Artigo de método

Uma Estrutura Genômica Estratificada para a Previsão do Sorótipo de Salmonella : Avaliação de MLST, SeqSero, SeqSero2, SeqSero2S e SISTR no Sudoeste da China

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DOI:

10.3791/69117

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9 de janeiro de 2026

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1West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, Sichuan University, 2College of Pharmacy, Youjiang Medical University for Nationalities, 3Chengdu Center for Disease Control and Prevention (Chengdu Institute of Health Supervision), 4Sichuan Provincial Centre for Disease Control and Prevention, 5Department of Laboratory Medicine and Port Epidemic Disease Monitoring Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan International Travel and Healthcare Center (Chengdu Customs District Port Clinic), 6Health Promotion and Food Nutrition & Safety Key Laboratory of Sichuan Province, 7Innovation Center of Nursing Research and Nursing Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Esse protocolo estabelece um fluxo de trabalho genômico estratificado para a previsão do sorótipo de Salmonella , utilizando MLST ou SeqSero2S para vigilância rotineira, SISTR com MLST do genoma central para detecção de surtos, e SeqSero2S para triagem rápida. O protocolo foi validado por meio de uma análise multicêntrica para aprimorar a vigilância na China.

Resumo

A sorotipagem precisa da Salmonella é essencial para uma vigilância eficaz e investigação de surtos, pois a diversidade de sorótipos impacta diretamente a patogenicidade e a avaliação de riscos à saúde pública. No entanto, os métodos convencionais de aglutinação por lâminas são limitados por baixa reprodutibilidade, intensidade de trabalho e altos custos, o que dificulta sua aplicação em programas de monitoramento de alta produtividade. Para enfrentar essas limitações, desenvolvemos e validamos um fluxo de trabalho genômico integrando Multilocus Sequence Typing (MLST), o Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR), SeqSero, SeqSero2 e SeqSero2S para a predição de sorótipos usando dados de sequenciamento do genoma inteiro. Esse protocolo foi avaliado por meio de uma análise multicêntrica de 315 isolados de Salmonella coletados de fontes alimentares e humanas no sudoeste da China. Os resultados deste estudo demonstraram concordância significativamente maior entre abordagens genômicas (até 100%/99,1%/90,1% no conjunto de treinamento e 100%/97,1%/93,1% no conjunto de validação para SISTR/MLST/SeqSero2S, respectivamente) em comparação com a sorotipagem tradicional. O fluxo de trabalho inclui recomendações para selecionar métodos de predição adequados baseados no contexto de vigilância, enfatizando MLST e SeqSero2S para monitoramento rotineiro, SeqSero2S para triagem rápida e SISTR com MLST genômico central para investigações de surtos. Essa abordagem facilita a integração da sorotipagem genômica na prática de saúde pública, reduzindo a dependência da sorologia tradicional e melhorando a reprodutibilidade e escalabilidade nos programas de monitoramento de Salmonella .

Introdução

A salmonela está entre os patógenos transmitidos por alimentos mais significativos ao mundo, causando morbidade e mortalidadesubstanciais 1,2. Na China, continua sendo uma das principais causas de doenças transmitidas por alimentos, com um número limitado de sorotipos representando a maioria dasinfecções 3. A identificação precisa dos sorótipos é crucial para vigilância e investigações de surtos, pois a diversidade sorotípica está intimamente correlacionada com a patogenicidade e o risco à saúde pública. Isso é bem reconhecido em sorótipos comuns como Salmonella enteritidis e Salmonella typhimurium, mas alguns sorótipos menos estudados, como Salmonella Panama, também são uma causa significativa de disseminação global e doençainvasiva 4, destacando a necessidade geral de capacidades robustas de sorotipagem. Os métodos tradicionais de sorotipagem, há muito reconhecidos como o padrão ouro, são processos demorados e de alto custo que requerem mais de 150antissoros 5. Eles são ainda limitados por baixa reprodutibilidade6, fluxos de trabalhointensivos 7 e variabilidade inerente devido à interpretação subjetiva das reaçõesde aglutinação 8, tornando-os inadequados para programas de monitoramento de alta taxa9.

