Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade do Esporte de Pequim (Aprovação nº 2022034A). Os ratos eram alojados individualmente na instalação veterinária da Universidade de Esportes de Pequim sob condições controladas (temperatura: 22-24 °C; umidade: 45%-55%; ciclo claro/escuro de 12 horas). Fêmeas SHR de 11 semanas e machos de 12 semanas sem patógenos específicos (SPF), juntamente com ratos WKY normotensos com idade pareada, foram obtidos da Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Licença nº SYXK [Pequim] 2021-0053) para fins de reprodução. Os reagentes e os equipamentos utilizados para este estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Animais experimentais e agrupamento
Ratos frágeis receberam uma dieta padrão de reprodução de roedores e água ad libitum. Todos os ratos deram à luz espontaneamente, e seus filhotes foram desmamados para uma dieta padrão de roedores. Para o acasalamento, ratos fêmeas e machos da mesma linhagem (WKY ou SHR) foram alojados juntos em proporção de 1:1. A presença de um tampão vaginal e esperma em um exame vaginal foi usada para designar o dia de gestação 1 (GD1). Após a confirmação da gravidez, os ratos foram aleatoriamente distribuídos em quatro grupos: normotenso sedentário (p-WKY-SED), normotenso exercício (p-WKY-EX), hipertensivo sedentário (p-SHR-SED) ou hipertensivo exercício (p-SHR-EX). Análises experimentais foram realizadas em ratos no dia 21 de gestação (GD21), fetos no dia embrionário 21 (ED21) e descendentes machos e fêmeas de 3 meses de cada grupo.
2. Procedimento de exercício aeróbico materno
Antes do acasalamento, as fêmeas eram aclimatadas à instalação de alojamento por uma semana, seguida por um período de adaptação à água de 5 dias envolvendo 15 minutos de exposição diária a 10 cm de profundidade em água mantida entre 34-35 °C. Após o acasalamento bem-sucedido, os ratos do grupo de exercícios iniciaram um regime estruturado de natação. O protocolo começou com uma fase de adaptação de 4 dias em águas de 40 cm de profundidade (34-35 °C), onde a duração diária da natação foi progressivamente aumentada de 20 minutos iniciais para 10 minutos por dia. Do dia 5 até o dia 20, esses ratos nadaram por 60 minutos por dia, 6 dias por semana. Para controlar o estresse potencial da imersão em água, ratos dos grupos sedentários foram colocados em águas rasas (10 cm de profundidade, 34-35 °C) pelo mesmo período, sem praticar nataçãoativa 10.
3. Medição da pressão arterial
Pressão arterial sistólica (SBP), pressão arterial diastólica (DBP) e pressão arterial média (MAP) foram medidas em ratos descendentes de 3M (tanto machos quanto fêmeas) usando o sistema de punho caudal CODA Monitor sob condições de consciência e repouso. Todas as medições foram realizadas em um ambiente tranquilo entre 8h00 e 12h00, com temperatura ambiente de aproximadamente 25 °C.
A almofada térmica era ligada 1 hora antes e ajustada para 37-38 °C para garantir que o dispositivo atingisse a temperatura desejada antes da medição. Um restritor de tamanho adequado era selecionado com base no peso corporal de cada rato, e o animal era gentilmente guiado para dentro do restritor. Após a fixação, o rato era colocado na almofada térmica por 5 minutos para permitir fluxo sanguíneo suficiente para a cauda. Um manguito de oclusão (O-Cuff) e um manguito de registro de pressão de volume (VPR-Cuff) de tamanho adequado foram selecionados com base no tamanho da cauda do rato. Durante a operação, o O-Cuff foi cuidadosamente posicionado aproximadamente 1 cm da base da cauda, seguido pela colocação do VPR-Cuff sobre a cauda. Após o período de aclimatação de 5 minutos, as medições da pressão arterial foram iniciadas enquanto o rato permanecia consciente e em repouso. Cada rato passou por cinco ciclos de aclimatação seguidos por dez ciclos consecutivos de medição para registrar os dados da pressão arterial. Durante todo o procedimento, os animais foram monitorados de perto e prontamente removidos do sistema de contenção após a conclusão do protocolo de medição.
