigo de método

Modelo Organoide Tumoral Tridimensional Derivado do Paciente para Triagem In Vitro do Receptor Quimérico de Células T

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DOI:

10.3791/69113

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30 de dezembro de 2025

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1Department of Oncology, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 2Department of Pharmacology, Joint Laboratory of Guangdong-Hong Kong Universities for Vascular Homeostasis and Diseases, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 3Department of Digestive Disease, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 4Department of Human Cell Biology and Genetics, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 5Department of Surgical Endoscopy, Shenzhen People's Hospital (The First Affiliated Hospital, Southern University of Science and Technology; The Second Clinical Medical College, Jinan University), 6Department of Medicine and Therapeutics, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 7Institute of Digestive Disease, State Key Laboratory of Digestive Disease, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

Neste artigo

Resumo

Esse protocolo estabelece um modelo de co-cultura in vitro usando organoides tumorais derivados do paciente e células T (CAR-T) receptor de antígeno quimérico para avaliar a atividade citotóxica específica das células CAR-T contra células tumorais sólidas.

Resumo

A terapia com células receptor de antígeno T quimérico (CAR-T) atingiu uma eficácia clínica empolgante em malignidades hematológicas, mas a terapia com células CAR-T para tumores sólidos ainda requer desenvolvimento adicional. Organoides tumorais derivados do paciente são modelos de doença in vitro que mantêm a heterogeneidade do paciente e têm sido usados para testar a eficácia e segurança da quimioterapia e de medicamentos direcionados. Este método descreve um modelo de teste de eficácia in vitro que co-cultiva organoides tumorais com células CAR-T. Amostras de câncer colorretal de pacientes são construídas em organoides tumorais com estrutura tridimensional (3D) em uma matriz de membrana basal. Os organoides tumorais podem crescer de forma estável e ser transportados continuamente. Organoides tumorais maduros são separados da matriz por lavagem e centrifugação, e células CAR-T são adicionadas em diferentes proporções efetor-alvo (E:T) para formar um sistema de co-cultura imuno-organoide. Após 6 a 24 horas, a morfologia e as estruturas intercelulares dos organoides são observadas por imagem em campo claro. Este experimento realiza ainda a coloração de células mortas no sistema de cocultura, que pode refletir a viabilidade dos organoides e avaliar o efeito citotóxico das células CAR-T sobre organoides tumorais. Este experimento pode observar efetivamente a interação entre as células CAR-T e organoides tumorais 3D, e os resultados podem ser usados para avaliar a atividade de destruição tumoral das células CAR-T.

Introdução

A terapia com células do receptor de antígeno quimérico T (CAR-T) demonstrou notável sucesso clínico no tratamento de malignidadeshematológicas 1. No entanto, sua aplicação em tumores sólidos permanece limitada devido a vários obstáculos principais, incluindo heterogeneidade tumoral e perda de antígenos, barreiras físicas e químicas dentro da massa tumoral, e o microambiente tumoralimunossupressor 2,3. Esses desafios contribuem para a eficácia limitada da terapia com células CAR-T em ambientes de tumores sólidos.

A avaliação in vitro da eficácia das células CAR-T é um passo crítico durante o desenvolvimento pré-clínico. Os modelos mais comumente usados são as linhagens celulares tumorais, que podem expressar antígenos específicos associados ao tumor ou ser modificadas para transportar genes repórteres como a luciferase 4,5. Consequentemente, os resultados de ensaios convencionais baseados em linhas celulares frequentemente não preveem os resultados clínicos. Modelos tumorais derivados do paciente oferecem uma alternativa promissora para avaliar a função do CAR-T com maior precisão no contexto de tumores sólidos.

