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Artigo de método

Estabelecendo um modelo suíno para estudar a preservação dinâmica e transplante de transplante ocular completo

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DOI:

10.3791/69179

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25 de novembro de 2025

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1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Children's Boston, 3Plastic Surgery Research Laboratory, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 4Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Hospices Civils de Lyon, 5Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, CHU de Rennes, University of Rennes, 6Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Antwerp, 7Bioengineering Research Group, Cardiff Metropolitan University, 8Collaboration for the Advancement of Sustainable Medical Innovation, University College London, 9Division of Plastic Surgery Research, Vascularized Composite Allotransplantation Program Development, Cedars-Sinai Hospital

Neste artigo

Resumo

Um modelo detalhado e reprodutível de transplante de olho inteiro suíno (WET) é descrito, desde a obtenção cirúrgica até o início da perfusão por máquinas, permitindo o estudo da preservação dinâmica de WET em transplantes.

Resumo

O primeiro Transplante Ocular Integral (WET) humano despertou novas esperanças para pacientes que perderam a visão devido a lesão oftalmologista grave, mas desafios significativos ainda precisam ser enfrentados antes que a restauração da visão por meio do WET possa ser alcançável. Entre eles, um dos desafios mais críticos é a preservação ex vivo . O globo ocular, especialmente seus componentes neurais como a retina e o nervo óptico, sofre uma degeneração rápida e irreversível em poucos minutos, a menos que a preservação adequada seja assegurada. O armazenamento estático a frio (SCS) continua sendo o padrão ouro em alotransplante composto vascularizado (VCA), mas não é adequado para preservação ex vivo em HUMIDADE devido à sua incapacidade de suprimir ou apoiar suficientemente o metabolismo, levando à perda da viabilidade e função do enxerto. Perfusão subnormotérmica de máquinas (SNMP) surgiu como uma alternativa promissora ao SCS, oferecendo o potencial não apenas para preservar enxertos, mas também para recondicioná-los. Nosso grupo traduziu com sucesso o SNMP de transplante sólido de órgãos para vários modelos de VCA, demonstrando sua viabilidade e vantagens. Aqui, relatamos a aplicação do SNMP para preservar um WET em suínos, detalhando o modelo anatômico e o protocolo de preservação. Essa abordagem representa um avanço significativo na otimização das técnicas de preservação e transplante de WET.

Introdução

Os alotransplantes compostos vascularizados (ACV) representam um avanço significativo na cirurgia reconstrutiva, oferecendo resultados estéticos e funcionais incomparáveis para pacientes com lesõescomplexas 1,2. No entanto, a perda de visão relacionada ao globo ocular continua sendo uma fonte importante de comprometimento em lesões faciais. O recente primeiro transplante de olho completo (WET) despertou novas esperanças para os pacientes 3,4. Embora a visão não tenha sido recuperada, a imagem funcional demonstrou ativação cortical em resposta à estimulação da luz, e a eletroretinografia (ERG) indicou uma resposta dos fotorreceptores embotada, mas reconhecível, à luz5. Apesar de feitos técnicos excepcionais, desafios substanciais ainda precisam ser enfrentados para tornar o WET funcional uma realidade clínica. O globo ocular é altamente sensível à isquemia, e a retina e o nervo óptico sofrem degeneração irreversível dentro de minutos após o tempo de isquemia quente (WIT), a menos que a oxigenação adequada e os níveis de pH sejammantidos 6. Assim, a WET apresenta desafios específicos dentro do campo do VCA, e múltiplos fatores devem ser considerados, incluindo tanto os segmentos posterior quanto anterior, bem como os componentes extraoculares. Em particular, a musculatura é fundamental para alcançar resultados funcionais bem-sucedidos, pois é altamente suscetível a lesões por isquemia quente, que são ainda mais agravadas pela isquemia-reperfusão 7,8. A privação de oxigênio leva a danos celulares e à liberação de padrões moleculares associados ao dano (DAMPs). Após a reperfusão, esses DAMPs ativam o sistema imunológico do receptor, desencadeando inflamação e infiltração de células imunológicas. Esse ambiente inflamatório acelera a rejeição ao promover a apresentação de antígenos e a ativação das células T9. Além de superar desafios como a reconexão do nervo óptico, o WET exigirá técnicas otimizadas de perfusão ex vivo para prevenir danos resultantes do WIT ou armazenamento estático a frio (SCS) e, eventualmente, alcançar a restauração davisão 5,7,9,10,11.