4. Cirurgia de MI/IR em ratos
Os ratos ficaram em jejum por 12 horas antes da cirurgia, com acesso livre à água. O peso corporal foi medido antes da anestesia. A anestesia foi induzida com 5% de isoflurano e mantida com 2% de isoflurano durante o procedimento. Cada rato era colocado em posição supina e fixado em uma almofada térmica ajustada a 37 °C.
A intubação endotraqueal oral foi realizada usando um cateter de 16 G, que foi inserido suavemente na traqueia e fixado no lugar. O cateter foi então conectado a um sistema integrado de anestesia e ventilação. Os parâmetros de ventilação foram definidos para uma frequência respiratória de 70 respirações por minuto, um volume de maré de 8 mL/kg e uma razão inspiratória/espiratória de 1:2.
Eletrodos eram inseridos subcutâneamente nos membros do rato de acordo com a colocação padrão do chumbo: preto para o membro anterior direito, verde para o membro posterior direito e vermelho para o membro posterior esquerdo. Os eletrodos foram conectados a um sistema experimental de função biológica e bioamplificador, e o monitoramento eletrocardiográfico (ECG) foi realizado usando o software LabChart.
Os pelos do peito do rato foram raspados e o local cirúrgico foi desinfetado com álcool. Foi feita uma incisão na pele do lado esquerdo do esterno, correspondente ao coração. Foi realizada uma dissecação contundente para expor as costelas. Um retrator torácico foi inserido entre a terceira e a quarta costelas para abrir a cavidade torácica. O pericárdio foi cuidadosamente rasgado e separado para expor totalmente o coração. A grande veia cardíaca que acompanhava era usada como ponto de referência. Aproximadamente 1-2 mm abaixo do apêndice auricular esquerdo, um 8-0 A sutura foi passada pela superfície epicárdica para ligar a artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD). Um pequeno tubo de madeira foi colocado no local do nó, e um nó corredístico foi amarrado para obstruir o fluxo sanguíneo. A cavidade torácica foi então rapidamente fechada. A ligadura bem-sucedida foi confirmada pela elevação do segmento ST no eletrocardiograma e cianose visível na região isquêmica do miocárdio.
Após 45 minutos de oclusão, o nó corredante foi afrouxado e o tubo de madeira removido para iniciar a reperfusão. O ar era expelido da cavidade torácica, que então era fechada e suturada. O local cirúrgico foi desinfetado com povidona-iodo, completando o procedimento.
Assim, foi estabelecido um modelo MI/RI após 24 horas de reperfusão. Assim que a respiração espontânea retomava, o tubo endotraqueal era removido e o rato era devolvido a uma gaiola limpa.
5. Ecocardiografia
A avaliação ecocardiográfica foi realizada usando um sistema de ultrassom Doppler colorido de pequenos animais, equipado com uma sonda de matriz linear de alta frequência L22-8K3 (frequência central: 15 MHz). Os ratos foram anestesiados com 5% de isoflurano para indução e mantidos abaixo de 2% de isoflurano durante todo o procedimento. Cada rato foi colocado em posição supina e fixado na plataforma cirúrgica, mantendo a temperatura em 37 °C. O estado respiratório era monitorado continuamente, e a taxa de fluxo de isoflurano era ajustada conforme necessário para evitar anestesia excessivamente profunda ou superficial, que poderia comprometer a precisão das medições de ultrassom cardíaco.
Após a depilação da região do peito, foi aplicada uma quantidade adequada de gel de acoplamento por ultrassom. A sonda de ultrassom foi posicionada sobre a parede torácica anterior esquerda para obter imagens ecocardiográficas em modo M das visões paraesternais de eixo longo e curto do ventrículo esquerdo. Para cada parâmetro, foi calculado o valor médio de seis ciclos cardíacos consecutivos. A função cardíaca foi avaliada medindo o diâmetro interno do ventrículo esquerdo na sístole (LVIDs), o diâmetro interno do ventrículo esquerdo na diástole (LVIDd), o encurtamento fracionado (FS) e a fração de ejeção (FE).