Embora vários estudos tenham começado a utilizar PDTOs para avaliação de células CAR-T, permanecem desafios para estabelecer protocolos padronizados, robustos e acessíveis de co-cultura que equilibrem efetivamente a preservação da arquitetura tumoral 3D com a interação eficiente entre células imunocelulares. Organoides tumorais derivados do paciente (PDTOs) são modelos tridimensionais (3D) de doença ex vivo gerados a partir de tecidos tumorais ou células do paciente. As PDTOs foram estabelecidas com sucesso para uma ampla variedade de tipos de tumores, incluindo câncer colorretal, de mama, pâncreas e pulmão. Essas estruturas mantêm a arquitetura histológica, os perfis moleculares e a heterogeneidade funcional do tumororiginal 6. Junto com células tumorais primárias e xenoenxertos derivados do paciente (PDX), os PDTOs representam uma plataforma valiosa para modelar características específicas da doençado paciente 7. Comparadas às linhas celulares tumorais convencionais ou culturas primárias, as PDTOs recapitulam mais de perto o ambiente tumoral in vivo, exibindo composições celulares complexas e organizaçãoestrutural 8. Eles também mantêm a estabilidade genômica e preservam padrões de expressão gênica em passagens estendidas, permitindo uma avaliação mais precisa das respostas terapêuticas 9,10. As PDTOs têm sido empregadas com sucesso em estudos de biologia tumoral, triagem de medicamentos e medicina de precisão, sendo cada vez mais reconhecidas por sua utilidade em testes de imunoterapia, incluindo identificação de novos alvos de CAR, otimização de design de CAR e avaliação decitotoxicidade 6,11,12,13 . Uma limitação comum da cultura de organoides é sua dependência de componentes da matriz extracelular (ECM) como o Matrigel (doravante chamado de matriz de membrana basal [BMM]) para a manutenção da estrutura 3D, que pode dificultar a infiltração de células imunes em ensaios de cocultura. Para garantir consistência e interação celular ideal na co-cultura, organoides dentro de uma faixa de tamanho definida (por exemplo, 100-200 μm de diâmetro) são tipicamente selecionados.

Este protocolo descreve uma plataforma de co-cultura para avaliar a citotoxicidade das células CAR-T utilizando PDTOs derivados do câncer colorretal. Amostras tumorais dos pacientes são dissociadas enzimaticamente e cultivadas em BMM para gerar organoides 3D. Uma vez maduros e expandidos, organoides de tamanho uniforme são isolados e marcados fluorescentemente. Eles são semeados em placas multipoço e co-cultivados com células CAR-T em diferentes proporções efetor-alvo (E:T). Uma característica fundamental dessa abordagem é a remoção deliberada de PDTOs do BMB antes da co-cultura, permitindo o acesso direto e sem impedimentos das células CAR-T aos organoides tumorais, mantendo sua integridade 3D em suspensão. Após 24 horas, a microscopia de campo claro revela desintegração progressiva da PDTO, caracterizada por morfologia 3D perturbada, encolhimento das células tumorais e perda de viabilidade. Imagens de células vivas e microscopia de fluorescência visualizam ainda mais as interações entre células CAR-T marcadas fluorescente e alvos tumorais. Ensaios quantitativos de morte celular são usados para avaliar a citotoxicidade. Essa cocultura imunológica baseada em organoides oferece uma plataforma robusta e específica para cada paciente para avaliar a eficácia antitumoral das células CAR-T ex vivo, possibilitando otimização terapêutica e apoiando a tradução clínica.

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Protocolo

Organoides derivados de pacientes com câncer colorretal foram utilizados. Fragmentos de tecido tumoral foram obtidos de pacientes sem tratamento com adenocarcinoma colorretal primário (CCR) confirmado histologicamente. Todos os tecidos foram extraídos a partir de amostras de biópsia endoscópica coletadas durante procedimentos diagnósticos padrão no Hospital da Zona Livre de Comércio Qianhai Shekou de Shenzhen. Todos os tecidos doadores foram confirmados como CCR por meio de exame histopatológico por patologistas institucionais. O protocolo segue as diretrizes institucionais. Consentimentos escritos e informados foram obtidos de todos os pacientes. O estudo foi aprovado pelo Comitê Ético do Hospital da Zona Franca Qianhai Shekou de Shenzhen (2024KY-009-01K).