O advento do sequenciamento do genoma inteiro (WGS) transformou a caracterização de patógenos ao permitir uma previsão rápida e de alta resolução de sorótipos 10,11,12. Várias ferramentas in silico foram desenvolvidas, incluindo Multilocus Sequence Typing (MLST), SeqSero13, SeqSero214, SeqSero2S15 e o Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR)7,15. Enquanto o MLST oferece rastreamento epidemiológico padronizadoe de longo prazo 16, SeqSero2 e SeqSero2S permitem análise direta a partir de leituras brutas e facilitam a triagem de alto débito dos sorótiposcomuns 14,15. Por outro lado, o SISTR requer genomas montados, mas integra a detecção de genes de antígeno com a tipagem de sequência multilocus genômica central (cgMLST), proporcionando resolução abrangente para investigações desurtos 17. Embora a caracterização baseada em WGS por Salmonella seja cada vez mais adotada como evidência primária naspesquisas 16,18,19, sua aplicação em vigilância em larga escala permanece limitada, uma lacuna parcialmente atribuída a considerações práticas não abordadas que influenciam a adequação dos métodos. Uma pesquisa global revelou que apenas 8% dos laboratórios participantes utilizam WGS para vigilância rotineira, sendo a complexidade analítica uma das principaisbarreiras 20. Por exemplo, a previsão confiável de sorótipos depende de profundidade adequada de sequenciamento (tipicamente >75× para custo-efetividade, idealmente ~200× para análise de alta qualidade) e montagens genômicas de alta qualidade (N50 de contigs > 30 kbp como mínimo econômico, preferencialmente >100 kbp), especialmente para ferramentas dependentes de montagem comoSISTR 21, 22, 23. Além disso, a seleção de ferramentas deve estar alinhada com os recursos computacionais e a expertise do laboratório: ferramentas de código aberto como o SeqSero2S oferecem alternativas mais rápidas para triagem rápida ao analisar leituras brutas e contornar a montagem15 computacionalmente intensiva, enquanto laboratórios com capacidade limitada em bioinformática podem ter dificuldades com análise e armazenamento de dados. Consequentemente, existem dados insuficientes para determinar se os testes sorológicos podem ser reduzidos em vigilância em largaescala 20,24, destacando assim a necessidade de abordagens adaptativas aos recursos. Notavelmente, após a pandemia de COVID-19, há uma quantidade substancial de instrumentos de sequenciamento ocioso e qPCR em vários níveis de instituições de saúde, apresentando uma oportunidade para reaproveitar essa capacidade para a vigilância genômica.

Para suprir essa lacuna, realizamos uma avaliação multicêntrica das ferramentas de sorotipagem genômica mencionadas acima usando 315 isolados de Salmonella coletados de fontes alimentares e humanas no sudoeste daChina 25,26. Com base nesses achados, desenvolvemos um fluxo de trabalho estratificado que leva em conta os diferentes recursos laboratoriais e necessidades de vigilância, fornecendo critérios claros para a seleção de ferramentas em diferentes contextos. Essa estrutura prioriza o SeqSero2S para triagem rápida e o SISTR combinado com o cgMLST para investigações de surtos, facilitando assim a adoção de abordagens genômicas e reduzindo a dependência dos métodos tradicionais de sorotipagem. Aqui, descrevemos cada etapa do fluxo de trabalho em detalhes, incluindo identificação de isolamentos, sequenciamento, análise de dados e critérios para selecionar ferramentas de previsão em diferentes contextos de vigilância.

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Protocolo

A coleta e o manuseio de amostras fecais humanas foram realizados sob aprovação do Comitê de Ética do Quarto Hospital da China Ocidental, Universidade de Sichuan (Número de Protocolo: HXSY-EC-2022093), de acordo com a Declaração de Helsinque e Boas Práticas Clínicas. O consentimento informado foi dispensado de acordo com as regulamentações nacionais de saúde pública.

NOTA: Todos os procedimentos envolvendo culturas vivas de Salmonella e amostras de fezes humanas devem ser realizados em um laboratório de Biossegurança Nível 2 (BSL-2) por pessoal treinado em práticas microbiológicas padrão e procedimentos de biossegurança. Use equipamentos de proteção individual (EPI) adequados o tempo todo, incluindo jaleco, luvas e óculos de proteção. Desinfete e troque as luvas contaminadas regularmente. Descontamine todas as superfícies de trabalho antes e depois dos experimentos com um desinfetante adequado (por exemplo, 70% etanol, 1% hipoclorito de sódio). Descontamine todos os resíduos líquidos e sólidos contendo materiais biológicos por autoclavagem (por exemplo, a 121 °C por pelo menos 30 minutos) antes do descarte. Evite a geração de aerossóis e respingos. Realize todos os procedimentos que possam criar aerossóis (por exemplo, centrifugação, agitação vigorosa) dentro de um gabinete certificado de segurança biológica.

