Produção eficiente de células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) com transgenes superiores a 10 kb usando vetores lentivais

Resumo

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho otimizado para produzir células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) com transgenes grandes que ultrapassam 10 kb usando vetores lentivirais.

Resumo

A engenharia de múltiplos receptores em células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) surgiu como uma estratégia poderosa para prevenir recaídas antigênicas negativas e reduzir toxicidades on-target/fora do tumor. No entanto, a fabricação de células T CAR multi-receptores continua sendo desafiadora, pois aumentar o tamanho dos transgenes lentivirais reduz significativamente os títulos virais e as taxas de transdução das células T. Os fluxos de trabalho atuais de produção frequentemente dependem da separação de células para enriquecer células T transduzidas a partir de produções de baixo rendimento. No entanto, as técnicas de separação de células não aumentam o número absoluto de células T CAR e adicionam ainda mais complexidade ao já elaborado processo de fabricação. Consequentemente, essas limitações dificultam a tradução clínica das células CAR T multirreceptoras e restringem o desenvolvimento de imunoterapias de próxima geração.

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho detalhado e passo a passo, otimizado para gerar células CAR T com grandes transgenes lentivirais. Usando esse fluxo de trabalho, demonstramos aumentos dependentes do tamanho na eficiência da transdução em uma variedade de tamanhos de transgenes, com o aumento mais pronunciado de até 14,8 vezes observado para um vetor lentiviral de 10,1 kb. Importante, o fluxo de trabalho suporta uma expansão robusta de células T e elimina a necessidade de ordenação de células. Ao superar as limitações de tamanho da corrente na transferência gênica lentiviral, esse fluxo de trabalho possibilita a geração eficiente de células CAR T multirreceptoras, facilitando assim o desenvolvimento de imunoterapias avançadas.

Introdução

As células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) revolucionaram o campo da imunoterapia. No entanto, apesar do sucesso notável, desafios críticos permanecem, incluindo a imunossupressão mediada pelo microambiente tumoral (TME), recaídas tumorais antigênicos-negativas e toxicidades on-target/^{off-tumor 1,2}. A engenharia de células T CAR com múltiplos receptores sintéticos, como CARs duplas, construtos combinados de CAR e TCR, ou receptores de comutador de citocinas, tem potencial para superar esses^{obstáculos 3,4}. Nos cânceres de sangue, equipar as células T efetoras com duplos CARs permite o direcionamento simultâneo de dois antígenos distintos, como CD19 e CD20⁵, reduzindo assim o risco de fuga de antígenos tumorais. Em tumores sólidos, as toxicidades on-target/off-tumor podem ser mitigadas incorporando, por exemplo, circuitos sintéticos de receptores Notch (synNotch) que permitem a expressão de CAR dependente de lógica e aumentam a precisão de mira 6,7,8,9,10,11,12,13 . No entanto, a produção de células CAR T que carregam múltiplos receptores continua desafiadora devido ao aumento subjacente no tamanho do transgene. Vetores lentivirais de terceira geração auto-inativadores derivados do vírus da imunodeficiência humana (HIV) tipo 1 são o atual padrão ouro para a produção de células CAR T em escala de pesquisa e^{clínica 14}. Para gerar células T CAR, vetores lentivirais são projetados com de expressão CAR personalizados, ladeados por sequências longas de repetição terminal (LTR), que mediam a integração no genoma das células T. A capacidade máxima efetiva de embalagem (EPC) dos vetores lentivirais atuais é de aproximadamente 9,2 kilobases (kb) de LTR para LTR, correspondendo ao tamanho genômico nativo do HIV-1. À medida que os títulos lentivirais diminuem semi-logarítmicamente com o aumento do comprimento do^{vetor 15}, a engenharia de transgenes grandes com múltiplos receptores reduz drasticamente os rendimentos de produção lentiviral e, em última análise, impede a fabricação de células CAR^{T 16}. Embora técnicas de separação celular, como a separação de células ativadas por magnetismo ou fluorescência (MACS ou FACS, respectivamente), possam ser usadas para enriquecer células T CAR a partir de produções de baixo rendimento, esses métodos não aumentam o número absoluto de células T CAR e adicionam ainda mais complexidade a um processo de fabricação já elaborado. Como resultado, os desafios de fabricação de células CAR T com grandes transgenes lentivirais continuam sendo uma grande barreira tanto para a pesquisa pré-clínica quanto para a aplicação clínica.

Recentemente, estabelecemos um fluxo de trabalho de produção de células CAR T otimizado para células T efetoras que carregam grandes transgenes lentivirais, como o sistema synNotch (svsNotch) de vetor^{único 17}. Aqui, detalhamos a metodologia em um protocolo passo a passo para facilitar sua adoção ampla. Como prova de conceito, demonstramos melhorias dependentes do tamanho na eficiência da transdução entre tamanhos de transgenes lentivirais que variam de 5,7 kb a 9,2 kb e 10,1 kb. No geral, esse fluxo de trabalho otimizado aumenta as taxas de transdução em até 14,8 vezes, eliminando assim a necessidade de separação celular e permitindo a geração eficiente de células T efetoras com tamanhos de transgene superiores a 10 kb.

Protocolo

As células T humanas foram obtidas pelo Núcleo de Imunologia Humana da Universidade da Pensilvânia, que opera sob princípios de Boas Práticas de Laboratório com procedimentos operacionais padrão estabelecidos e/ou protocolos para recebimento de amostras, processamento, congelamento e análise que estão em conformidade com as diretrizes éticas da MIATA e da Universidade da Pensilvânia.