1. Cultura PDTO

  1. Preparação de tecidos
    1. Coloque fragmentos de tecido tumoral obtidos por biópsia por colonoscopia de pacientes com adenocarcinoma colorretal primário (CCR) confirmado histologicamente em um tubo estéril de 50 mL.
    2. Adicione 30 mL de solução de lavagem de tecido frio composta por Solução Salítica Equilibrada de Hanks (HBSS), Albumina Sérica Bovina a 1% (BSA), 100 U/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina, 50 μg/mL de gentamicina, 5 μg/mL de anfotericina B e 10 μM inibidor de quinase associada à Rho (Y-27632).
    3. Coloque o tubo sobre gelo e balançe suavemente por 5 minutos para lavar o papel.
    4. Repita o passo 1.1.3. Mais duas vezes com solução nova de lavagem de lenço.
  2. Digestão de tecidos
    1. Corte o tecido necrótico ou adiposo e corte o tumor em fragmentos de tecido.
    2. Temperatura de 8 mL de meio digestivo (meio DMEM, colagenase IV de 500 U/mL, colagenase II de 1,5 mg/mL, hialuronidase de 20 μg/mL, dispase tipo II de 0,1 mg/mL, Y-27632 de 10 μM e soro bovino fetal de 1%) até 37 °C.
    3. Transfira fragmentos para o buffer de digestão e incube a 37 °C em banho-maria. Gire o tubo suavemente à mão por ~10 segundos a cada 5 minutos para facilitar a penetração da enzima.
      NOTA: Ajuste o volume do buffer de digestão de acordo com o tamanho do bloco de tecido. Geralmente, 8-10 mL são suficientes para tamanhos de biópsia endoscópica.
    4. Observe ao microscópio após 15 minutos para verificar o status de dissociação. Se permanecerem fragmentos de tecido, continue a digestão até no máximo 30 minutos.
    5. Quando os aglomerados estiverem visíveis, pipete suavemente (5-10 vezes) usando uma pipeta de 10 mL para dissociar mecanicamente. Centrifuge a 350 × g por 5 minutos.
    6. Descarte o supernadante; ressuspenda o pellet em 10 mL de solução de lavagem e centrifuge a 350 × g por 5 minutos. Repita a lavagem duas vezes.
      NOTA: As PDTOs normalmente começaram a formar estruturas esféricas compactas dentro de 3 a 5 dias após a cultura. Os organoides apresentaram proliferação robusta e atingiram um tamanho adequado para experimentação (aproximadamente 100-200 μm de diâmetro) entre o dia 10 e o 14. A passagem era realizada a cada 7 a 10 dias para manter um crescimento saudável e evitar a superconfluência ou necrose central. Geralmente, 8-10 mL de buffer de digestão são usados por biópsia (fragmentos de 2 mm³), garantindo o TrypLE Express em uma concentração final de trabalho de 1×.

2. Construção de PDTOs

  1. Incorporação de matrizes
    1. Coloque 200 μL de BMM (pré-resfriado a 4 °C) em um tubo limpo e pipete a célula para cima e para baixo pelo menos 10-15 vezes usando uma ponta pré-resfriada até que a suspensão pareça homogênea, sem aglomerados visíveis.
    2. Dispense aproximadamente 30 μL gotas em cada poço de uma placa de 24 poços. Incube a 37 °C por 10 minutos para solidificar.
    3. Adicione 500 μL de meio de cultura organoide (meio avançado DMEM/F12, contendo 50 μg/mL de R-spondina 1, 10 μg/mL de Noggin, 500 μg/mL de EGF, 100x HEPES, 100x Glutamax, 500x Normocin, 500x Gentamicina/anfotericina B, 50x N2, 100x B27, 500 mM n-acetilcisteína, 1 M Niacinamida, 5 mM inibidor de Alk 4/5/7, 30 M inibidor de p38, 100 μM Gastrin, e 100 μM de Prostaglandina E2) por poço.
      NOTA: Use aproximadamente 30 μL de BMM por gotícula; ajuste com base na densidade celular.
  2. Manutenção da cultura
    1. Cultivar organoides a 37 °C com 5% de CO2; Troque o médio a cada 3 dias.
    2. Monitore a formação dos organoides diariamente. Espere esferoides pequenos até o terceiro dia.
    3. Avalie o estabelecimento bem-sucedido dos organoides durante os dias 6 a 10. O tempo de formação (varia entre 3 e 14 dias) depende da viabilidade do tecido e da caule.