1. Coleta de amostras de alimentos e identificação de cepas

  1. Colete amostras de alimentos em mercados varejistas ou instalações de processamento. Isole Salmonella de amostras de alimentos de acordo com a norma nacional de segurança alimentar GB 4789.4 e os protocolos de confidencialidade do Programa de Vigilância de Doenças Transmitidas por Alimentos.
  2. Pré-enriquecimento:
    1. Pese exatamente 25 g de cada amostra de alimento. Adicione 225 mL de Água Peptônica Tamponada (BPW) à amostra (razão de diluição 1:10) e vórtice por 30 s para garantir a homogeneização e submersão completas.
    2. Incube a amostra em BPW a 36°C ± 1°C por 8-18 horas em uma incubadora agitada ajustada para 150 rpm.
      NOTA: O pré-enriquecimento em caldo não seletivo aumenta significativamente a carga de patógenos. Manuseie todos os materiais subsequentes (recipientes, pipetas, etc.) como altamente contagiosos.
  3. Enriquecimento seletivo: Após o pré-enriquecimento, transfira 1 mL da amostra para o Caldo Tetrationato (TTB). Incube o TTB a 42 °C por 18-24 horas sem agitação.
  4. Isolamento: Após a incubação, estrie a cultura enriquecida nas seguintes placas seletivas de ágar: ágar Hektoen Entérico (HE), Ágar de Lisina Desoxicolado de Xylose (XLD) e CHROMagar Salmonella. Incube as placas a 36 °C por 18-24 horas.
    NOTA: Ao riscar placas, tenha cuidado para evitar criar aerossóis e contaminação cruzada. No ágaro HE, as colônias presumidas de Salmonella normalmente aparecem de cor azul-esverdeada a azul, com ou sem centros pretos. O ágar ao redor pode adquirir um tom esverdeado semelhante. No ágar XLD, as colônias presumidas de Salmonella são tipicamente vermelhas com centros pretos. No CHROMagar, as colônias presumidas de Salmonella são caracterizadas por sua cor de magenta a malva, conforme especificado pelo fabricante. Em cada placa seletiva, espere colônias bem isoladas após 18-24 horas de incubação. Placas crescidas demais (>300 colônias) podem precisar de diluição e re-estriamento.
  5. Identificação: Examine as placas em busca de colônias suspeitas de Salmonella . Identifique cepas suspeitas usando um sistema automatizado de identificação com cartão de identificação Gram-negativo (GN), seguindo as instruções do fabricante para análise.
    NOTA: Certifique-se de que os números de lote dos cartões GN sejam válidos e dentro da data de validade.
    1. Prepare uma suspensão bacteriana a partir de colônia pura até a turbidez especificada (0,50-0,63 segundo o padrão McFarland) usando solução salina de 0,45%.
    2. Coloque a suspensão na placa GN e faça o teste. Certifique-se de que o sistema esteja configurado para incubar automaticamente a placa a 35,0 °C ± 2,0 °C e monitore reações bioquímicas por até 8 horas.
    3. Aceite um resultado de Salmonella enterica ssp. enterica com ≥ de probabilidade de 95% e índice de confiança excelente .
  6. Sorotipagem: Retire colônias individuais da placa de ágar do enxame após incubação durante a noite a 37 °C. Realize testes de aglutinação com lâminas para detectar antígenos O e antígenos H. Use kits de antissoro para Salmonella disponíveis comercialmente (veja Tabela de Materiais) para testes.

2. Coleta de amostras humanas e identificação de cepas

NOTA: Para o isolamento de Salmonella de amostras fecais humanas, siga os protocolos de confidencialidade do Programa de Vigilância de Doenças Transmitidas por Alimentos.