A perfusão por máquina (MP) está bem estabelecida no transplante de órgãos sólidos como método para prevenir lesões porisquemia-reperfusão 12,13,14, com a perfusão subnormotérmica de máquina (SNMP) apresentando resultados superiores em comparação com a SCS em vários modelos 15,16,17. Traduzimos com sucesso SNMP em modelos animais que vão desde roedores18,19 atésuínos 20,21,22 e, recentemente, primatas não humanos 23. O SNMP não só comprovou sua eficácia na preservação de enxertos por períodos prolongados, como também demonstrou potencial na recondicionamento de enxertos e na mitigação de lesões isquêmicas quentes, possibilitando replantio seguro até 24 horas após a aquisiçãode 24,25 horas. Devido à sua capacidade de manter parcialmente o metabolismo celular, o SNMP também abre novos caminhos ao transformar a fase de preservação em uma plataforma de diagnóstico, terapêutica e pré-condicionamento que pode ser integrada aos protocolos de replantio e transplante no VCA. Desenvolvemos um protocolo SNMP otimizado especificamente para VCAs e o aplicamos a esse cenário desafiador de transplante ocular completo.

Neste estudo, o SNMP é empregado para preservação dinâmica e oxigenada de órgãos à temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C). Essa técnica utiliza uma bomba peristáltica e um oxigenador para circular e oxigenar o perfusado. Um modelo suíno é utilizado, altamente relevante para estudos sobre transplante e preservação de WET devido às suas semelhanças fisiológicas com humanos, tamanho comparável de vasos e ausência única de uma parede orbitallateral 26,27,28. Essa característica o torna particularmente adequado para experimentos ex vivo e estudos de alotransplante, pois a artéria carótida externa e a artéria oftálmica estão diretamente conectadas, permitindo que o WET seja obtido exclusivamente pela artéria carótida externa e pelas veias jugulares, sem necessidade de dissecação intracraniana para experimentos ex vivo e in vivo replantação ortotópica ou heterotópica. A extração é realizada após a morte circulatória, alinhando-se com os protocolos de doação após morte cardíaca e permitindo um atraso na obtenção até que outros órgãos sólidos sejam colhidos. Esse modelo, portanto, explora ainda mais o potencial do SNMP na recondicionamento de enxertos altamente sensíveis após isquemia quente e apoia o desenvolvimento de técnicas de preservação de WET em laboratórios de transplante já estabelecidos que já focam em outros órgãos, aderindo aos princípios "3-R" de refinamento, redução esubstituição 29,30. Além disso, continua relevante para compras emocionantes seguindo passos semelhantes. O objetivo é estabelecer um modelo de preservação confiável baseado nos pedículos carótidos e jugulares externos e avaliar sua viabilidade para preservação dinâmica. São fornecidos passos processuais detalhados, abrangendo a aquisição de corrupção, preservação e aspectos-chave da implementação do SNMP.