3. PDTOs de passagem

  1. Desagregação
    1. Pré-resfrie a centrífuga a 4°C. Retire o médio e adicione 1 mL de HBSS gelado e pipete suavemente 3 a 5 vezes para interromper o BMM.
      NOTA: Organoides bem desenvolvidos podem ser observados como pequenos pontos brancos a olho nu.
    2. Transfira a suspensão para um tubo estéril de 15 mL e centrifuge a 350 × g por 5 minutos.
  2. Dissociação enzimática
    1. Descarte o sobrenadante e adicione 1 mL de Triple. Coloque em banho-maria a 37 °C por 2 minutos.
    2. Adicionar 2 mL de HBSS para neutralizar o Triple; Centrifuge a 350 × g por 5 minutos.
    3. Remova o sobrenadante e resuspenda 2 mL de HBSS. Centrifuge novamente a 350 × g por 5 minutos.
  3. Reembedding
    1. Adicionar BMM fresco ao pellet em uma proporção de 1:3-1:6 (pellet organoide: BMM, v/v); Suspenda de novo com cuidado. Cada gota contém aproximadamente 30 μL de volume final. Coloque gotas em uma nova placa de 24 poços; incubar a 37 °C por 10 minutos.
    2. Adicione 500 μL de meio de cultivo por poço e incube a 37 °C com 5% de CO2.
    3. Examinar poços diariamente; observe a remontagem 3D em aproximadamente 48 horas.
    4. Após 3-5 passagens, selecione organoides saudáveis para ensaios posteriores ou criopreservação.

