Monitoramento em tempo real da dinâmica induzida por acupuntura no tecido conjuntivo subcutâneo por meio de imagens confocais a laser in vivo

Resumo

Este estudo estabelece a imagem confocal a laser in vivo como um método em tempo real para rastrear a dinâmica morfológica induzida pela acupuntura, como vasodilatação e remodelação do colágeno, em ratos vivos. Usando a marcação de fluoresceína sódica, a abordagem captura respostas teciduais imediatas e tardias, oferecendo uma nova ferramenta para avaliar quantitativamente as terapias físicas, incluindo acupuntura e moxabustão.

Resumo

O monitoramento dinâmico em tempo real dos efeitos da acupuntura é crucial para elucidar seus mecanismos biológicos, mas os métodos histológicos tradicionais não conseguem capturar respostas transitórias no microambiente vivo. Aqui, estabelecemos uma estrutura metodológica baseada em imagens confocais a laser in vivo , permitindo a observação em tempo real e de alta resolução das alterações morfológicas nos tecidos locais após a intervenção com acupuntura. Após a injeção intravenosa de fluoresceína sódica em ratos, alterações dinâmicas na microcirculação e na matriz extracelular (por exemplo, arranjo das fibras colágenas) foram rastreadas durante a acupuntura. Os resultados demonstraram que este método distinguiu claramente as reações teciduais imediatas (por exemplo, vasodilatação) e tardias (por exemplo, resposta inflamatória) induzidas pela acupuntura, com resolução espacial de 0,5 μm e resolução temporal de 3,5 fps. A análise quantitativa subsequente permitiu a medição objetiva dos parâmetros morfológicos. Este protocolo, descrito neste estudo, fornece uma ferramenta de visualização para estudos in vivo dos mecanismos de acupuntura e serve como referência técnica para avaliar os efeitos de outros estímulos físicos (por exemplo, moxabustão).

Introdução

A acupuntura, como pedra angular da medicina tradicional, exerce efeitos terapêuticos por meio de respostas complexas no nível do tecido 1,2,3,4. No entanto, os insights mecanicistas permanecem limitados pela histologia convencional, que captura instantâneos estáticos, mas não consegue resolver a dinâmica em tempo real das adaptações morfológicas (por exemplo, vasomodulação, remodelação da matriz extracelular) em tecido vivo⁵. Embora a microscopia intravital ofereça potencial de imagem dinâmica, sua aplicação na pesquisa em acupuntura é escassa, particularmente para quantificar as respostas espaço-temporais a estímulos físicos ^6,7. Em contraste, essa abordagem de imagem confocal permite a extração quantitativa de parâmetros estruturais e dinâmicos - como a taxa de mudança na velocidade de movimento dos glóbulos vermelhos e no arranjo do colágeno - em tecidos profundos (por exemplo, camadas musculares e pontos de acupuntura ST 36 / GB 34), superando as limitações da microscopia intravital convencional em resolução espacial, imagem volumétrica e rastreamento de longo prazo⁸.

A imagem confocal a laser emergiu como uma ferramenta poderosa para visualização in vivo em resolução celular 9,10,11,12,13. No entanto, os estudos existentes se concentram principalmente em tecidos superficiais (por exemplo, pele ou córnea), com poucos abordando alvos de acupuntura profunda ou integrando análises morfológicas quantitativas. Crucialmente, até onde sabemos, não existe uma metodologia padronizada para correlacionar a manipulação da acupuntura com as alterações cinéticas dos tecidos vivos.

Aqui, preenchemos essa lacuna estabelecendo uma plataforma metodológica baseada em imagens confocais para rastreamento em tempo real de eventos morfológicos induzidos por acupuntura. Usando fluoresceína de sódio (administrada por via intravenosa na concentração de 1%, 0,1 mL / 100g de peso corporal) como agente de contraste, obtemos monitoramento de alta resolução (resolução espacial de 0,5 μm / resolução temporal de 3,5 fps) de alterações microcirculatórias e de matriz em um campo de visão de 450 μm × 450 μm em até 400 μm de profundidade - da vasodilatação imediata às cascatas inflamatórias tardias - durante a estimulação da acupuntura. Essa abordagem permite ainda a reconstrução 3D e a quantificação de parâmetros do realinhamento das fibras colágenas, superando as limitações da histologia final.