  1. Colheição: Colete aproximadamente 2 g de amostras de fezes humanas recém-vazadas. Coloque as amostras fecais em recipientes limpos, secos e de boca larga. Transporte as amostras fecais para o laboratório em até 1 hora usando caixas de transporte isoladas para manter a integridade da amostra.
    ATENÇÃO: Amostras fecais humanas podem conter múltiplos patógenos além da Salmonella. Manusear todas as amostras como potencialmente infecciosas e seguir as precauções padrão para o manuseio de materiais de risco biológico.
  2. Inoculação: Inocule as amostras fecais coletadas diretamente nas seguintes placas seletivas de ágar: CHROMagar Salmonella, ágar Salmonella-XLD e ágar Shigella (SS).
    NOTA: Consulte o passo 1.4 para a morfologia característica da colônia em CHROMagar Salmonella e ágar XLD. No ágar SS, as colônias presumidas de Salmonella normalmente aparecem incolores, opacas ou bege com centros pretos. O ágar em si permanece relativamente inalterado.
  3. Identificação: Identificar colônias suspeitas de Salmonella conforme descrito no passo 1.5.
  4. Sorotipagem: Realize a sorotipagem por aglutinação por slide, conforme descrito no passo 1.6.

3. Preparação de bibliotecas e sequenciamento do genoma completo

  1. Cultura bacteriana: Streak Salmonella em LB agar, incubar a 37 °C por 12 horas. Escolha uma colônia, inocule em caldo de 200 mL LB e agite a 150 rpm (37 °C, 12 horas). Centrifuge a 12.000 × g por 10 minutos para colher as células.
    NOTA: Realize todas as etapas da centrifugação com rotores ou copos de segurança selados para evitar a geração de aerossols.
  2. Extração de DNA: Extraia DNA genômico usando um kit comercial de extração de DNA (veja Tabela de Materiais), seguindo o protocolo do fabricante.
    ATENÇÃO: Os reagentes em kits comerciais de extração de DNA (por exemplo, tampões de lise, proteinase K) podem ser prejudiciais se inalados ou em contato com pele e olhos. Realize a extração em uma exaustão ou armário de segurança biológica se forem usados reagentes voláteis, e use o EPI adequado.
  3. Avaliação da qualidade do DNA: Purificar o DNA genômico e quantificar usando um fluorômetro com o Kit de Ensaio de Alta Sensibilidade dsDNA. Verifique a integridade do DNA por eletroforese em um gel de agarose a 1% a 100 V por 45 minutos; DNA de alta qualidade aparece como uma única banda compacta >20 kbp com um mínimo de borrãode 27.
    NOTA: (Passo crítico) DNA genômico de alta qualidade e alto peso molecular (com razão A260/A280 de ~1,8-2,0) é crucial para a preparação e sequenciamento bem-sucedidos da biblioteca.
    ATENÇÃO: Os corantes de coloração de ácidos nucleicos usados na eletroforese em gel de agarose (por exemplo, GelRed, Brometo de Etídio) são mutagenênicos. Sempre use luvas ao manusear géis e soluções de mancha, e descarte-as conforme as regulamentações institucionais de resíduos perigosos.
  4. Fragmentação do DNA: Fragmente aproximadamente 150 ng de DNA genômico qualificado para um tamanho médio de ~350 pb usando um sistema de ultrassonização focada, conforme o protocolo do fabricante.
  5. Construa a biblioteca de sequenciamento a partir dos fragmentos de DNA cortados usando um kit comercial de preparação de biblioteca (veja Tabela de Materiais). Realizar o reparo final e a fosforilação 5'-dos fragmentos de DNA cisalhados. Depois, adicione uma base 'A' nas extremidades de 3' e ligue os adaptadores de sequenciamento indexados.
  6. Amplifique e enriqueça os fragmentos de DNA ligados por adaptador por meio de um programa de PCR de ciclo limitado, conforme especificado no kit.
  7. Qualifique e quantifique a biblioteca final usando métodos como fluorometria e eletroforese capilar.
  8. Realizar sequenciamento em extremidades pareadas (2 × 150 bp) em uma plataforma de sequenciamento seguindo os procedimentos operacionais padrão.