4. Co-cultura de células CAR-T e PDTOs

  1. Preparação do meio de cocultura
    1. Suplemente o meio de cultura organoide com 10 ng/L de IL-2 e 0,05 mM β-mercaptoetanol para apoiar a viabilidade do CAR-T.
      NOTA: O meio base suporta estrutura 3D e viabilidade de PDTOs.
  2. Preparação para PDTO
    1. Remova as gotículas de BMM contendo PDTOs maduros (por exemplo, dias 4-6) da placa de cultura usando um raspador de células estériles ou ponta de pipeta.
    2. Transfira a mistura BMM/PDTO para um tubo cônico de 15 mL.
    3. Adicione de 5 a 10 mL de HBBS gelado ou solução de lavagem de papel (conforme descrito no passo 1.1.2) ao tubo. Inverta suavemente de 5 a 10 vezes para deslocar os organoides do BMM.
    4. Deixe a mistura descansar no gelo por 5 minutos. O BMB se tornará líquido, enquanto PDTOs dissociados permanecerão em suspensão.
    5. Aspire cuidadosamente o sobrenadante contendo o BMM, deixando o pellet PDTO para trás. Evite mexer no balão.
    6. Repita os passos 4.2.3 a 4.2.5 mais duas vezes para garantir a remoção completa do BMM.
    7. Após a lavagem final, recolha o sobrenadante contendo PDTO e centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
    8. Aspire o sobrenadante e resuspenda o pellet PDTO em 1-2 mL de meio de cultura organoide ou meio de cocultura.
    9. (Opcional para contar) Prepare uma suspensão de célula única.
      1. Se for necessária contagem precisa, transfira os organoides ressuspensos para um novo tubo e incube com TrypLE Express pré-aquecido a 37 °C por 3-5 minutos, seguido por pipeteamento suave para obter uma suspensão de célula única. Prossiga com a contagem celular (por exemplo, usando um hemocitômetro ou contador celular automático).
        NOTA: Esta etapa dissocia os organoides e serve apenas para fins de contagem antes do re-placagem.
    10. Seleção de tamanho e padronização: Para garantir um tamanho organoide consistente para cocultura, passe os PDTOs ressuspensos (do passo 4.2.8) por um filtro celular de 70 μm colocado sobre um tubo cônico de 50 mL. Essa etapa remove grandes agregados organoides e detritos, representando uma fração de tamanho padronizada adequada para cocultura uniforme.
    11. Centrifuge a suspensão organoide padronizada a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
    12. Aspire o sobrenadante e resuspenda os PDTOs padronizados em um volume apropriado de meio de cocultura pré-aquecido.
    13. Conte os PDTOs padronizados (por exemplo, usando um hemocitômetro ao microscópio, contando o número de organoides por campo).
      NOTA: A contagem é baseada no número de organoides, não no número de células.
    14. Semeie os PDTOs padronizados na placa multi-poço desejada (por exemplo, placa U-bottom de 96 poços) no número alvo por poço.
    15. Adicione células CAR-T aos poços nas razões efetor-alvo (E:T) desejadas.
  3. Rotulagem de PDTOs
    1. Pré-resfrie a centrífuga a 4 °C. Aspire o meio; adicione 1 mL de HBSS para desalojar as gotas.
    2. Transfira para um tubo centrífugo de 15 mL, adicione 4 mL de HBSS e pipete suavemente. Centrifuge a 350 × g por 5 minutos.
    3. Descarte o sobrenadante, adicione 5 mL de HBSS e pipete suavemente. Centrifuge novamente a 350 × g por 5 minutos.
    4. Prepare a solução de trabalho Hoechst 33342.
    5. Resuspenda o pellet em 1 mL de solução Hoechst 33342 (concentração final de 5 μg/mL). Misture suavemente por inversão 3 a 5 vezes para garantir uma penetração uniforme do corante. Proteja-se da luz envolvendo o tubo em papel alumínio. Incube a 37 °C por 10 minutos. Após a mancha, lave duas vezes com HBSS para remover o excesso de corante.
  4. PDTOs de placagem
    1. Estima a densidade organoide com uma razão gotícula-poço em gel de 1:5; resuspende em meio de cocultura em aproximadamente 1 × 103 organoides/mL.
    2. Adicionar 100 μL por poço em uma placa de 96 poços; inclua pelo menos triplicados por condição.
      NOTA: Não realize contagem celular neste estágio; os organoides permanecem intactos.
  5. Co-cultura CAR-T
    NOTA: Este protocolo foca na co-cultura e avaliação da eficácia das células CAR-T com PDTOs. A geração e caracterização das células CAR-T utilizadas neste estudo são descritas na Seção 8.
    1. Colhe células CAR-T em fase logaritaria. Tinga com Trippan Blue para confirmar viabilidade >95%.
    2. Células centrífugas a 350 × g por 5 min; Ressuspenda em meio de cocultura.
    3. Ajuste as concentrações para 4 × 106/mL, 2 × 106/mL e 1 × 106/mL.
    4. Adicione 100 μL de suspensão CAR-T por poço conforme o projeto experimental. Adicione 100 μL de meio de cocultura para controlar poços.
    5. Incube a placa a 37 °C, 5% de CO2 por 6 a 24 horas.

5. Coloração por células mortas

  1. Mancha verde SYTOX
    1. Para cada 1 × 105 células, prepare 100 μL de solução de coloração Nuclear Green diluindo 1 μL de SYTOX Green (1000x) em 1 mL de tampão para ensaio.
    2. Nos pontos de co-cultura de 6 e 24 horas, adicione 100 μL de solução de coloração SYTOX Green por poço. Incube a 37 °C por 20 minutos no escuro.

6. Aquisição de imagens

  1. Aspire o sobrenadante e adicione 100 μL de DMEM/F12.
  2. Capture imagens em campo claro e fluorescência usando um microscópio (por exemplo, confocal):
    Hoechst 33342 (PDTOs): excitação (Ex)/emissão (Em) = 350 nm/461 nm
    mCherry (CAR-T): Ex/Em = 587 nm/610 nm
    SYTOX Green (células mortas): Ex/Em = 504 nm/528 nm
  3. Capture pelo menos imagens triplicadas por poço, focando no campo central.