NOTA: Uma visão geral esquemática do fluxo de trabalho otimizado para a produção de lentivírus e células T CAR é mostrada na Figura 1. Uma comparação dos passos-chave de otimização com o fluxo de trabalho padrão atual é resumida na Tabela 1. Todas as culturas celulares foram mantidas a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de_CO-2 , utilizando Meio de Células T (MTC) composto por RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado por calor (FBS), 10 mM de tampão HEPES, 2 mM de L-alanil-L-glutamina (veja Tabela de Materiais), 100 U/mL de penicilina e 100 U/mL de estreptomicina.

Figura 1: Fluxo de trabalho otimizado para produção de lentivírus e células CAR T com transgenes grandes. Representação esquemática da produção de lentivírus (em cima) e geração de células CAR T (em baixo), destacando etapas e otimizações principais que aprimoram os títulos virais e a eficiência da transdução. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

		Fluxo de trabalho padrão	Fluxo de trabalho otimizado
Vírus	Envelope viral	VSV-G	Cocal-G
	Transfecção	L2000	L30001
	Colheita de LV	24 h2 + 48h 2	30-36 h3
T-célula	Embarcação	Frasco T25	Placa inferior plana de 96 poços
	Relação superfície/volume	Variável	5,12 cm2/mL4
	Adjuvante	Nenhum	SF1085
13 μL L3000 por 1 μg de DNA, sem alteração no meio
2centrifugação a 106.800 x g para 2,5 h, tubo de fundo arredondado
3centrifugação a 12.300 x g durante a noite, tubo cônico de fundo
4Suplementação adicional de mídia após transdução
555 μg/mL

Tabela 1: Comparação entre fluxos de trabalho padrão e otimizados. Otimizações importantes do fluxo de trabalho aprimorado em comparação com o fluxo de trabalho padrão atual. Esta tabela foi adaptada com permissão de Rommel et ^al.17.