4. Análise de dados

  1. Controle de qualidade dos dados brutos de sequenciamento: Realizar o controle inicial de qualidade dos arquivos FASTQ brutos usando fastp (versão 0.23.0) com parâmetros padrão. O objetivo é remover sequências de adaptadores e leituras de baixa qualidade, gerando assim dados limpos do FASTQ para análise posterior.
  2. Monte as leituras filtradas de alta qualidade em genomas rascunhos usando SPAdes (versão 3.15.0) com a opção cuidadosa de reduzir descompassos e indelscurtos 26.
  3. Utilize as sequências genômicas (arquivos FASTQ/FASTA) como entrada para as diversas previsões de sorotipos.
    1. Para MLST, importe o arquivo FASTQ para o software BioNumerics (versão 7.6).
      1. Na janela de Importar Modelo , clique em Editar análise sintática em opções avançadas. Defina a string de análise de dados e a decoração de dados para [DATA]. Aplique as expressões regulares DATA]_* e [DATA] para análise de nomes de arquivo. Salve o modelo, selecione e clique em Próximo e depois em Finalizar. Confirme o envio na janela Enviar Tarefa para enviar dados. A ferramenta CEStoreUploader será aberta automaticamente para transferir dados brutos do WGS para o motor de cálculo.
      2. Selecione a entrada do genoma após o upload. Navegue até as Ferramentas WGS e selecione "TraNetGenotype" para previsão automática de ST. Na caixa de diálogo TraNetGenotype , selecione Salmonella como tipo de cepa, selecione Análise de Sorotipo, Análise de Virulência e Análise de Suscetibilidade Antimicrobiana e clique em Sim.
    2. Para SISTR (versão 1.1.3; https://github.com/phac-nml/sistr_cmd; Parâmetros: todos os parâmetros são padrão), abra um terminal e navegue até o diretório contendo o arquivo genômico montado assembly.fasta.
      1. Execute o seguinte comando para realizar a previsão de serovar e gerar um relatório abrangente em formato CSV: sistr --qc --alleles-output allele-results.json --cgmlst-profiles cgmlst-profiles.csv -f tab -o sistr-output.tab -i assembly.fasta. Esse comando gera um relatório contendo o serovar previsto.
        NOTA: -qc: Realiza verificações de controle de qualidade na montagem. -i assembly.fasta: Especifica o arquivo FASTA de entrada. -f csv: Define o formato de saída como CSV. -o sistr_results: Define o nome base para o arquivo de saída (por exemplo, sistr_results.csv). -p 4: Usa 4 threads de CPU para análise e acelerar o cálculo. --alleles-output: salva sequências de alelos e informações em um arquivo JSON. --cgmlst-profiles: exporta perfis de alelos cgMLST para um arquivo CSV.
    3. Para SeqSero (versão 1.0; https://github.com/denglab/SeqSero; Parâmetros: todos os parâmetros são padrão), navegue até o diretório que contém o arquivo de dados de entrada. Execute o seguinte comando com parâmetros padrão para análise: python SeqSero.py -m 4 -i assembly.fasta. A ferramenta cria um diretório de saída contendo o arquivo Seqsero_result.txt com o sorotipo previsto.
      NOTA: -m 4 especifica o tipo de entrada como montagem do genoma. -i define o arquivo FASTA de entrada.
    4. Para o SeqSero2 (versão 1.3.1; https://github.com/denglab/SeqSero2; Parâmetros: todos os parâmetros são padrão). Execute o seguinte comando: python3 SeqSero2_package.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. A ferramenta envia o sorotipo previsto diretamente para a tela do terminal ao ser concluído. A saída fornece o sorotipo previsto.
      NOTA: -m k: especifica um fluxo de trabalho baseado em k-mer para a predição rápida de sorótipos usando k-mers únicos de determinantes de sorotipo. -t 4: indica o tipo de entrada como sequências montadas.
    5. Para o SeqSero2S (versão 1.1.1; https://github.com/denglab/SeqSero2S; Parâmetros: todos os parâmetros são padrão): Execute usando o script fornecido: python SeqSero2S.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. A saída fornece o sorotipo previsto.
      NOTA: -m k permite a análise baseada em k-mer de leituras brutas ou montagens genômicas. -t 4 especifica entrada de sequência montada.

5. Parâmetros críticos e considerações práticas

NOTA: As considerações a seguir são cruciais para a implementação bem-sucedida desse fluxo de trabalho genômico, especialmente em ambientes com recursos limitados.