7. Análise de dados

  1. Lançar ImageJ (versão 1.54, NIH, https://imagej.nih.gov/ij/); importar imagens do canal SYTOX Green. Defina o limiar manualmente para distinguir sinais de fluorescência do fundo (Imagem > Ajustar > Limiar).
  2. Use a função Analisar > Medir para calcular a densidade integrada. Exporte dados como .csv para análises estatísticas subsequentes em um software de análise estatística apropriado (por exemplo, GraphPad Prism).
  3. Defina o limiar para separar sinais de fluorescência do fundo.
  4. Selecione todo o campo; execute Analisar > Medir para calcular a intensidade somada do sinal de fluorescência.
  5. Exportar dados e realizar análises estatísticas para comparar tratados com controles em 24 horas.

8. Geração e caracterização das células CAR-T

  1. Design da construção da CAR
    NOTA: As células CAR-T usadas neste estudo têm como alvo a B7-H3 (codificada pelo gene CD276), um antígeno frequentemente superexpresso no câncercolorretal 14. A construção CAR consiste em:
    Domínio extracelular: Um fragmento variável de cadeia única (scFv) derivado de um anticorpo monoclonal contra o clone B7-H3 376.96.
    Domínio articular e transmembrana: domínio dobradiça CD8α e domínio transmembrana.
    Domínio coestimulador: CD28 humano.
    Domínio de sinalização: CD3ζ humano.
  2. Geração de células CAR-T
    1. Isolamento: Isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de pelagens buffy saudáveis de doadores usando centrifugação14 com gradiente de densidade de Ficoll-Paque.
    2. Ativação: Ative PBMCs humanos com anticorpos anti-CD3/CD28 de ligação de placa por 48 horas em meios de células T suplementados com 10 ng/mL de IL-7 e 5 ng/mL de IL-15. Prepare o meio de células T misturando volumes iguais (250 mL cada) de RPMI 1640 e Click's Media, e suplemente com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1x GlutaMAX e 1% de penicilina-estreptococo (Pen/Streptococo).
    3. Transdução: Transduz as células T ativadas com supernadante retroviral usando uma placa revestida de retronectina, conforme descritoanteriormente, 15.
    4. Expansão: Colhe e cultiva células T 3 dias após a transdução em meio completo de células T humanas contendo IL-7 e IL-15, por mais 7 a 9 dias antes da caracterização e dos ensaios funcionais.
  3. Caracterização das células CAR-T
    1. Expressão da CAR: Avalie a expressão da CAR de 5 a 7 dias após a transdução por citometria de fluxo usando uma proteína recombinante B7-H3-Fc, seguida por um anticorpo secundário marcado fluorescente contra a Fc14 humana. A eficiência típica de transdução (células CAR+) varia de 80% a 90%.
    2. Fenótipo: Caracterize os subconjuntos de células T (por exemplo, CD4+, CD8+, etc) por citometria de fluxo usando anticorpos contra CD3, CD4, CD8, CD45RA, CCR7, etc.14.
    3. Validação funcional (pré-cocultura opcional): Antes dos experimentos de co-cultura, valide funcionalmente as células CAR-T co-cultivando com linhas-alvo B7-H3-positivas e B7-H3-negativas e medindo a liberação de citocinas (por exemplo, IFN-γ pelo ELISA) ou citotoxicidade (por exemplo, usando citometriade fluxo 15).
  4. Preparação para a cocultura (Ensaio PDTO)
    1. Use células CAR-T para co-cultura durante sua expansão em fase logarítmica (tipicamente entre os dias 10 e 14 após a ativação). Antes do uso, lave as células duas vezes com HBSS para remover IL-7/IL-15 e ressuspenda-as no meio de cocultura descrito no passo 4.1.
    2. Confirme a viabilidade em >95% usando coloração com Trypan Blue.
    3. Pontos de verificação visuais: Verifique pequenos aglomerados esféricos (50-100 μm) nos dias 3-5 e esferoides maduros (100-200 μm) nos dias 10-14.