6. Cirurgia MCAO em ratos
Os ratos ficaram em jejum por 12 horas antes da cirurgia, mas tinham acesso livre à água. O modelo MCAO foi estabelecido usando um método otimizado de sutura Zea-Longa. A anestesia foi induzida com 5% de isoflurano e mantida com 2% de isoflurano. Uma vez observado o relaxamento muscular e estabilizado da respiração e da frequência cardíaca, os ratos eram colocados em posição supina e fixados em uma almofada térmica controlada por termostato.
A região cervical do rato era rotineiramente raspada e desinfetada. Foi feita uma incisão na linha média ligeiramente à esquerda do pescoço, e as camadas musculares foram dissecadas de forma romba para expor e isolar a artéria carótida comum esquerda (CCA), a artéria carótida externa (ECA) e a artéria carótida interna (ICA). O ECA foi ligado com fio fino para sutura, e o CCA e ICA foram temporariamente clampeados com clipes para artérias. Foi feita uma incisão no ECA, e o êmbolo do ponto foi inserido no CCA pela abertura do ECA. Após o corte do ECA, ele foi suavemente puxado para baixo para alinhar com o ICA, facilitando um caminho reto para a inserção do êmbolo. O êmbolo foi cuidadosamente avançado para o segmento intracraniano da ACI. A inserção era interrompida ao encontrar leve resistência, indicando o posicionamento correto. Neste ponto, o êmbolo foi inserido a 18-20 mm da bifurcação da ECA e da ICA, correspondente à profundidade pré-marcada, com a ponta ocluindo a origem da artéria cerebral média (MCA).
O diâmetro da ponta do êmbolo foi selecionado com base no peso corporal do rato: 0,31-0,32 mm para ratos <200 g, e 0,38-0,40 mm para ratos com peso de 281-330 g. Após confirmar a colocação correta, o êmbolo foi fixado no lugar, clipes de artéria removidos, a incisão cutânea foi suturada e o local cirúrgico foi desinfetado com povidona-iodo.
A inserção bem-sucedida do ponto foi confirmada por uma redução de mais de 50% na perfusão sanguínea do lado afetado. Após 2 horas de isquemia, o êmbolo foi retirado para iniciar a reperfusão. Um modelo de lesão por isquemia-reperfusão cerebral foi estabelecido após 24 horas de reperfusão.
Déficits neurológicos em ratos foram avaliados 24 horas após o MCAO usando o sistema de pontuação Zea Longa. Os critérios de pontuação foram os seguintes (Tabela 1).
Apenas ratos com escores de Zea Longa de 1 a 3 foram incluídos nas análises subsequentes. Ratos com escores de 0 ou 4 foram excluídos devido à ausência de oclusão eficaz ou lesão cerebral excessiva, respectivamente.
7. Imagem por contraste de manchas a laser (LSCI)
Ratos foram jejuados por 12 horas antes do experimento, mas tinham acesso livre à água. A anestesia foi induzida com 5% de isoflurano e mantida em 2% de isoflurano.
Os ratos foram então colocados em posição deitada e fixados em um aparelho estereotáxico. Após raspar e desinfetar o couro cabeludo, foi feita uma incisão na linha média ao longo do ponto sagital para expor o crânio. O tecido conjuntivo e o periósteo na superfície do crânio foram cuidadosamente removidos. Preservando a integridade da dura-máter, ambos os lados do crânio foram afinados usando uma broca craniana até que o osso se tornasse transparente. Foi criada uma janela craniana medindo 8 mm × 15 mm, permitindo visualizar claramente vasos sanguíneos corticais ao microscópio.
O sistema LSCI foi ativado, e a posição e distância focal do dispositivo foram ajustadas até que a janela craniana fosse claramente visualizada. Foi usada uma fonte de luz laser com comprimento de onda de 780 nm. A área de iluminação foi capturada usando um dispositivo acoplado de carga com tempo de exposição de 15 ms e taxa de quadros de 15 quadros por segundo. Monitoramento contínuo era realizado por 15 a 30 segundos para obter imagens com resolução de 1280 × 960 pixels. O sistema posteriormente converteu as imagens originais dos speckles em mapas de fluxo sanguíneo e dados quantitativos de perfusão.
O fluxo sanguíneo cerebral de base nas regiões de suprimento de MCA em ambos os hemisférios foi registrado pela primeira vez antes da isquemia. O couro cabeludo foi então suturado e desinfetado antes de iniciar o procedimento MCAO. O fluxo sanguíneo cerebral em ambos os hemisférios foi monitorado continuamente imediatamente após a oclusão, 2 horas e 24 horas após a isquemia.