1. Produção de lentivírus

1. Manutenção das células HEK293T
   1. Certifique-se de HEK293T células distribuídas uniformemente, livres de aglomerados e com confluência de 50-70% (rendimento típico: 1,0-1,5 × 10⁷ células por frasco T150).
   2. Aspire o sobrenadante, adicione 20 mL de PBS em temperatura ambiente (RT) na parte superior do frasco para evitar deslocar as células, gire suavemente PBS sobre as células e aspire o wash.
   3. Adicione 3 mL de Tripsina-EDTA 0,05% e incube por 15-30 s em RT enquanto inclina o frasco de um lado para o outro. Monitore o destacamento da célula.
   4. Adicione 7 mL de MTC fria, ressuspenda as células contra o fundo do frasco para gerar uma suspensão de célula única e transfira para um tubo de 50 mL. Lave o frasco com 10-20 mL de TCM frio e adicione o lavador ao mesmo tubo.
   5. Centrifuge as células (300 × g, 5 min, 4 °C), aspire o sobrenadante, resuspenda 10 mL de MTC e conte as células.
   6. Placas HEK293T células em frascos T150 a 3 × 10,⁶ células por frasco para passagem a cada 2 dias (por exemplo, segunda e quarta-feira) ou a 1 × 10^{6 células por} frasco para passagem a cada 3 dias (por exemplo, placagem na sexta-feira para passagem no fim de semana) usando 30 mL de MTC pré-aquecido a 37 °C.
2. Transfecção de células HEK293T para produção de lentivírus
   NOTA: Realize um pequeno experimento piloto para determinar a densidade de semeadura que consistentemente produz uma confluência de 70-80% após 2 dias. Certifique-se de que HEK293T confluência celular não exceda 80% no momento da transfecção (veja Discussão). A transfecção foi otimizada usando meio essencial mínimo de soro reduzido e reagentes comerciais de lipofecção (L3000 e P3000, veja Tabela de Materiais).
   1. Colhe HEK293T células por tripsinização conforme descrito acima e placar 4 × 10⁶ células por frasco T150 com 30 mL de MTC pré-aquecido a 37 °C.
   2. Após 2 dias, confirme que as culturas estão distribuídas uniformemente e confluentes entre 70 e 80%.
   3. Aqueça 50 mL de meio essencial mínimo sérico reduzido para RT. Descongele plasmídeos lentivirais, misture suavemente e centrifuge rapidamente. Pulsar reagentes de lipofecção por vórtice, centrifugação rápida e deixá-los na RT.
   4. Prepare mixagens master de DNA. Para cada frasco, combine nesta ordem: 2 mL de meio essencial mínimo sérico reduzido, 39 μg de plasmídeos de embalagem lentiviral (18 μg de pTRP Gag-Pol, 18 μg de pTRP RSV-Rev, 3 μg de pTRP Cocal-G), 15 μg de plasmídeo de transferência e 108 μL de reagente P3000 (2 μL de P3000/μg DNA). Aumente conforme necessário e aumente os valores finais em pelo menos 10% para compensar a perda de pipetagem. Vórtice de pulso, giro rápido e armazenamento no RT.
   5. Prepare mixagens master L3000. Para cada frasco, combine nesta ordem: 1,84 mL de meio essencial mínimo sérico reduzido e 162 μL de L3000 (3 μL de L3000/μg de DNA). Aumente conforme necessário e aumente os valores finais em pelo menos 10% para compensar a perda de pipetagem. Vórtice pulsado, giro rápido e incubação em RT por 5 minutos.
   6. Após 5 minutos, adicione 2 mL de mistura master L3000 por frasco à mistura master de DNA correspondente para alcançar uma diluição aproximada de 1:2. Adicione lentamente a mistura L3000 começando pelo fundo do tubo sem tocar nas laterais. Misture bem pipetando e incube por 15 minutos em tempo de descanso.
   7. Enquanto isso, remova cuidadosamente 6 mL de sobrenadante de cada cultura HEK293T e rotule cada frasco.
   8. Após 15 minutos, transfecte cada cultura inclinando o frasco para cima e liberando lentamente 4 mL de mistura de transfecção no sobrenadante na parte superior do frasco para evitar desalojar as células. Pipete lentamente para cima e para baixo duas vezes, volte o frasco à posição original, gire suavemente, coloque de volta na incubadora e registre o tempo.
      NOTA: Deixe as culturas intocadas até a colheita do lentivírus. Em contraste com a recomendação do fabricante de substituir o sobrenadante HEK293T contendo a mistura de transfecção L3000 por meio de cultivo fresco após a transfecção¹⁸, omitir essa etapa preserva títulos lentivirais^{mais altos 17}.
3. Colheita, concentração e congelamento de supernadantes lentivirais
   NOTA: Mantenha os supernadadores lentivirais no gelo ou a 4 °C durante todas as etapas de processamento para evitar a degradação.
   ATENÇÃO: Vetores lentivirais são classificados como materiais infecciosos. Siga as precauções adequadas de biossegurança, incluindo o uso de equipamentos de proteção individual (por exemplo, luvas duplas, jalecos descartáveis). Descontamine todas as superfícies de trabalho com 10% de água sanitária seguida de 70% de etanol. Desinfete consumíveis contaminados e resíduos líquidos com 10% de água sanitária antes do descarte como resíduos bio-perigosos, de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança.
   1. Limpe os equipamentos de ultracentrífuga (baldes, tubos cônicos e adaptadores cônicos) com 10% de água sanitária, depois enxágue com água. Seca brevemente ao ar, seguida de pulverização com etanol 70% e secagem ao ar sob um exaustor de cultura de tecidos.
   2. Pré-resfrie a ultracentrífuga com o rotor inserido a 4 °C.
   3. Colhe supernadantes lentivirais de 30 a 36 horas após a transfecção, transferindo-os para tubos de 50 mL. Clarifique os supernadantes por centrifugação (500 × g, 5 min, 4 °C), filtre por um filtro de poros de 0,45 μm e armazene em gelo.
   4. Insira adaptadores cônicos nos baldes, transfira os supernadantes filtrados para tubos cônicos de ultracentrífuga e os carregue nos baldes. Equilibre baldes opostos com MTC frio, garantindo que as diferenças de peso estejam abaixo de 0,1 g.