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Protocolo

A aprovação institucional para este estudo foi obtida do Comitê Local de Cuidado e Uso Institucional de Animais (protocolo #2024N000205). Todo o trabalho com animais seguiu as diretrizes31 do Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments e estava de acordo com as recomendações do Escritório de Cuidado e Uso de Animais do Exército dos EUA (ACURO)32. Todos os WETs foram adquiridos de suínos que passavam por procedimentos terminais de aquisição de órgãos, seguindo os princípios "3-R" 33. Animais pesando entre 30 kg e 50 kg foram eutanasiados por exsanguinação após receberem 100 UI/kg de heparina, e enxertos WET esquerdos foram usados para experimentos. Os WETs certos serviam como controles. A obtenção de órgãos ocorreu após a autópsia com menos de 180 minutos de isquemia morna. Consulte a Tabela de Materiais para detalhes sobre todos os reagentes e equipamentos usados no protocolo.

NOTA: Os dados foram registrados em uma planilha (por exemplo, Excel), e análises estatísticas foram realizadas usando um software estatístico apropriado (por exemplo, GraphPad Prism). O risco de alfa foi definido em 5% e era de duas caudas. Para cada variável monitorada, a média e o erro padrão da média foram determinados. O teste de Spearman foi usado para estudar correlações entre parâmetros de perfusão.

1. Preparação para perfusão por máquina (1 dia antes do experimento)

  1. Configure o sistema de perfusão da máquina34 (veja a Figura 1).
    1. Montar os componentes do sistema de perfusão: bomba, oxigenador, armadilha de bolhas, sensor de pressão contínua e sensor de peso.
      NOTA: O comprimento do tubo deve ser mantido ao mínimo necessário para montar todos os componentes do montagem. Uma vez montada, lembre-se de que a calibração de pressão é específica para o sistema, especialmente para o comprimento dos tubos.
    2. Conecte o sistema como um circuito semi-fechado de recirculação para bombear o perfusado do reservatório para o oxigenador, depois para a entrada do enxerto (artéria carótida). O escoamento venoso drena de volta para o reservatório (Figura Suplementar 1 e Vídeo Suplementar 1).
    3. Conecte o sensor de pressão ao tubo de entrada.
    4. Coloque o enxerto na plataforma tridimensional (3D) posicionada na balança eletrônica.
    5. Conecte tanto a balança quanto o sensor de pressão ao microcontrolador.
    6. Conecte o microcontrolador ao computador do operador para monitoramento em tempo real e registro contínuo de dados.
    7. Prepare a câmera térmica para monitoramento de temperatura.
      NOTA: O monitoramento do peso, como substituto para a formação de edema, é crucial, pois serve como um indicador precoce de lesão do enxerto durante a perfusão35.
  2. Limpe cuidadosamente os componentes do circuito antes de iniciar a perfusão e preste atenção especial ao oxigenador, especialmente se ele já foi usado várias vezes.
    1. Comece lavando todos os tubos separadamente com etanol 70%, depois com água desionizada estéril.
    2. Montar o sistema e circular 2 L de água desionizada estéril para lavar o oxigenador a uma vazão de 50-100 mL/min, caso já tenha sido utilizado.
      NOTA: Para estudos de replantio de animais vivos, utilize um novo oxigenador estéril e esterilize todos os outros componentes de perfusão com óxido de etileno (ETO)
  3. Prepare a solução perfusada. Para perfusão de máquinas subnormotérmicas, use uma solução Steen+ otimizada paraVCA 24,34,36. No total, use 1,5 L por enxerto, seguindo a composição detalhada previamenterelatada de 34.
  4. Adicione solução de hidróxido de sódio ao perfusado para alcançar um pH de 7,5-7,6. Defina esse valor inicial deliberadamente alto, pois o pH diminuirá durante a circulação quando a mistura de carbogênio (95% oxigênio, 5% dióxido de carbono) se dissolver.
  5. Calibre os sensores de peso e pressão para garantir medições precisas.
    1. Coloque a balança para considerar o peso da plataforma.
    2. Para medir com precisão a pressão vascular, calibre o sistema de acordo com o manômetro do cateter e a taxa de fluxo utilizados: meça a pressão do sistema para cada tamanho de cateter que possa ser usado em intervalos regulares de vazão (a cada incremento de 0,5 mL, de 0 a 20 mL/min).
    3. Durante os experimentos, para calcular a pressão arterial, subtraia-se a pressão de calibração da pressão total que está sendo medida. A tabela de calibração usada nesses experimentos é fornecida como exemplo (Figura Suplementar 2).
      NOTA: A calibração é específica para cada configuração. Repita a calibração após qualquer alteração no tubo, oxigenador ou perfuso, pois essas modificações podem alterar a pressão do sistema.

