Um método refinado de entrega intratraqueal de bleomicina baseado em aerossóis para modelos reprodutíveis e minimamente invasivos de fibrose pulmonar em camundongos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para modelar a fibrose pulmonar em camundongos usando bleomicina aerossolizada administrada pela traqueia. Esse método otimizado permite uma entrega uniforme, quantitativa e precisa, sem incisão cirúrgica, aumentando a reprodutibilidade e a confiabilidade da fibrose induzida por bleomicina.

Resumo

A fibrose pulmonar é caracterizada pela deposição progressiva de tecido cicatricial fibrótico dentro do parênquima pulmonar, levando a uma troca gasosa severamente comprometida. Ela está na base de um espectro de doenças pulmonares intersticiais crônicas, notadamente a fibrose pulmonar idiopática, uma condição associada a um prognóstico extremamente ruim. Dada a falta de terapias eficazes, modelos robustos de camundongos são fundamentais para elucidar mecanismos patológicos subjacentes e avaliar novas intervenções antifibróticas. A fibrose pulmonar induzida por bleomicina continua sendo o modelo experimental mais amplamente utilizado. As vias comuns de administração em camundongos incluem injeções intravenosas e intraperitoneais, instilação intraqueal invasiva aberta e gotejamento traqueal não invasivo. No entanto, métodos cirúrgicos invasivos frequentemente causam lesão secundária nos tecidos, podendo comprometer a reprodutibilidade e estabilidade do modelo. Por outro lado, o gotejamento traqueal não invasivo geralmente resulta em distribuição desigual da bleomicina nos lobos pulmonares e apresenta risco de asfixia, reduzindo assim a reprodutibilidade e aumentando os desafios técnicos. Para enfrentar essas limitações, é desenvolvido um método refinado de entrega intratraqueal baseado em aerossóis, que é operacionalmente mais simples, minimamente invasivo, altamente reproduzível e eticamente superior, reduzindo significativamente o sofrimento animal. Usando um laringoscópio de pequeno animal para visualizar diretamente a rima glotidis, uma agulha aerossolizante especializada é inserida na traqueia, marcadamente mais estreita que o diâmetro traqueal do camundongo. A solução de bleomicina é administrada sob pressão precisamente controlada, gerando um aerossol fino. Isso garante uma distribuição uniforme e eficiente do agente por todo o parênquima pulmonar. Além disso, é possível direcionar seletivamente o pulmão esquerdo ou direito direcionando a agulha para o brônquio apropriado. A relação dose-resposta desse modelo otimizado é amplamente caracterizada pelo monitoramento sistematico das mudanças na função pulmonar, manifestações histopatológicas e conteúdo de hidroxiprolina pulmonar. Espera-se que esse protocolo experimental refinado facilite a padronização laboratorial, acelerando, em última análise, o desenvolvimento e a validação pré-clínica de novas terapias antifibróticas.

Introdução

Fibrose Pulmonar (PF) é um grupo de doenças letais caracterizadas por danos progressivos ao parênquim pulmonar e reparo anormal, sendo que a Fibrose Pulmonar Idiopática (FPI) representa entre 30% e 40%, com a idade mediana de diagnóstico dos pacientes sendo de 65 anos, e mais de 80% deles com mais de 60 anos de^{idade. 2}. À medida que o envelhecimento global se intensifica, a incidência de IPF aumenta ano após ano, com uma incidência mundial de IPF de 3-9/100.000/ano, e segundo um estudo nos Estados Unidos da América em pessoas com mais de 65 anos, a incidência nessa população disparou para 93,7/100.000/ano ^3,4.

O primeiro modelo historicamente desenvolvido de fibrose pulmonar foi o modelo induzido por bleomicina, frequentemente usado na academia, com a melhor caracterização e o modelo animal mais amplamente utilizado atualmente⁵, recapitulando muitas das características da IPF e de outras ILDs fibróticas, incluindo inflamação pulmonar, lesão epitelial, proliferação de fibroblastos e deposição excessiva de matriz extracelular^{(ECM) 6}. Além disso, tanto a fibrose pulmonar aguda quanto a crônica podem ser modeladas dependendo da dose e frequência da administração de bleomicina. Foi relatado que os pulmões entram em uma fase inflamatória aguda dentro de 5 a 7 dias após a exposição à bleomicina, seguida por uma fase fibrótica que começa por volta do dia 7. No dia 21, normalmente observa-se uma remodelação fibrótica pronunciada, permitindo que o modelo recapitule tanto a resposta inflamatória inicial quanto a patologia fibrótica em estágio tardio de maneira definida^{temporalmente 7} (Figura 1A). Isso permite o estudo de todo o processo da doença, desde a lesão inicial até o estágio fibrótico, o que é muito importante para o desenvolvimento de medicamentos e estudos de mecanismos em todos os^{estágios 8,9}.