   5. Concentre os supernadantes por ultracentrifugação a 12.300 × g durante a noite a 4 °C.
   6. Na manhã seguinte, retire cuidadosamente os baldes e armazene-os no gelo.
   7. Prepare uma caixa com gelo seco para congelar e crioviais rotulados para aliquotação.
   8. Sob um capuz de cultura de tecidos, abra cada balde e remova o tubo da ultracentrífuga com pinças. Para cada tubo, proceda da seguinte forma:
   9. Aspire cuidadosamente o sobrenadante até 0,5 polegadas do fundo do tubo e decante o líquido restante para uma placa de 6 poços. Bata suavemente no tubo para remover um pouco do líquido residual.
   10. Adicione 300 μL de MTC fria, ressuspenda suavemente por 30 segundos e transfira a suspensão para um criovial.
   11. Lave o tubo com 200 μL de TCM frio e adicione a lavagem ao mesmo cryovial.
   12. Misture suavemente e coloque aliquotas de 60 μL para a titulação do lentivírus (veja passo 1.4), várias aliquotas de 100 μL para produção de células CAR T e um tubo adicional com o volume restante como sobra. Congele imediatamente as aliquotas em gelo seco. Transfira alíquotas para -80 °C para armazenamento a longo prazo.
4. Titulação de lentivírus concentrado usando células T primárias
   NOTA: Aproximadamente 1 × 10⁵ As células T são necessárias por diluição por lentivírus. Por exemplo, seis lentivírus com oito diluições cada exigem: 6 × 8 × 1 × 10⁵ = 4,8 × 10⁶ Células T. Células adicionais devem ser preparadas para compensar a perda de pipeteamento. As células T são estimuladas usando esferas magnéticas de ativação revestidas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 (veja a Tabela de Materiais).
   1. Ativação das células T (dia 0)
      1. Pré-requisito: Mantenha as células T purificadas humanas CD4⁺ e CD8⁺ em MTC prontas.
      2. Conte as células T CD4⁺ e CD8⁺ e combine-as em uma proporção 1:1.
      3. Lave as esferas de ativação da seguinte forma: adicione 1 mL de MTC a um tubo, ressuspenda as esferas por vortice e transfira a quantidade necessária para alcançar uma proporção de 3 para 1 de esferas para células T. Coloque o tubo em um suporte magnético e permita que as esferas formem um pellet ao longo da parede do tubo. Após 30 s, aspire cuidadosamente o sobrenadante, remova o tubo do suporte magnético e ressuspenda as esferas em 1 mL de MTC. Repita a lavagem mais duas vezes.
      4. Adicione esferas de ativação às células T e ajuste a concentração final para 1 × 10⁶ células/mL com a MTC pré-aquecida a 37 °C.
      5. Misture bem e transfira a suspensão para um reservatório de reagentes. Células de placa em placas de fundo plano de 96 poços com 100 μL de MTC por poço usando uma pipeta multicanal. Misture bem a cada 1-2 minutos para evitar que a gota se fixe.
   2. Transdução das células T (dia 1)
      NOTA: Para lentivírus com transgenes grandes (por exemplo, 9 kb LTR-para-LTR), prepare 6 condições usando diluições seriadas 1:2 (não diluídas, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Para lentivírus com transgenes menores (por exemplo, 7 kb de LTR para LTR), são necessárias 8 condições com diluições seriadas 1:4. Use poços restantes como controles não transduzidos (UTD).
      1. Descongelar 60 μL de cada lentivírus concentrado em RT e armazenar no gelo.
      2. Prepare uma série de diluição em uma placa de fundo arredondado de 96 poços: Adicione 60 μL de lentivírus na fileira superior, adicione 30 μL de MTC frio em cada fileira abaixo, transfira 30 μL da linha superior para a segunda e misture (diluição 1:2), transfira 30 μL da segunda para a terceira fileira e misture (diluição 1:4). Continue até que seis condições estejam preparadas no total (não diluído, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Use imediatamente para transdução.
      3. Entre 23 e 26 horas após a estimulação da esfera, transduz células T com 25 μL por poço de lentivírus a partir da placa de diluição usando uma pipeta multicanal. Adicione 25 μL de MTC aos poços de controle UTD.
   3. Alimentação com células T (dia 3)
      1. Adicione suavemente 125 μL de MTC pré-aquecido a 37 °C em cada poço usando uma pipeta multicanal.
   4. Análise de detecção de células T e citometria de fluxo (dia 5)
      1. Prepare três conjuntos de tubos de tampa roscada de 1,5 mL para cada condição e remova as tampas. Coloque dois dos três conjuntos em um suporte magnético.
      2. Resuspenda cada poço e transfira as células para o primeiro conjunto de tubos para permitir que as esferas formem um pellet ao longo da parede do tubo. Após 30 s, transfira cuidadosamente os sobrenadantes para o segundo conjunto de tubos. Espere 30 segundos (as contas não devem mais ser visíveis), depois transfira os supernadantes para o terceiro conjunto de tubos e armazene no gelo.
      3. Tingam as células T para o marcador de transdução apropriado (por exemplo, anti-CD19 CAR ou anti-HER2 synNotch) com anticorpos (veja Tabela de Materiais) e analisam a expressão dos marcadores por citometria de fluxo.
      4. Identifique condições com taxas de transdução abaixo de 30%, correspondendo aproximadamente à faixa linear entre o volume do vírus e a taxa de transdução.
      5. Calcule os títulos lentivirais usando a seguinte fórmula:
         Título (TU/mL) = (número inicial de células T x porcentagem de células transduzidas x fator de diluição)/volume viral (mL)
         por exemplo, expressão de 20% de CAR com diluição de 1:32 do estoque lentiviral:
         (100.000 células x 0,2 x 32) / (0,025 mL) = 2,56 × 10⁷ TU/mL