Durante todo o período de monitoramento, a anestesia foi mantida com isoflurano, e a almofada térmica foi regulada para manter a temperatura corporal do rato constante em 37 °C. A aquisição de dados começou quando o animal apresentou respiração e frequência cardíaca estáveis.
8. Coloração por cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC)
A solução TTC de 2% (p/v) foi preparada dissolvendo 0,2 g de pó TTC em 10 mL de soro salino tamponado com fosfato (PBS, pH 7,4). A solução era transferida para um tubo centrífugo envolto em folha de alumínio, completamente vórtice para garantir a dissolução completa e então colocada em um banho-maria pré-aquecido a 37 °C.
Após 24 horas de reperfusão, os ratos foram anestesiados com isoflurano a 5% e eutanasiados por exsanguinação pela aorta abdominal. O coração e o cérebro foram imediatamente colhidos e enxaguados cuidadosamente com 10 mL de PBS. Os tecidos foram congelados rapidamente a −40 °C por 30 minutos, depois inseridos em moldes e seccionados coronalmente de anterior para posterior, com espessura de 2-3 mm por fatia. As fatias foram incubadas em solução de 2% para tentar conceber. Fatias de coração foram incubadas em um banho-maria a 37 °C protegido da luz por 10 minutos, enquanto fatias cerebrais foram incubadas nas mesmas condições por 25 minutos. As fatias eram viradas a cada 5 minutos durante a incubação para garantir uma mancha uniforme. Após a coloração, as fatias foram enxagueadas três vezes com 10 mL de PBS e fixadas em 10 mL de formalina a 10% por 24 horas.
Após 24 horas de fixação, as fatias de tecido eram removidas e secadas suavemente com gaze para remover o excesso de umidade. Cada fatia era colocada em um prato de vidro transparente, e tanto a parte frontal quanto a traseira eram escaneadas. Nas imagens escaneadas, regiões brancas indicavam tecido infarto (isquêmico), enquanto regiões vermelhas representavam tecido viável (não isquímico). A análise de imagem foi realizada usando o software ImageJ para calcular a razão da área do infarto tanto das fatias do miocárdio quanto das cerebrais. Área do infarto do miocárdio (%) = (Área do infarto / Área total do miocárdio) × 100%; Área do infarto cerebral (%) = (Área do infarto do lado MCAO / Área total do hemisfério ipsilateral) × 100%.
9. Notas de segurança e manuseio de materiais perigosos
O isoflurano era manuseado dentro de uma exaustão para evitar a exposição à inalação e armazenado em um local fresco e bem ventilado. Formalina e TTC foram manuseadas com luvas de nitrilo e máscaras faciais para minimizar o contato com a pele e o risco de inalação. O TTC foi reconhecido como fotossensível e, portanto, armazenado e usado em recipientes envoltos em papel alumínio.
A área cirúrgica foi desinfetada com 75% de etanol, e todos os instrumentos foram autoclavados a 121 °C por 20 minutos antes do uso. Os operadores usavam luvas e avental estéreis para manter condições assépticas durante todo o procedimento.
O monitoramento pós-cirúrgico foi realizado a cada 6 horas por 24 horas para garantir o bem-estar animal. Animais que apresentavam sofrimento severo, como tremores contínuos ou falta de alimentação e água, foram imediatamente eutanasiados de acordo com as diretrizes éticas institucionais.
Todo o TTC e os resíduos de formol foram coletados em recipientes de risco biológico rotulados e descartados seguindo o protocolo institucional de gestão de resíduos perigosos. Tecidos animais foram incinerados na instalação designada de resíduos biológicos da universidade. Materiais cirúrgicos contaminados foram autoclavados antes do descarte.
10. Análise estatística
Todos os dados foram apresentados como média ± SEM. Análises estatísticas foram realizadas usando o software GraphPad Prism 8. As diferenças entre os quatro grupos foram avaliadas usando análise bidirecional da variância (ANOVA bidirecional; fatores: hipertensão e exercício). Comparações entre descendentes machos e fêmeas foram avaliadas usando um teste t de Student sem pareamento de duas caudas. O valor P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.