As rotas de modelagem da bleomicina são diversas e podem ser administradas local ou sistêmica, incluindo rotas endotraqueicas, nasais, intravenosas e intraperitoneais. A mais comumente utilizada é a injeção endotraqueal. A desvantagem é que isso cria incisões nos camundongos, o que afeta a taxa de sobrevivência dos camundongos^{modelados 10}. Melhorias foram feitas posteriormente para permitir o uso de uma agulha permanente para intubação traqueal e injeção por gotejamento em^{camundongos 11}. No entanto, o medicamento administrado pela seringa só pode ser distribuído nos pulmões como um bloqueio, o que pode levar à distribuição desigual da bleomicina em cada lobo pulmonar, produzindo sobredensidade local e afetando a estabilidade do modelo camundongo. Além disso, cartuchos nebulizadores de câmara têm sido usados para a administração de bleomicina, mas a quantidade de aerossol de bleomicina inalado em cada camundongo não pode ser quantificada com precisão, e o tempo de indução único é^{longo, 12}. Portanto, foi desenvolvido um método refinado de entrega intratraqueal de bleomicina baseado em aerossóis para modelos reprodutíveis e minimamente invasivos de fibrose pulmonar. A bleomicina é aerossolizada, permitindo dispersão e deposição uniformes nos pulmões, recapitulando melhor a patologia da doença pulmonar. Espera-se que o surgimento desse método acelere a pesquisa em medicamentos que possam curar completamente a fibrose pulmonar.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos sob diretrizes institucionais aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso dos Animais (IACUC). Medidas adequadas de bem-estar animal foram implementadas durante todo o experimento. Machos C57BL/6 camundongos de 6 a 8 semanas, pesando aproximadamente 25 g, foram selecionados para o experimento. A Tabela de Materiais lista todos os animais, reagentes e equipamentos usados neste estudo e suas fontes comerciais.

1. Seleção e aclimatação animal

1. Abrigue todos os camundongos sob condições específicas livres de patógenos, com um ciclo de 12 horas luz/escuro e acesso ad libitum a comida e água.
2. Aclimate os camundongos à instalação por 5 a 7 dias antes de iniciar o modelo baseado em aerossol.

2. Preparação da solução de bleomicina

ATENÇÃO: A bleomicina é um agente antitumoral citotóxico. Realize todas as etapas em um armário de biossegurança certificado usando EPI adequado.

1. Usando uma seringa estéril de 1 mL, retire 3 mL de cloreto de sódio estéril 0,9% e injete em um frasco contendo 15 U de cloridrato de bleomicina.
2. Gire suavemente o frasco até que o pó esteja totalmente dissolvido para obter uma solução de caldo de 5 U/mL.
3. Aliquota a solução original em tubos estéreis de microcentrífuga de 1,5 mL. Prepare soluções de trabalho de 3,75 U/mL e 2,5 U/mL diluindo com soro fisiológico estéril.
   NOTA: Para um camundongo de 25 g, essas concentrações correspondem a doses de 7,5 U/kg e 5 U/kg, respectivamente. Ajuste as concentrações se o peso do mouse variar.
4. Armazene as soluções funcionais a 4 °C por até 1 semana ou a -80 °C por até 1 mês. Descongele e leve até a temperatura ambiente antes do uso.