2. Aquisição pós-morte de WET

NOTA: Para simular a doação após morte cardíaca e/ou obtenção post-mortem, o animal deve ser eutanasiado de acordo com as diretrizes locais da IACUC. Prefiro exsanguinação à injeção intravenosa de pentobarbital para evitar toxicidade de medicamentos que possa interferir no estudo.

  1. Mantenha o animal eutanasiado na posição deitado. Raspe e esfregue a região da cabeça e do pescoço e coloque cortinas estéreis.
    NOTA: O modelo anatômico é apresentado na Figura 2, e um guia de dissecação passo a passo é fornecido no Arquivo Suplementar 1.
  2. Desenhe as marcas cutâneas do retalho.
    1. Certifique-se de que as marcas consistam em uma linha ao redor da órbita, a 2 cm da borda orbital, e uma incisão estendida 1 cm abaixo do canto lateral em direção ao pescoço.
    2. Realize a incisão com um bisturi n°23 através da pele e do tecido subcutâneo até o osso nas partes superior e inferior da órbita, incluindo o perióstio. Nos lados anterior e posterior do retalho, certifique-se de que a incisão alcance o plano fascial.
  3. Comece a dissecação com a parte anterior da órbita usando tesoura Stevens e uma pinça Adson.
    1. Eleve o conteúdo orbital em um plano subperióstico em direção às paredes orbitais com um elevador periósteo.
    2. Identifique e divida estruturas próximas à parede orbitária usando um bisturi de lâmina n°15, incluindo as inserções do músculo oblíquo e o plexo venoso orbitário, que sai da órbita para se unir à veia frontal.
      NOTA: A veia frontal drena para a veia facial, que pode ser sacrificada para economizar tempo, desde que o ramo anastomótico com a veia oftálmica seja preservado.
  4. Continue a dissecação na parte posterior da órbita. Com um bisturi, ressecar o músculo masseter em sua inserção zigomática, seguido pelo ramo ascendente da mandíbula com um cortador ósseo de Liston. Desarticule o côndilo manualmente girando externamente o fragmento da mandíbula.
  5. Divida o ligamento orbitário que se estende do processo zigomático até o osso frontal para acessar a porção orbitária do músculo temporal. Ressecar o músculo temporal.
  6. Com um elevador periostal, crie um túnel subperiostal sob o arco zigomático em direção à margem orbital anterior. Use uma serra recíproca para cortar o osso. Identifique a artéria oftálmica localizada na porção inferolateral do cone orbitário abaixo do músculo temporal.
  7. Ressecar o arco zigomático e as paredes orbitais antero-inferiores usando um rongeur.
    NOTA: Esses passos fornecem acesso ao aspecto inferolateral do cone orbital e seu pedículo vascular.
  8. Identifique e disseque com tesouras Stevens finas e pinças microcirúrgicas ambos os ramos da artéria oftálmica à medida que entram no conteúdo orbital.
    NOTA: A maioria dos vasos (artéria carótida externa e veia jugular superficial) está localizada abaixo da mandíbula, exceto a veia facial, que é superficial à mandíbula.
  9. Após isolar o comprimento desejado da artéria carótida externa e da veia jugular, complete a dissecação seccionando o nervo óptico, os nervos oculomotores e o pedículo vascular usando um bisturi.