2. Produção de células T CAR

NOTA: Quantidades iniciais típicas para a produção de células T CAR são de 1-5 × 10^{células T 6} por grupo. Aumente o número de células no grupo controle UTD em 50%, pois esse grupo também será usado para normalizar os níveis de transdução em experimentos posteriores. Espere 5-6 dobrações populacionais ao longo da expansão. A transdução de células T foi otimizada usando um copolímero em bloco como realçador (ver Tabela de Materiais) e com razões específicas de cultivo superfície-volume em placas de fundo plano de 96^{poços 17}.

1. Preparação de uma solução de realçador de 100 mg/mL
   1. Adicione 5 g de realçador de copolímero em uma garrafa plástica, depois adicione 45 mL de água ultrapura. Mexa durante a noite no RT.
   2. Transfira a solução para um cilindro graduado e ajuste o volume para 50 mL com água ultrapura.
   3. Filtre a solução através de um filtro poroso de 0,22 μm e armazene a 4 °C.
2. Ativação das células T (dia 0)
   1. Pré-requisito: Mantenha as células T purificadas humanas CD4⁺ e CD8⁺ em MTC prontas.
   2. Conte as células T CD4⁺ e CD8⁺ e combine-as em uma proporção 1:1.
   3. Lave as bolas de ativação da seguinte forma.
      1. Adicione 1 mL de MTC a um tubo, ressuspenda as esferas por meio de vórtice e transfira a quantidade necessária para alcançar uma proporção de 3 para 1 entre esferas e células T. Coloque o tubo em um suporte magnético e permita que as esferas formem um pellet ao longo da parede do tubo.
      2. Após 30 s, aspire cuidadosamente o sobrenadante, remova o tubo do suporte magnético e ressuspenda as esferas em 1 mL de MTC. Repita a lavagem mais duas vezes.
   4. Adicione esferas de ativação às células T e ajuste a concentração final para 1 × 10⁶ células/mL com a MTC pré-aquecida a 37 °C.
   5. Misture bem e transfira a suspensão para um reservatório de reagentes. Células de placas em placas de fundo plano de 96 poços com 50 μL de MTC por poço usando uma pipeta multicanal. Misture bem a cada 1-2 minutos para evitar que a gota se fixe.
3. Transdução das células T (dia 1)
   NOTA: Selecione as quantidades de lentivírus com base nos resultados da titulação prévia, garantindo que os níveis finais de transdução sejam comparáveis entre os grupos (tipicamente entre 20% e 30%). Para evitar múltiplas integrações lentivirais, mantenha os níveis máximos de transdução ≤ 30%. Lentivírus com transgenes grandes geralmente requerem vírus não diluídos ou uma diluição 1:4-1:8. Ajuste o tamanho dos grupos para evitar restos de lentivírus, pois cada ciclo de congelamento-descongelamento reduz os títulos lentivirais. Use misturas master lentivirais imediatamente após a preparação.
   1. Descongele as quantidades necessárias de lentivírus concentrado no RT e armazene no gelo.
   2. Prepare um material de trabalho de 2 mg/mL de realçador em MTC fria, misturando, por exemplo, 100 μL de realçador (estoque de 100 mg/mL) com 4,9 mL de MTC.
   3. Prepare misturas mestres de lentivírus com base nos resultados da titulação e adicione o potenciador a uma concentração final de 275 μg/mL. Aumente os volumes finais em pelo menos 10% para compensar a perda por pipeteamento. Por exemplo, para alcançar uma diluição 1:16 com 100 poços:
      Volume total: 100 poços × 12,5 μL de lentivírus × 110% = 1.375 μL
      1:16 diluição: 1.375 μL/ 16 = 85,9 μL de lentivírus
      Potenciador: 189 μL (275 μg/mL final)
      Mistura master final: 1.100 μL de MTC + 85,9 μL de lentivírus + 189 μL de potenciador = 1.375 μL
   4. Entre 23 e 26 horas após a estimulação da esfera, transduz células T com 12,5 μL por poço de mistura master de lentivírus usando uma pipeta multicanal, resultando em uma concentração final de 55 μg/mL do potencializador. Adicione 12,5 μL de MTC aos poços de controle UTD.
4. Alimentação com células T (dia 3)
   1. Adicione suavemente 125 μL de MTC pré-aquecido a 37 °C em cada poço usando uma pipeta multicanal.
5. Penetração de células T (dia 5)
   NOTA: Prepare um reservatório estéril e três conjuntos de tubos de 50 mL para cada cultura. Limite o volume total de lavagem a ≤ 20% do volume da cultura de células T para evitar diluir as células abaixo de 8 × 10⁵ células/mL.
   1. Agrupe cada cultura em um reservatório estéril usando uma pipeta multicanal, lave as placas originais com MTC e adicione a lavagem ao reservatório. Transfira cada suspensão de célula para o primeiro conjunto de tubos de 50 mL.
   2. Coloque os tubos em um suporte magnético para permitir que as esferas formem um pellet ao longo da parede do tubo. Após 30 segundos, transfira cuidadosamente os sobrenadantes para o segundo conjunto de tubos e coloque-os no suporte magnético. Espere 30 segundos (as contas não devem mais ser visíveis), depois transfira os sobrenadantes para o terceiro conjunto de tubos e armazene-os na incubadora.
   3. Conte cada cultura e normalize para 8 × 10⁵ células/mL com MTC pré-aquecida a 37 °C. Placar no vaso de cultura apropriado, dependendo do volume final (Tabela 2).
   4. Deixe as células T descansarem por 1 dia e então comece as mamadas diárias a partir do 7º dia (veja próximo passo).
6. Alimentação com células T (dia 7 e diariamente a partir daí)
   NOTA: As células T dobram aproximadamente a cada 24-36 horas e passam por 5-7 duplicações populacionais antes de descansar. Monitore os volumes das células T usando um contador de células baseado em impedância elétrica (veja a Tabela de Materiais) para identificar o momento ideal para a criopreservação.
   1. Agrupe cada cultura, misture bem e conte as células.
   2. Normalize cada cultura para 8 × 10⁵ células/mL com MTC pré-aquecida a 37 °C e recoloque no vaso de cultura apropriado (Tabela 2).
   3. Continue a expansão até que o volume médio da célula caia abaixo de 320^{μm 3}, depois avance para a etapa de criopreservação.
7. Validação da transdução de células T usando citometria de fluxo
   NOTA: A transdução das células T pode ser avaliada a qualquer momento entre o dia 5 e o dia da criopreservação. Os níveis de expressão cairão ao longo da expansão, de modo que uma medição precoce garanta a separação clara das frações negativas e positivas durante a análise de citometria de fluxo.
   1. Colhe 2 × 10^{células T 5} de cada cultura.
   2. Tinga células T para o marcador de transdução apropriado (por exemplo, anti-CD19 CAR ou anti-HER2 synNotch) com anticorpos (veja Tabela de Materiais) e analisa a expressão de marcadores por citometria de fluxo
8. Criopreservação de células T (tipicamente entre os dias 10-12)
   NOTA: Criopreserva células T expandidas logo antes ou depois do estado de repouso para melhorar a viabilidade durante o descongelamento. Um volume médio de 320^{μm 3} pode servir como corte para a criopreservação. Quando o volume celular cai abaixo de 300^{μm 3}, as células T param de se dividir e seus números totais começam a diminuir. Garanta que todos os grupos tenham volumes comparáveis no momento da criopreservação, o que pode exigir um dia adicional de cultura para alguns grupos. Congele células a uma taxa constante de -1 °C por minuto usando recipientes de congelamento apropriados (por exemplo, recipientes de congelamento de células sem álcool, veja Tabela de Materiais).
   1. Agrupe cada cultura em um tubo apropriado (por exemplo, 500 mL), conte as células e armazene-as na incubadora.
   2. Calcule o número total de células e as quantidades aliquotas desejadas.
   3. As células centrífugas (300 × g, 10 min, 4 °C) aspiram os supernadantes e ressuspendem cada cultura em meio congelante contendo meio congelante contendo meio livre de soro com 50% de substrato isento, 40% de FBS inativado por calor e 10% de dimetil sulfóxido (DMSO) a 2 × 10⁷ células/mL (veja Tabela de Materiais).
   4. Células aliquotas em crioviais (250 μL a 1 mL, correspondendo a 5-20 × 10⁶ células por frasco). Coloque os cryovials em um recipiente de congelação celular e armazene-os a -80 °C durante a noite.
   5. Transfira os cryovials para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
9. Descongelamento de células T
   NOTA: Para cada grupo de células T, prepare um tubo com 50 mL de MTC pré-aquecido a 37 °C para diluir o DMSO no meio congelante após o descongelamento. Aqueça mais TCM para a placagem.
   1. Descongele rapidamente os cryovials a 37 °C em banho-maria ou sob água morna corrente.
   2. Assim que o líquido estiver visível, prossiga até um capuz de cultura de tecidos, adicione 500 μL de MTC pré-aquecido, misture suavemente e transfira as células para os tubos preparados contendo 50 mL de MTC.
   3. Lave o cryovial com 500 μL de TCM e adicione o wash ao mesmo tubo.
   4. Incube as células por 10 minutos na RT.
   5. As células centrífugas (300 × g, 10 min, temperatura ambiente), aspiram os supernadantes e resuspendem as células a 4 × 10⁶ células/mL.
   6. Placar as células no vaso de cultura apropriado (Tabela 2).
   7. Descanse as células durante a noite na incubadora antes de prosseguir com experimentos a jusante.