3. Administração intratraqueal de bleomicina baseada em aerossóis

1. Preparação e administração da anestesia
   1. Prepare a solução anestésica de trabalho dissolvendo 0,1 g de pó de pentobarbital de sódio em 10 mL de soro fisiológico estéril. Filtre usando um filtro de membrana PES de 0,22 μm. Armazene a solução a 4 °C em um ambiente protegido pela luz e utilize dentro de 3 dias após o preparo.
   2. Administrar solução de pentobarbital sódico por injeção intraperitoneal usando uma seringa de 1 mL com agulha calibre 26, em uma dose de 60 mg/kg de peso corporal. Se a profundidade ou duração da anestesia for insuficiente, ajuste a dose com base na resposta do animal sob a orientação do veterinário responsável.
   3. Avalie a profundidade da anestesia alguns minutos após a injeção, beliscando firmemente o dedo do pé e confirmando a ausência de reflexo de retirada antes de prosseguir com os procedimentos subsequentes.
2. Preparação de aparelhos de entrega de aerossóis
   1. Prepare o aparelho de entrega de aerossóis, garantindo que a agulha de nebulização, a seringa de nebulização e o pilar de dosagem estejam todos presentes e estéreis (Figura 1B).
   2. Submerga a seringa de entrega em aerossol em soro salino estéril. Aspire o líquido lentamente e faça uma pausa por 8 segundos. Exija o líquido rapidamente. Repita isso três vezes para encher e lavar o sistema.
   3. Reabasteça a seringa com soro fisiológico após a expulsão final. Prenda a agulha aerossolizante, garantindo que a junção esteja preenchida com soro fisiológico.
   4. Submerga a agulha montada em soro e repita o ciclo de aspiração-pausa-expulsão mais três vezes para eliminar bolhas de ar.
      NOTA: Para confirmar a prontidão, expelida soro fisiológico sobre um fundo escuro. Certifique-se de que a solução salina rapidamente ejetada forme uma névoa em forma de leque contra um fundo escuro.
3. Procedimento de entrega intratraqueal em aerossóis
   1. Preparando a agulha em aerossol com solução de trabalho de bleomicina, aspirando e expelindo três vezes com pausas de 8 segundos.
   2. Insira um pilar de dosagem de 25 μL no topo do pilar de 50 μL para calibrar o volume. Aspire o volume necessário (50 μL). Expulse qualquer líquido em excesso.
      NOTA: Essa configuração de dosagem garante entrega consistente ao minimizar o erro humano.
   3. Coloque o camundongo anestesiado na plataforma de intubação, prendendo os incisivos superiores e prendendo os membros para estabilizar (Figura 1C).
      NOTA: Confirme movimentos rítmicos do peito. Se o animal parecer ativo, administre uma dose adicional de anestesia.
   4. Use pinças curvas para puxar a língua suavemente. Insira um laringoscópio de pequeno animal para expor a glote (Figura 1D).
   5. Insira a agulha aerossolizante verticalmente através da glote. Administre rapidamente o aerossol da bleomicina (Figura 1E).
      NOTA: Incline a ponta da agulha em direção ao pulmão desejado para entrega direcionada. Evite inserir muito fundo para evitar traumas. A ponta da agulha do nebulizador deve ser posicionada próxima, mas sem tocar, do ponto de bifurcação (primeira bifurcação) da traqueia do camundongo para alcançar o melhor efeito de modelagem. Se a ponta for inserida apenas no meio da traqueia, o aerossol pode atingir apenas a parede traqueal, formando grandes gotículas que são tossidas ou engolidas. Se a ponta estiver muito próxima da bifurcação traqueal, há risco de dano traqueal.

4. Recuperação pós-procedimento

1. Coloque o mouse em um aquecedor para manter a temperatura corporal. Observe o camundongo continuamente até que ele se recupere da anestesia (normalmente de 1 a 2 horas).
2. Faça um beliscão no dedo do pé para verificar os reflexos e confirme se o rato está vivo.
3. Realize monitoramento clínico diário por 21 dias, incluindo peso corporal, nível de atividade, cuidados pessoais e sinais respiratórios.
4. Eutanasiar animais quando qualquer um dos seguintes critérios for atendido: (i) >20% de perda de peso corporal em comparação com a linha de base pré-tratamento, ou ≥15% de perda acompanhada de outros sinais clínicos de sofrimento; (ii) desconforto respiratório severo persistente em repouso (respiração dificultosa ou abdominal, taquipneia ou bradicneia marcadas, inflamação nasal ou respiração boca aberta), com ou sem cianose das extremidades; (iii) incapacidade de obter comida ou água, letargia marcada ou aparência moribunda (sem resposta ao manuseio e/ou perda do reflexo de endireitamento); ou (iv) desidratação severa, hipotermia ou outros sinais de deterioração irreversível conforme avaliado pelo veterinário responsável. Quando esses pontos humanos são alcançados, eutanasia os animais com uma overdose de pentobarbital sódico (≥150 mg/kg, i.p.), seguida de um método físico secundário (por exemplo, luxação cervical), para garantir a morte e minimizar a dor e o sofrimento.