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Resultados

Organoides do câncer colorretal foram obtidos com sucesso a partir de amostras de biópsia endoscópica (Figura 1), com a identidade tumoral confirmada por diagnóstico patológico (Figura 2). Os fragmentos tumorais cultivados no BMM começaram a formar estruturas 3D em 24 horas. Organoides de primeira geração (P0) foram usados entre os dias 7 e 14. Organoides apresentavam morfologias diversas, incluindo estruturas esféricas, cística...

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Discussão

Este artigo apresenta um método para avaliar o efeito citotóxico das células CAR-T sobre PDTOs, combinando imagens de campo claro e coloração fluorescente para avaliar a viabilidade dos organoides. Essa abordagem de dupla modalidade permite visualização robusta da morte celular tumoral em um sistema modelo 3D e fornece uma avaliação semi-quantitativa da citotoxicidade do CAR-T.

Um componente crítico desse protocolo é o meio de cultura. Como as células CAR-T e ...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional Chave de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2022YFC2304400, 2022YFC2304401), pelo Projeto de Ciência e Tecnologia do Sistema Médico e de Saúde de Nanshan (NSZD2024046, NS2024105) e pelo Fundo de Pesquisa Médica de Shenzhen (D2401023).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de 15 mLSAINING3030100
Placa de 24 poçosCORNING3524
Tubo de 50 mLSAINING3030000
Placa de 96 poçosCORNING3599
DMEM/F12 AvançadoGibcoC11330500BT
Inibidor de Alk 4/5/7MCEHY-10432 
B27Gibco17504044
Armário de Biossegurança (Classe II)Thermo FisherN/A
Albumina Sérica BovinaSigma AldrichA9056
Prato de cultura celularBIOFILTCD010060
CentrífugaEppendorf5810R
O Meio do CliqueFUJI FILM9195
Incubadora de CO2YamataIP610
Colanase IISolarbioC8150
Colagenase IVSigma AldrichC9407
Microscópio a laser confocalZeissLSM900
Meio criopreservanteZENOAQCELLBANKERTM2
Buffer de digestãoReagentes preparados internamenteN/AComposição fornecida no manuscrito
Digital ShakerMIULABHS-25
Dispase tipo IISigma-aldrichD4693
DMEMGibcoC11995500BT
Dynabeads Ativador Humano T CD3/CD28Thermo Fisher11131D
EGFPeproTechAF-100-15-500UG
Soro fetal bovinoGibco1631389
GastrinGlpBioGA20228
Gentamicina/anfotirina BGibcoR0151
GlutamaxGibco35050061
Solução Equilibrada de Sal de HanksGibcoC14175500BT
HEPESGibco15630080
Hoechst 33342 BeyotimeC1027
HialuronidaseSolarbioH8030
IL-15Peprotech200-15-10UG
IL-2NovoproteínaCK24-10
IL-7Peprotech200-07-10UG
ImageJNIH (código aberto)https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted  Microscópio fluorescenteMshotMF52-N
MatrigelCorning356231
N2Gibco17502048
n-AcetilcisteínaSigma AldrichA7250-5G
NiacinamidaSigma AldrichN0636-100G
NogginPeproTech120-10C-20
NormocinaInvivoGenANT-NR-1
Meio de cultura organoideReagentes preparados internamenteN/AComposição fornecida no manuscrito
Inibidor de P38MCEHY-10295 
Penicilina-EstreptomiaGibco15140122
Prostaglandina E2MCEHY-101952 
Inibidor de quinase associada à rho Célula-tronco72304
RPMI 1640HyCloneSH30809.01B
R-spondin 1PeproTech120-38-20UG
Preenchimentos de pipeta S1Termo Científica9501
Pipeta SerológicaBIOFILGSP-010-050
Pipeta de canal únicoEppendorf3123000063
Pipeta de canal únicoEppendorf3123000055
Pipeta de canal únicoEppendorf3123000098
Pipeta de canal únicoEppendorf3123000022
Bisturi Descartáveis EstéreisTech-SSSD10
SYTOX GreenBeyotimeC1181S
TexMACS MédioMiltenyi Biotec130-097-196
Tanque de água do termostatoBluepardBWS-10
Trippan BluePhygenePH0519
TrypLE ExpressGibco12605028
β-mercaptoetanolGibco21985023

Referências

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