As considerações práticas para a implementação deste protocolo são (i) o hardware recomendado inclui um sistema confocal com resolução de ≥0,5 μm e taxa de aquisição de ≥3 fps, (ii) as limitações típicas incluem fotobranqueamento além de 90 s de imagem contínua e sensibilidade ao movimento respiratório ou tecidual, e (iii) a penetração em profundidade pode ser reduzida em tecidos altamente densos ou dispersos. Até onde sabemos, este trabalho não apenas fornece o primeiro atlas dinâmico da reorganização tecidual evocada por acupuntura, mas também estabelece um precedente para a avaliação de terapias físicas (por exemplo, moxabustão) em sistemas vivos. Ao converter respostas fisiológicas transitórias em métricas quantificáveis, oferecemos um novo paradigma para estudos mecanicistas de terapias neuromoduladoras.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Instituto de Acupuntura e Moxabustão, Academia Chinesa de Ciências Médicas Chinesas (nº D2023-01-29-01). Oito ratos machos Sprague Dawley (SD) (8 semanas de idade, 200-220 g) foram obtidos da Biotechnology Co., Ltd. (Licença nº. SCXK (Jing) 2020-0001). Os animais foram alojados em recintos de isolamento esterilizados sob condições controladas: ciclo claro-escuro de 12 horas, temperatura de 21 ±± 2 °C, com acesso ad libitum a pellets de ração padrão e água. Todos os experimentos obedeceram às diretrizes institucionais e ao Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

NOTA: Um fluxograma destacando os principais procedimentos é mostrado na Figura 1.

1. Preparação do animal e do traçador: Fluoresceína sódica (FS)

1. Para preparar uma solução de coloração de fluoresceína sódica (FS) a 1%, dissolva 0,1 g de FS em 10 mL de solução salina estéril (NaCl a 0,9%). Armazene a solução em temperatura ambiente (RT) para uso subsequente.
2. Anestesiar ratos SD via indução de isoflurano (indução: isoflurano a 5%, manutenção: isoflurano a 2,5%). Remova os pelos da região craniana (excluindo a cabeça) usando uma tesoura elétrica e aplique o creme depilatório por 5 min. Elimine o creme e o cabelo residuais enxaguando com água morna.
   NOTA: Mantenha a lâmina do aparador paralela à superfície da pele durante a operação para evitar lesões dérmicas que possam comprometer a análise quantitativa de imagem. A água morna deve ser estritamente usada para enxágue para evitar que a hipotermia animal afete os resultados experimentais.

2. Injeção de FS

1. Prenda o rato.
   1. Anestesiar ratos depilados por meio de injeção intraperitoneal de uretano a 10% (1 g/10 mL, em solução salina) na dosagem de 1,0 g/kg.
   2. Ao atingir a anestesia completa, prenda os animais em decúbito dorsal na plataforma de operação. Aplique um toque suave na pata traseira usando uma pinça e observe a ausência de reflexo de retirada. Verifique a perda do reflexo da córnea tocando levemente a córnea com uma ponta de algodão úmida.
   3. Confirme a falta de resposta sustentada e a frequência respiratória estável antes de prosseguir com o procedimento. Durante a anestesia, mantenha a temperatura corporal do animal com uma almofada de aquecimento a 37 °C.
      NOTA: A anestesia completa deve ser confirmada para evitar movimentos involuntários que comprometam a realocação da janela de imagem.
2. Administre por via intravenosa solução de FS a 1% através da veia da cauda na dose de 0,1 mL por 100 g de peso corporal.
   1. Realize a injeção da veia da cauda usando uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de 27 G. Limpe a cauda suavemente com água morna para promover a vasodilatação, seguida de desinfecção com etanol a 70%.
   2. Insira o chanfro da agulha em um ângulo raso (≤15°) ao longo do eixo longitudinal da veia. Injete a solução lentamente a uma taxa de 0,1-0,2 mL / min.
   3. Garanta o fluxo livre de resistência técnica, ausência de edema perivascular e confirme a injeção bem-sucedida por descoloração amarela das pupilas, pavilhões auriculares e patas.
      NOTA: A injeção intra-arterial acidental deve ser estritamente evitada.