3. Preparação para perfusão

  1. Em uma mesa lateral, dilate a artéria carótida usando um dilatador microcirúrgico e insira um angiocateter. Prenda a canulação com gravatas de seda 3-0.
    NOTA: Neste protocolo, um angiocateter 18-G foi usado para todas as artérias. Se o pedículo arterial for curto, deve-se tomar cuidado para não inserir o cateter muito longe para evitar a canulação seletiva de apenas um dos dois ramos oftálmicos. A veia jugular não precisa ser canulada a menos que seja utilizado um sistema de perfusão em malha fechada, o que não ocorreu nesse protocolo.
  2. Para lavar a artéria carótida, use uma seringa de 10 mL montada com um sensor de pressão idêntico ao usado no sistema de perfusão. Use 10 mL de heparina (100 UI/mL) para lavar os vasos e deixar o fluxo livre. Mantenha abaixo de 35 ± 5 mmHg, pois alta pressão pode levar a lesões microvasculares e falha de perfusão.

4. Perfusão subnormotérmica de máquinas

  1. Conecte a artéria canulada do enxerto ao tubo de entrada do sistema de perfusão da máquina e coloque o enxerto na escama.
  2. Ligue a bomba ajustada em 2-4 mL/min.
    NOTA: O fluxo de perfusão e as taxas de pressão dependem do protocolo utilizado. Para a ACV, um regime estável e de baixo fluxo é utilizado para prevenir danos capilares e formação de edema.
  3. Avalie parâmetros de viabilidade em cada ponto de tempo pré-definido tanto na entrada quanto na saída usando uma seringa de 1 mL e analisando amostras com a máquina do sistema de gases sanguíneos (por exemplo, métricas de gases sanguíneos [pH, pCO2,pO 2, lactatos, excesso de base, bicarbonato], glicose, sódio, potássio, cálcio, cloreto). Isso nos permite calcular o estado metabólico do enxerto de acordo com as equações apresentadas na Tabela 1.
    NOTA: Neste protocolo, a perfusão dura 18 horas, e amostras do fluxo de entrada e saída são coletadas a cada hora nas primeiras 6 horas e depois a cada 3 horas nas 12 horas restantes.

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Resultados

Um teste preliminar de viabilidade foi realizado ao longo de um período de 6 horas de SNMP, seguido por 2 horas de perfusão automática normotérmica (PNN) com sangue total para avaliar a reperfusão adequada de todo o enxerto e simular a replantação. Durante a fase SNMP, observou-se um fluxo constante de saída, e a simulação subsequente de reperfusão sanguínea total demonstrou a recoloração bem-sucedida de todo o enxerto. Os parâmetros de perfusão confirmaram ainda mais a viabilidade da té...

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Discussão

Mais de duas décadas após os primeiros casos clínicos, o VCA continua enfrentando desafios significativos de preservação imunológico e ex vivo , limitando sua ampladisponibilidade a 37. Esses desafios são ainda mais evidentes no caso do WET, que oferece perspectivas empolgantes para a restauração da visão, mas apresenta obstáculos únicos, como alcançar a reconexão bem-sucedida do nervo óptico, preservar a funcionalidade dos segmentos anterior e posterior ...