Embarcação	Volume mínimo	Volume máximo
96-poço	0,1 mL/poço	0,25 mL/poço
48-poço	0,2 mL/poço	1 mL/poço
24-poço	0,5 mL/poço	2 mL/poço
12-poço	1 mL/poço	4 mL/poço
6-poço	2 mL/poço	6 mL/poço
T25 (horizontal)	3 mL	8 mL
T75 (horizontal)	8 mL	20 mL
T150 (horizontal)	20 mL	60 mL
* o volume de cultura é temporariamente reduzido para 50 μL/poço para potencializar a transdução das células T

Tabela 2: Volumes recomendados de meio de cultura para expansões de células CAR T. Volumes mínimos e máximos de meios de cultura em formatos de vasos comumente usados durante a expansão das células T.

Resultados

Para demonstrar as melhorias alcançadas com o fluxo de trabalho otimizado (Figura 1) em uma ampla gama de tamanhos de transgene, selecionamos três tamanhos de vetores lentivirais: 5,7 kb (CD19 CAR), 9,2 kb (HER2-MSLN svsNotch) e 10,1 kb (HER2-MSLN-CBG svsNotch) (Figura 2A). Os lentivírus foram produzidos sob condições padrão ou otimizadas (Figura 2B: DST vs. opt e Tabela 1).

Para o menor vetor, com 5,7 kb, apenas uma melhora moderada na transdução de células T foi observada em um lote de produção (Figura 2B: topo, 73% vs. 88% usando vírus não diluído). Consistentemente, os títulos lentivirais aumentaram apenas modestamente aproximadamente 1,5 vezes (Figura 2C: topo, 2,86 × 10⁸ TU/mL vs. 4,35 × 10⁸ TU/mL). Em contraste, o vetor de 9,2 kb apresentou desempenho substancialmente melhorado, com taxas máximas de transdução de células T aumentando aproximadamente 5,4 ou 3,8 vezes dependendo do lote (Figura 2B: meio, 8,3%/16,6% vs. 45,1%/63,1% usando vírus não diluído) e títulos funcionais melhorando aproximadamente 3,3 vezes (Figura 2C: meio; 3,1 × 10⁶ TU/mL vs. 10,1 × 10⁶ TU/mL). O efeito mais forte foi observado com o vetor de 10,1 kb, onde as taxas de transdução aumentaram aproximadamente 12,4 ou 9,8 vezes (Figura 2B: fundo, 1,4%/1,5% vs. 17,3%/14,7% usando vírus não diluído) e os títulos funcionais melhoraram aproximadamente 10 vezes (Figura 2C: fundo, 0,24 × 10⁶ TU/mL vs. 2,41 × 10⁶ TU/mL).

Em seguida, células T de doadores saudáveis foram transduzidas com vetores lentivirais produzidos sob condições padrão ou otimizadas, utilizando os fluxos de trabalho correspondentes (Figura 3 e Tabela 1). Para comparar as eficiências da transdução, quantidades iguais de lentivírus foram usadas em cada fluxo de trabalho, e a dose viral foi ajustada para manter taxas de transdução iguais ou abaixo de 30%, prevenindo múltiplos eventos de integração. Comparado com células T transduzidas usando condições padrão e produção padrão de lentivírus, a transdução aumentou em média 5,1 vezes para o vetor de 5,7 kb, 13,3 vezes para o vetor de 9,2 kb e 14,8 vezes para o vetor de 10,1 kb (Figura 3A e Tabela Suplementar 1). Culturas selecionadas de células T geradas com o fluxo de trabalho otimizado foram expandidas até atingirem um estado de repouso (Figuras 3B,C). As duplicações populacionais variaram de 5,3 a 6,7, dependendo do doador de células T (Figura 3B). Medições diárias de volume de células T mostraram detritos celulares mínimos, indicando que não há sinais de toxicidade durante as expansões. Antes da criopreservação, as taxas de transdução eram avaliadas por coloração para expressão do receptor CAR/synNotch ou pela medição da fluorescência mTag-BFP2¹⁹ (Figura 3C e Figura Suplementar 1). As taxas de transdução foram de 31,2% para o vetor de 5,7 kb (preto; diluição do lentivírus 1:512), 29,8% para o vetor de 9,2 kb (vermelho; diluição do lentivírus 1:16) e 20,2% para o vetor de 10,1 kb (azul; diluição do lentivírus 1:4). Dados funcionais adicionais validando o desempenho das células T svsNotch geradas e células T CAR são apresentados em nosso estudo^{complementar 17}. Importante destacar que as células T efetoras produzidas com o protocolo otimizado não apresentaram diferenças nas duplicações populacionais ou no fenótipo das células T em comparação com aquelas geradas com o fluxo de trabalho^{padrão 17}.