3. Configuração de endomicroscopia confocal a laser (pCLE) de sonda in vivo

1. Ative o sistema pCLE e verifique a limpeza do conector da sonda de varredura e da ponta distal.
2. Limpe a ponta distal da sonda (também chamada de ponta de varredura) usando um cotonete umedecido com solução salina fisiológica e seque suavemente com o lenço da lente.
3. Posicione a sonda laser no local de observação do alvo (por exemplo, região medial da coxa). Prenda a sonda de imagem confocal usando uma pinça ajustável, garantindo um contato estável com a superfície do tecido sem artefatos de compressão, e fixe-a apertando o botão de ajuste.
4. Conecte a sonda ao sistema pCLE e configure os parâmetros de aquisição (por exemplo, campo de visão [FOV], diretório de armazenamento). Os parâmetros específicos utilizados neste experimento são os seguintes:Profundidade: 18 μm; Laser: 219 mW; Brilho: 76%; Velocidade: 1920 × 540; Ganho: 2400; Zoom: 1× (464 μm); Filtro: LP 515; Tabela de pesquisa: Varredura cinza.
   NOTA: Os parâmetros de imagem (profundidade de varredura/potência do laser) foram otimizados iterativamente até que uma visualização distinta da arquitetura do tecido fosse alcançada. A intensidade consistente é crítica para a comparabilidade longitudinal da imagem. A adição de gotículas salinas de 37 °C na interface sonda-tecido eliminou a perda de sinal observada nas iterações iniciais. A potência do laser usada neste estudo está abaixo do limite comumente aceito para fototoxicidade em imagens confocais in vivo .

4. Imagem da estrutura organizacional com pCLE e aquisição

1. Posicione a sonda na superfície da pele e inicie a aquisição de dados para visualizar a arquitetura do tecido.
   1. Segure a sonda com um punho de lápis; manobre-o para regiões-alvo (por exemplo, áreas com vasculatura ou tecido conjuntivo fibroso dentro do campo de visão), coloque a ponta distal diretamente na zona de imagem e, em seguida, estabilize-a por meio do braço da sonda.
2. Primeiro, adquira a arquitetura do tecido basal por 1 min em condições fisiológicas, seguido de 5 min de gravação durante a intervenção de acupuntura. Encerrar a aquisição pós-intervenção. Os arquivos de dados são salvos automaticamente no diretório especificado na etapa 3.3-3.4.
   NOTA: Os arquivos são salvos como pilhas de camadas (.tiff) e quadros individuais (.tiff).

5. Intervenção de acupuntura

NOTA: A aquisição na etapa de imagem é realizada durante a intervenção.

1. Insira uma agulha de aço inoxidável descartável de 1 cun (a unidade chinesa de medida de comprimento é de aproximadamente 13 mm) no ponto de acupuntura adjacente ao tecido observado pela sonda. Conecte um eletrodo à agulha de aço inoxidável e prenda o outro eletrodo de referência na cauda do rato.
2. Aplique a estimulação por eletroacupuntura (EA) usando os seguintes parâmetros: intensidade de 1 mA, onda densa-dispersa (2/15 Hz), por 5 min.
   NOTA: Mantenha distância suficiente (>3 mm) entre o local de inserção da agulha e a sonda para evitar tremores dérmicos induzidos por EA que comprometem a estabilidade da imagem.