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Divulgações

Alguns autores declaram interesses concorrentes. Os Drs. Uygun, Lellouch e Cetrulo possuem pedidos de patente relevantes para este estudo. Os Drs. Korkut Uygun e Basak Uygun têm interesse financeiro e fazem parte do Conselho Consultivo Científico da Sylvatica Biotech Inc., uma empresa focada no desenvolvimento de tecnologia de preservação de órgãos com níveis altos de zero (subzero). Interesses concorrentes para investigadores do MGH são gerenciados pelo MGB de acordo com suas políticas de conflito de interesses. Todos os autores restantes declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente financiado pelos National Institutes of Health sob o prêmio nº R01AR082825 (BEU), R01EB028782 (KU), DoD RTRP RT240044 (KU, AGL, CLC), Shriners Children's 84308 (YB) e sub-prêmio ARPA-H FY25.1065.001 (CLC), e pela National Science Foundation sob o Grant No. EEC 1941543 (KU). HO e YB receberam financiamento da Fondation des Gueules Cassées. O apoio da Société Française de Chirurgie Plastique, Reconstructrice et Esthétique (SOFCPRE, França) à HO e YB é amplamente reconhecido.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pinças AdsonFerramentas Científicas Finas11019-12Ferramenta cirúrgica
Sistema de Oxigenação Pixie de AfinidadeMedtronicBBP241Oxigenador
Angiocath (24 G)Becton Dickinson381112Cateter de canulação
Albumina sérica de BovinSigma-AldrichA9647Componente de perfusar
Diidratado de cloreto de cálcioSigma-Aldrich223506Componente de perfusar
Dióxido de Carbono OxigênioAirgasUN3156Mistura de Dióxido de Carbono e Oxigênio   gas 
Cateter 24 GDutscher921048Canulação artéria
D-(+)-Glicose monohidratoSigma-Aldrich49159Componente de perfusar
DexametasonaSigma-AldrichD2915Componente de perfusar
DextranTermociência406271000Componente de perfusar
Pinças dilatadorasAROSurgical11.946.1102Ferramenta cirúrgica
Excel MicrosoftPlanilha
Injeção de heparina sódicaEugia Pharma63739-953-25Componente de perfusar
Humulina Insulina Regular humanaLilly0002-8215-01Componente de perfusar
Succinato de sódio de hidrocortisonaPfizer0009-0011-03Componente de perfusar
LigaclipEthiconMCS20Clipes vasculares cirúrgicos
Cortador de ossos ListonFerramentas Científicas Finas16104-19Ferramenta cirúrgica
Cloreto de magnésio hexa-hidratoSigma-AldrichM9272Componente de perfusar
MasterFlex L/SCole-Parmer77200-32Bomba de rolos
Pinças microcirúrgicasFerramentas Científicas Finas11253-20Ferramenta cirúrgica
Elevador perióstealAROSurgical46.415.18Ferramenta cirúrgica
Polietilenoglicol 35000Sigma-Aldrich25322-68-3Componente de perfusar
Cloreto de potássioSigma-Aldrich7447-40-7Componente de perfusar
Monitor de Pressão, Portátil, PM-P-1Instrumentação de Sistemas VivosPM-P-1Sensor de pressão
Prism GraphPadv. 10.1.1Software de análise estatística
Radnoti  Câmara de Conformidade com Armadilha de BolhasRadnoti130149Armadilha de bolhas
RAPIDPoint 500Siemens500Sistema de Gases Sanguíneos
Serra reprecandoStryker5100-37Ferramenta cirúrgica
RongeurFerramentas Científicas Finas16002-18Ferramenta cirúrgica
Lâmina de bisturi (n15)Ferramentas Científicas Finas10015-00Ferramenta cirúrgica
Lâmina de bisturi (n23)Ferramentas Científicas Finas10023-00Ferramenta cirúrgica
Sutura de seda 3-0EthiconP683HSutura
Bicarbonato de sódioSigma-AldrichS5761Componente de perfusar
Cloreto de sódioSigma-AldrichS9888Componente de perfusar
Hidróxido de sódioSigma-Aldrich72068Componente de perfusar
Fosfato de sódio monobasique diidratado  Sigma-Aldrich71505Componente de perfusar
Tesoura StevensAROSurgical07.367.13Ferramenta cirúrgica
Seringa 1 mLBD309659Aquisição de amostras
Seringa 10 mLDutscher300912Enxuste de enxerto
Câmera térmicaFlir Onehttps://www.flir.fr/products/flir-one-gen-3/?vertical=condition+monitoring&segment=solutionsMonitoramento da temperatura de perfusão
Tubulação (n° 16)Masterflex13-310-282Montagem de perfusão por máquina
Cloridrato de vancomicinaA Slate run pharmaceuticals70436-021-82Componente de perfusar

Referências

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