5. Medição da função pulmonar terminal e coleta de tecidos

1. No dia 21, anestesie o camundongo com 90 mg/kg de anestesia da mesma solução anestésica para induzir anestesia profunda e suprimir a respiração.
2. Confirme anestesia completa por um beliscão no dedo do pé. Expõe a traqueia cortando a pele e separando os músculos.
3. Faça uma pequena incisão chanfrada na traqueia e insira a agulha de intubação. Fixe com uma ligadura cirúrgica.
4. Transfira o rato para o ventilador de mecânica pulmonar de pequenos animais controlado por computador. Inicie a ventilação mecânica e garanta que não haja respiração espontânea. Use o sistema de ventilação para medir parâmetros da função pulmonar.
5. Realize perfusão ventricular direita com 5-10 mL de soro fisiológico estéril até que os pulmões pareçam branqueados.
6. Dissecar o pulmão inteiro. Fixe o pulmão esquerdo em formalina tamponada neutra por 24 horas.
7. Imergir o tecido pulmonar fixo na parafina, seccioná-lo e realizar coloração H&E, coloração tricroma de Masson e coloração imunohistoquímica para COL1A1 e α-SMA.
8. Coloque o pulmão direito em um tubo de homogeneização de 2 mL com esferas. Adicione água conforme o protocolo do kit de hidroxiprolina. Homogeneize e prossiga com o ensaio.

Resultados

Neste estudo, propusemos um método de administração intrabrônquica baseado em aerossóis para induzir fibrose pulmonar em camundongos usando bleomicina. Em experimentos preliminares, um corante verde foi aerossolizado e administrado aos pulmões de diferentes camundongos. O contraste apresentava um padrão de distribuição manchado por todos os pulmões, indicando que a administração intrabrônquica baseada em aerossóis permitia a dispersão uniforme do agente em todos os lobos pulmonares (

Discussão

Este estudo propôs um modelo otimizado de nebulização traqueal não invasiva da fibrose pulmonar induzida por bleomicina em camundongos. Um pequeno laringoscópio animal foi usado para localizar a glote, e uma pequena agulha de nebulização foi inserida nas vias aéreas do rato. A pressão foi aplicada manualmente para nebulizar o medicamento nos pulmões, reduzindo assim o desconforto e a sufocação associados à agulha de retenção usada na injeção não^{invasiva 13,14...}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,22 & mu; Filtro de seringa de polietersulfona M	Cytosci	CSTPE3320
1 mL de seringa descartável	BD	300481
Tubo microcentrífuga de 1,5 mL	Servicebio	EP-150-M
Tubo de lise reforçado de 2,0 mL	Servicebio	HT-200-M
4 & deg; Refrigerador de laboratório C	Meiling	BCD-402WPCX
Tubo centrífugo cônico de 50 mL	Servicebio	EP-5001-J
-80 ° Freezer de ultra baixa temperatura C	Haier Biomédica	DW-86L828J
Etanol absoluto	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092683
Solução de diferenciação ácida	Servicebio	G1039
Pulverizador em aerossol para intubação de pequenos animais	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	Yan-30012
Conjunto básico de instrumentos cirúrgicos	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	YAN-21A3
Solução de cloridrato de bleomicina	Hanhui Pharmaceutical Co., Ltd	H20055883
Reagente azulado	Servicebio	G1040
Ventilador de mecânica pulmonar de pequenos animais controlado por computador	EMKA Biotech Beijing Co., Ltd.	FX-2
Fita isolante elétrica	3M	1500
Solução de coloração com eosina Y	Zhuhai Baso Biotech Co., Ltd	BA4022
Tinta verde de marcação	Piloto	Chiku-rin
Solução de coloração por hematoxilina	Servicebio	G1004
Kit de quantificação de hidroxiprolina	Abcam	ab222941
Exaustor de fluxo laminar	HDL	DL-CJ-1N
Laringoscópio para procedimentos com pequenos animais	Shenzhen Bilead Biology Technology CO., LTD	DXSHJ0
Microscópio óptico	Nikon	E100
Solução de dewaxing de baixa toxicidade	Servicebio	G1128
Kit de coloração tricroma da Masson	Zhuhai Baso Biotech Co., Ltd	BA4079B
Leitor de microplacas com detecção de absorção	Agilent	Sinergia H1
Formol tamponado neutro	Servicebio	G1101-3ML
Meio de montagem neutro	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10004160
Anticorpo Monoclonal Recombinante do Coelho Anti-COL1A1	Huabio	HA722517
Centrífuga refrigerada	Eppendorf	5424R
Água livre de RNase	Generalbiol	TYJC002
Plataforma de intubação traqueal de pequenos animais	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	CG-02M
Solução estéril de cloreto de sódio 0,9%	China Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd	H12020024
Homogeneizador de tecidos	Servicebio	KZ-III
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10023418
Esferas de moagem de zircônia	Servicebio	G0203