  1. Verifique se os dados brutos de sequenciamento alcançam uma profundidade de cobertura suficiente. Uma profundidade de sequenciamento de aproximadamente 100x é tipicamente suficiente para análise de alta qualidade.
    NOTA: Para laboratórios que priorizam a relação custo-efetividade, recomenda-se uma profundidade mínima de sequenciamento de 75x como um limiar prático inferior para a predição confiável dos sorótipos usando MLST ou SeqSero221.
  2. Confirme que a qualidade das leituras brutas é alta, com um Q30 score (precisão base de chamada de 99,9%) tipicamente acima de 90%.
  3. Avalie a qualidade da montagem do genoma de novo antes de prosseguir com ferramentas de previsão de sorótipos que exigem contigs montados. Use a estatística N50 como métrica chave.
    NOTA: Recomenda-se um N50 de pelo menos 100 kbp22, enquanto um N50 maior que 30 kbp deve ser considerado o requisito mínimo para análiseconfiável 23.
  4. Verifique a completude da montagem garantindo uma taxa de mapeamento de leitura de pelo menos ≥98% quando as leituras filtradas forem mapeadas de volta ao genoma montado.

6. Protocolo recomendado de previsão de sorótipo para vigilância de salmonela de alta taxa

NOTA: Selecione métodos de predição de sorótipo com base no contexto de vigilância, precisão exigida e recursos laboratoriais disponíveis. Para vigilância de alta taxa de Salmonella , siga o protocolo abaixo:

  1. Identificação Preliminar: Realizar a triagem inicial de acordo com o GB 4789.4 para confirmar isolados como espécies de Salmonella .
    NOTA: Neste estágio, não é necessário identificar o sorotipo específico dos isolados.
  2. Vigilância rotineira (modo de alta produtividade): Para vigilância rotineira, já que o BioNumerics não é mais atualizado, utilize MLST28, SeqSero2S ou outras plataformas de análise genômica validadas e amigáveis ao usuário, que recebam suporte técnico contínuo e atualizações.
    NOTA: Para MLST: O esquema de 7 genes oferece um perfil padronizado, portátil e filogeneticamente informativo (Tipo de Sequência, ST) ideal para epidemiologia de longo prazo e comparação global de cepas. Sua simplicidade garante uma análise rápida e um mínimo de carga computacional. Para o SeqSero2S: oferece a dupla vantagem de uma predição rápida de sorótipos e resultados integrados do MLST em uma única execução. Ele pode analisar diretamente as leituras de sequenciamento bruto, contornando a montagem do genoma para economizar tempo e recursos. Mesmo com dados FASTA montados, ele é mais rápido do que ferramentas como o SISTR, pois realiza a previsão de sorótipo de forma independente, sem depender de análise computacional.
  3. Triagem rápida (Ambientes sensíveis ao tempo): Para resultados rápidos ou em laboratórios com capacidade computacional limitada, use o SeqSero2S para a predição preliminar do sorotipo.
    NOTA: Ao realizar previsões de SeqSero2S, basicamente recomenda-se interpretar "I_4,[5],12:i:-" como Salmonella Typhimurium.
  4. Investigação de surtos (modo de alta precisão): Para rastreamento de surtos que requer alta resolução, use o SISTR, que utiliza cgMLST para complementar a previsão de sorótipos e fornecer análise de cluster de alta resolução para rastreamento de fontes.
  5. Controle de qualidade e confirmação de resultados inconsistentes:
    1. Para cepas do tipo sequenciamento comuns, realize verificação aleatória. Para os não comuns, use uma taxa de verificação de 20%. Em casos de resultados de sorotipagem inconsistentes, encaminhe os isolados para um laboratório de nível superior ou de referência para obter um resultado definitivo.
    2. Para análise confirmatória, utilize múltiplos métodos validados, incluindo: análise genômica repetida com pelo menos duas ferramentas diferentes de previsão in silico ; repetido in silico com pelo menos duas ferramentas diferentes; contextualização filogenética usando métodos baseados em WGS de alta resolução (por exemplo, cgMLST ou análise SNP do genoma inteiro)29.
    3. Atribua o sorótipo final com base no consenso dessa evidência abrangente.
      NOTA: A razão de verificação recomendada de 20% para sorótipos não comuns baseia-se na observação de que as ferramentas genômicas mantêm alta concordância (93,3% para SISTR vs. MLST, 95,0% para SISTR vs. SeqSero2S) mesmo entre sorótipos não comuns (Tabela 1). Esse limiar é econômico e oferece uma margem de segurança suficiente para detectar a baixa frequência de discrepâncias entre ferramentas genômicas na vigilância rotineira.

7. Análise estatística

  1. Realize análise de dados usando o software R (versão 4.1.2).
  2. Apresente variáveis categóricas como frequências com percentuais.
  3. Compare grupos usando testes χ2 para dados categóricos30, considere um valor P <0,05 como estatisticamente significativo.