Figura 2: Produção de lentivírus seguindo fluxos de trabalho padrão e otimizados. (A) Visão esquemática dos vetores lentivirais com tamanhos correspondentes de^{transgene 17}. Cima: Um CAR contra CD19 (CD19 CAR) é expresso pelo promotor alfa do fator de alongamento humano 1 (EF1α), com um tamanho total do transgene de aproximadamente 5,7 kb. Meio e base: Um receptor HER2 synNotch é co-expresso com uma proteína repórter azul-fluorescente (BFP2) (meio) ou com uma luciferase verde de besouro do clique (CBG) (base) por meio de um peptídeo auto-clivagante 2A (P2A) pelo promotor EF1α. A expressão de um CAR (MSLN) que tem como alvo a mesotelina (MSLN) é controlada por um promotor mínimo específico de citomegalovírus (CMV) específico para GAL4 (GAL4-CMV). O tamanho total dos transgenes é aproximadamente 9,2 kb para o svsNotch HER2-MSLN (meio) e 10,1 kb para o svsNotch HER2-MSLN-CBG (base). SIN = vetor auto-inativante; LTR = sequência de repetição terminal longa. (B) Transdução de células T com diluições seriadas de lentivírus geradas sob condições padrão (STD) e otimizadas (opt) usando os vetores descritos em (A). Duas produções independentes (círculos e triângulos) por vetor, com dois lotes cada, e dois doadores distintos de células T por lote. As taxas de transdução foram médias entre doadores de células T. (C) Títulos funcionais das produções padrão (std, círculos abertos) e otimizadas (opt, círculos fechados) mostradas em (B). Os dados foram gerados a partir de duas produções independentes de lentivírus, cada uma com dois lotes, e usando dois doadores distintos de células T por lote. Todas as barras de erro indicam média ± DS. A significância estatística foi calculada usando um teste t pareado de duas caudas. *p < 0,03, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Essa figura foi adaptada com permissão de Rommel et ^al.17. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Produção de células CAR T com fluxos de trabalho padrão e otimizados. (A) Aumento dobrado nas taxas de transdução das células T com o fluxo de trabalho otimizado (opt) em comparação com o fluxo padrão (STD) (veja também a Tabela S1). Os dados foram obtidos de duas ou três expansões independentes de células T usando doadores distintos e duas produções independentes de lentivírus. (B) Duplicações populacionais das expansões de células T geradas usando o fluxo de trabalho otimizado. Para cada vetor, duas expansões independentes de células T de doadores normais distintos (ND) são mostradas, cada uma usando uma produção separada de lentivírus. (C) Gráficos de citometria de fluxo mostrando a expressão de CAR, BFP2 e receptores synNotch em células T efetoras expandidas no dia 7 (10,1 kb) ou dia 10 (5,7 kb e 9,2 kb) (veja também a Figura Suplementar 1). Todas as barras de erro indicam média ± DS. A significância estatística foi calculada usando um teste t pareado de duas caudas. *p < 0,03, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Essa figura foi adaptada com permissão de Rommel et ^al.17. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1: Estratégia de gating para avaliação da expressão de CAR, receptor synNotch e BFP2, relacionada à Figura 3C. Gráficos representativos de citometria de fluxo mostrando a estratégia de gate usada para determinar a expressão de CAR, synNotch e BFP2 em culturas expandidas de células T. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 1: Taxas de transdução em expansões individuais de células T, relacionadas à Figura 3A. Taxas de transdução das expansões de células T geradas com fluxos de trabalho padrão e otimizados. Esta tabela foi adaptada com permissão de Rommel et ^al.17. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo detalhando um fluxo de trabalho otimizado de produção para células CAR T com grandes transgenes lentivirais, como as células T svsNotch. Esse fluxo de trabalho elimina a necessidade de separação celular e possibilita a geração eficiente de células T efetoras que carregam grandes transgenes lentivirais. Usando esse fluxo de trabalho, produzimos rotineiramente células T efetoras com transgenes lentivirais de 9-10 kb e taxas máximas de transdução de 60-70% (9 kb) ou 15-20% (10 kb).

Ao resolver problemas com baixos títulos virais ou taxas de transdução, vários fatores-chave devem ser considerados. Primeiro, a qualidade das células HEK293T. É importante que HEK293T células sejam travessadas com um cronograma consistente e nunca possam crescer além de 50-70% de confluência. Em nossa experiência, vetores lentivirais produzidos a partir de células HEK293T que antes estavam sobredimensionadas apresentam títulos reduzidos, mesmo quando as células parecem morfologicamente recuperadas. Rotineiramente geramos vetores virais de alto título usando células HEK293T além da passagem 30, indicando que números de passagem mais altos são tolerados se as células forem devidamente mantidas. Além da qualidade celular, a confluência de HEK293T células no momento da transfecção é um fator crítico. Observamos diminuição dos títulos lentivirais ao transfectar células HEK293T em alta confluência (90-100%).

Segundo, a observância rigorosa dos tempos, concentrações e volumes especificados neste protocolo é essencial, pois muitas etapas foram otimizadas em um estudo^{anterior 17}. Por exemplo, o realçador de copolímeros (veja Tabela de Materiais) foi ajustado para maximizar as taxas de transdução sem toxicidade detectável. Embora concentrações mais altas possam aumentar ainda mais a transdução, elas também causam toxicidades e reduzem a expansão das células T. De forma semelhante, a colheita de supernadantes lentivirais fora da janela recomendada de 30-36 horas (por exemplo, em 24 ou 48 horas) resultou em títulos mais baixos em um experimento de curso temporal^{correspondente 17}. Em contraste, não é necessário seguir rigorosamente uma proporção 1:1 de células T CD4 para CD8, pois não observamos diferenças significativas na eficiência da transdução ao usar células T a grande escala com distribuições variáveis CD4/CD8. No entanto, desvios dessa proporção podem influenciar a duração da expansão e o número de duplicações populacionais. Portanto, normalmente mantemos a proporção 1:1 CD4 para CD8 para garantir consistência entre os experimentos.

Esforços futuros de otimização poderiam focar em estratégias adicionais para melhorar a transdução de células T com transgenes lentivirais ainda maiores, como formulações de meios especializados ou regimes de citocinas personalizados. Estender esse fluxo de trabalho para outros tipos de células imunológicas, incluindo células natural killer e macrófagos, poderia ampliar suas aplicações terapêuticas. Importante, a tradução clínica desse fluxo de trabalho também pode ajudar a reduzir os custos de fabricação de produtos de terapia celular modificada por lentivírus.