6. Análise de imagem

1. Abra as pilhas de imagens adquiridas no ImageJ. Converta a calibração espacial em micrômetros e transforme o formato da imagem em 8 bits para compatibilidade com plug-ins (Tipo de > de imagem > 8 bits).
   NOTA: As dimensões padrão da imagem são em polegadas (configuração específica do sistema).
2. Defina a região de interesse (ROIs) para: microcirculação: segmento capilar único, estrutura da matriz: região da fibra de colágeno. Mantenha ROIs idênticos em imagens sequenciais para consistência longitudinal.
3. Análise de microcirculação
   1. Selecione a região que contém os glóbulos vermelhos que precisa ser observada e corte a imagem para remover outras áreas interferentes (Retângulo > Imagem > Recorte). Use a ferramenta de limiar para segmentar exclusivamente os glóbulos vermelhos (RBC) (imagem > ferramenta Ajustar > limite).
   2. Carregue o plugin MTrack2 . Defina os parâmetros de rastreamento apropriados com base no tamanho do RBC (neste experimento, 10-42 pixels) para excluir interferência e garantir o rastreamento preciso do RBC (Plugin > Tracking > MTrack2).
4. Análise estrutural matricial
   1. Carregue o plug-in de direcionalidade , selecione o modo de componentes de Fourier e execute uma análise estatística na proporção de distribuição das fibras de colágeno nas orientações de 0° a 180° (Analisar direcionalidade >).

7. Finalização de dados

1. Exporte os dados analisados nos formatos TIFF/XSL usando a convenção de nomenclatura: [Group]_[Date].extension. Faça backup de todos os arquivos brutos e processados em um servidor seguro designado. Registre os resultados quantitativos em uma planilha de resumo para análise estatística.

8. Segurança e gestão de resíduos

1. Equipamento de proteção individual (EPI): Use luvas de nitrilo, jaleco e óculos de segurança ao manusear uretano, isoflurano ou fluoresceína sódica.
2. Manuseio anestésico: Realize procedimentos envolvendo uretano ou isoflurano dentro de uma capela para minimizar a exposição à inalação.
3. Precauções contra objetos cortantes: Descarte todas as agulhas e objetos pontiagudos imediatamente em recipientes designados para perfurocortantes.
4. Segurança da eletroacupuntura (EA): Verifique o isolamento elétrico do equipamento EA e proteja as conexões dos cabos para evitar correntes de fuga ou curtos-circuitos.
5. Descarte de resíduos: Descarte os frascos de isoflurano como lixo médico de acordo com as diretrizes institucionais. Descarte os resíduos de materiais contaminados com corantes (por exemplo, cotonetes, lenços de papel) em recipientes selados de resíduos perigosos. Colete perfurocortantes em caixas de descarte de perfurocortantes certificadas.
   NOTA: Todos os procedimentos devem estar em conformidade com os regulamentos institucionais de segurança e saúde ambiental.

Resultados

Este protocolo demonstra a utilidade do pCLE para avaliação dinâmica em tempo real dos efeitos da acupuntura na microcirculação e na arquitetura da matriz extracelular. Após administração intravenosa de fluoresceína sódica pela veia caudal, as alterações foram avaliadas pela observação de alterações na velocidade dos eritrócitos nos capilares locais e reorganização do arranjo das fibras colágenas.

Resultados representativos em 5...

Discussão

Conforme demonstrado nos resultados, o protocolo de imagem confocal in vivo estabelecido neste estudo permite a análise quantitativa simultânea da dinâmica da matriz microcirculatória e extracelular durante a intervenção de acupuntura usando equipamentos padrão disponíveis comercialmente e marcação fluorescente de rotina. O sucesso desse protocolo depende de duas etapas críticas: tempo preciso de injeção de fluoresceína sódica, garantindo contraste microvascular sustentado

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 agulha de acupuntura cun	Hwato, Suzhou, China	N/A	13 mm/0,25 mm
10% de fluoresceína sódica	Co farmacêutico Ltd, China de Guangxi Wuzhou, China	H45021477
Máquina de anestesia para animais	RWD, Shenzhen, China	R620IE
Monitor de temperatura corporal	RWD, Shenzhen, China	69026
Aparelhos elétricos de acupuntura	Hwato, Suzhou, China	SDZ-III
Creme depilatório	Veet, França
ImagemJ	Institutos Nacionais de Saúde, EUA	https://imagej.nih.gov/ij/
Endomicroscopia confocal a laser com sonda in vivo	Optiscan, Austrália	ViewnVivoB30	Diâmetro: sonda rígida portátil de 4 mm, resistente à flexão e mantém a integridade estrutural ao longo do tempo. Comprimento: ≥ 46 mm. Modo de digitalização: Capacidade de digitalização com zoom.
Isoflurano	RWD, Shenzhen, China	R510-22-16
Uretano	Sigma-Aldrich, EUA	94300