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Resultados

O protocolo foi validado usando 315 isolados de Salmonella do sudoeste da China, com 213 isolados (2/3) servindo como conjunto de treinamento para comparar cinco métodos de predição de sorótipos baseados em WGS (MLST, SISTR, SeqSero, SeqSero2 e SeqSero2S) com resultados convencionais de sorotipagem, enquanto os 102 isolados restantes (1/3) foram usados como conjunto de validação para avaliar o desempenho do MLST, SISTR e SeqSero2S.

Análise do ...

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Discussão

Esta avaliação em larga escala, abrangendo 315 isolados de Salmonella do sudoeste da China, demonstra a reprodutibilidade superior dos métodos de sorotipagem baseados em WGS em comparação com abordagens convencionais (84,1% vs. 62,9% de cobertura, P<0,001). Nossas descobertas validam um fluxo de trabalho genômico abrangente onde etapas iniciais críticas de preparação da amostra e controle de qualidade do DNA (seções 1-3) impactam diretamente a confiabilidade a jusante. O protoco...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado por subsídios do Tibet and Sichuan Science and Technology Bureau Funding (XZ202301ZY0049G, 2024NSFSC0563 para H.Z. e 2024NSFSC0033 para X.P.), Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2024JDRC0032 a Y.X.), o Projeto do Instituto de Saúde de Nova Produtividade (HN240302C a H.Z.), o Projeto de Revitalização de Disciplinas de Ciências Laboratoriais de Saúde Pública (2023SY-04 a H.Z.), Escola de Saúde Pública da China Ocidental/Hospital Quarto da China Ocidental, Universidade de Sichuan.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BioNumerics (versão 7.6)Matemática Aplicadahttps://bionumerics.software.informer.com/7.6/MLST/previsão de sorotipo/análise filogênica
CHROMagar SalmonellaBecton, Dickinson e Companhia214983Meio cromogênico seletivo de Salmonella
Fastp (versão 0.23.0)Código abertohttps://github.com/OpenGene/fastpLeia controle de qualidade
Sistema de Sequenciamento Illumina NovaSeq 6000Illumina20012850Plataforma de sequenciamento do genoma completo
Ultrasonicador focado M220Covaris500295Cisalhamento de DNA
Kit Rápido de DNA para Magbeads para SoloMP BiomédicosMP116560200Kit de extração de DNA genômico
Microsoft Excel 2016MicrosoftKB5002794Gerenciamento de dados
Kit Rápido de DNA-Seq NEXTFLEXRevvity50-255-1124Preparação de bibliotecas de sequenciamento
Fluorômetro Qubit 2.0Thermo Fisher ScientificQ32866Quantificação do DNA
Kit de Ensaio de Alta Sensibilidade dsDNA QubitThermo Fisher ScientificQ32851Quantificação do DNA
R (versão 4.1.2)Fundação Rhttps://www.r-project.org/Computação estatística
Kit Antissoro contra SalmonelaInstituto do Soro Statens60898Detecção de antígeno O/H
SeqSeroCódigo abertohttps://github.com/denglab/SeqSeroPrevisão de sorótipo
SeqSero2Código abertohttps://github.com/denglab/SeqSero2Previsão de sorótipo
SeqSero2SCódigo abertohttps://github.com/denglab/SeqSero2sPrevisão de sorótipo
SISTRCódigo abertohttps://github.com/phac-nml/sistr_cmdPrevisão de sorótipo
SPAdes (versão 3.15.0)Código abertohttps://github.com/ablab/spadesMontagem do genoma
Ágar de enxameBD em Biociências211519Usado para sorotipagem incubação
TBS-380 FluorômetroTurner BioSystemsP/N 3800-003Quantificação do DNA
Sistema Compacto VITEK 2BioMé rieux95061-768Sistema automatizado de identificação microbiana

Referências

  1. GBD 2017 Non-Typhoidal Salmonella Invasive Disease Collaborators. The global burden of non-typhoidal Salmonella invasive disease: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Infect Dis. 19 (12), 1312-1324 (2019).
  2. Selim, S. A. A comprehensive review of antibiotic susceptibility patterns in strains isolated from food. J Pure Appl Microbio. 19 (2), 818-833 (2025).
  3. Shen, Y., et al. Genomic investigation of Salmonella enterica serovar Welikade from a pediatric diarrhea case first time in Shanghai, China. BMC Genomics. 25 (1), 604(2024).
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