O protocolo passo a passo abrangente apresentado aqui fornece uma referência prática para a produção de células CAR T com grandes transgenes lentivirais e estabelece as bases para o desenvolvimento de novas células CAR T contra cânceres sólidos e sanguíneos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo - CARRO anti-CD19	Cytoart	200101	Anti-CD19 CAR (idiotípico), conjugado AF647, 1:100
Anticorpo - anti-HER2 synNotch	R& Sistemas D	FAB95471G	Anti-Trastuzumabe (idiotípico), conjugado AF488, 1:80
Água sanitária	Clorox	Branqueante Germicida
Recipiente de congelamento de células	Biocisão	FTS30	Sem álcool
Centrífuga (grande)	Termo Científica	Legend XTR
Centrífuga (mini)	Fisher Scientific	Sprout Plus
Centrífuga (pequena)	Eppendorf	5425
Contador Coulter	Beckman Coulter	Multidimensionador 4	Contador de células baseado em impedância elétrica que determina o número e o volume celular
Tubos criogênicos	Termo Científica	375418
Dimetil sulfóxido (DMSO)	Tecnologia de Sinalização Celular	12611P
DPBS (sem cálcio, sem magnésio)	Gibco	14190-136
Dynabeads (CD3/CD28)	Gibco	40203D	Esferas de ativação usadas para estimulação de células T
Etanol	Laboratórios de Descontaminação	200 Proof
FBS (inativado por calor)	Avantor (VWR)	97068-091
Citômetro de fluxo	BD	LSRFortessa (647177)
Freezer (-80 ° C)	Panasonic	MDFU76VA-PA
Freezer (nitrogênio líquido)	MVE HEco	1500-190
Geladeira (4 e graus; C)	Fisher Scientific	Isotemp
Luvas (Nitril)	Driza	55082
Suplemento GlutaMAX	Gibco	35050-061	L-alanyl-L-glutamina
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Gelo (seco)	N.A.	N.A.
Gelo (molhado)	N.A.	N.A.
Balde de gelo	Fisher Scientific	07-210-108
Jaleco (descartável)	Kappler	PVS112WH-MD
Plasmídeos de embalagem lentíviral	Proprietário	N.A.	pTRP Gag-Pol, pTRP RSV-Rev, pTRP Cocal-G
Plasmídeos de transferência lentival	Proprietário	N.A.	por exemplo, pTRPE svsNotch
Reagente de Transfecção Lipofectamina 3000	Invitrogen	L3000015	Reagente comercial de lipofecção; contém Lipofectamina 3000 (L3000) e seu reagente potenciador (P3000)
Suporte magnético (grande)	Stemcell	EasySet 18103	Para 5 mL/15 mL
Suporte magnético (pequeno)	Invitrogen	DynaMag-2 12321D	Para tubos de 1,5 mL
Barra magnética de agitação	Fisher Scientific	14-513-82	Kit de barra de agitação
Plataforma magnética de agitação	Termo Científica	S88857100
Cilindro de medição (100 mL)	VWR	76019-316
MQ água	Merck	Q-POD	Água de ultrapue; utiliza o Millipak 40 Express Final Filter, 0,22 Micron (MPGP04001)
Pipeta multicanal	Fisher Scientific	veja os comentários	30-300 & micro; L:  FBE1200300; 5-50 & micro; L:  FBE1200050
Opti-MEM (com L-glutamina, Fenol Vermelho)	Gibco	31985-070	Meio essencial mínimo de soro reduzido usado para transfecção de DNA
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL, 10.000 & micro; g/mL)	Gibco	15140-122
Pipetas	Fisherbrand	veja os comentários	50 mL: 13-678-11F; 25 mL: 13-678-11; 10 mL: 13-678-11E; 5 mL: 13-678-11D
Pipetas (aspirativas)	Falcon	357558	2 mL
Pipeta	Gilson	PIPETMAN P10/P20/P200/P1000
Controlador de pipeta	Hirschmann	Pipetus Z314951
Pontas de pipeta	Thomas Scientific	veja os comentários	1000 & micro; L: 1159M42; 200 & micro; L: 1159M40; 20 & micro; L: 1159M43; 10 & micro; L: 1159M41
Garrafa plástica de armazenamento (500 mL)	Corning	430282
Reservatório de reagentes	Celltreat	3054-2007
RPMI-1640 (com L-glutamina, Fenol Vermelho)	Gibco	11875-085
Escala	Ohaus	Pioneiro	Precisão mínima de 0,1 g necessária
Filtro Steriflip (0,45 & micro; m)	Millipore	SE1M003M00
Sinperônica F 108 (SF108)	Sigma-Aldrich	07579-250G-F	Copolímero em bloco usado para potencializar a transdução de células T
Frasco de cultura de tecidos - T150	Corning	430825
Frasco de cultura de tecidos - T25	Corning	430639
Frasco de cultura de tecidos - T75	Corning	430641U
Cabeça de cultura de tecidos	Termo Científica	Série 1300 A2
Incubadora de cultura de tecidos	Termo Científica	Heracell 150i
Placa de cultura de tecidos - 6 poços	Corning	3516
Placa de cultura de tecidos - fundo plano de 96 poços	Falcon	353072
Placa de cultura de tecidos - fundo arredondado de 96 poços & nbsp;	Falcon	353077
Tripsina-EDTA (0,05%)	Gibco	25300-054
Tubos - tampas de rosca de 1,5ml	Sarstedt	72692005
Tubos - 15 mL	Falcon	352099
Tubos - 5 mL	MSP	62-1028-2
Tubos - 500 mL	Corning	431123
Tubos - 50ml	Falcon	352098
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima XPN-100
Rotor de ultracentrífuga com baldes	Beckman Coulter	SW 32 Ti
Adaptadores de tubo ultracentrífuga (para tubos cônicos)	Seton Scientific	4230
Tubos ultracentrífugas (cônicos)	Seton Scientific	5067
Vórtice	Fisher Scientific	02215414
Banho-maria (37 & deg; C)	Fisher Scientific	Isotemp 210	Usado com contas Lab Amor (Gibco) em vez de água
X-VIVO-15	Lonza	04-418Q	Mídia sem soro usada para congelar células T