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Dissecção de músculos de voo indireto de Drosophila melanogaster para abordagens de microscopia

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DOI:

10.3791/69185

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7 de novembro de 2025

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1Division of Biological and Biomedical Systems, School of Science and Engineering, University of Missouri Kansas City

Neste artigo

Resumo

Drosophila é um modelo poderoso para entender os mecanismos fundamentais da miogênese. Este protocolo para a dissecção e preparação de hemissecções de tórax permite a análise microscópica do músculo de voo indireto dos estágios pupal e adulto. Este protocolo permite imagens confocais da morfologia celular, localização de proteínas, estrutura muscular e vários outros aspectos da miogênese.

Resumo

Os músculos de voo indireto (IFMs) de Drosophila melanogaster são um modelo genético poderoso para explorar os princípios fundamentais da miogênese. O mecanismo contrátil e muitos componentes do sarcômero são conservados de moscas a vertebrados, permitindo o estudo de processos celulares desde a regulação transcricional e processamento de RNA até o metabolismo e mecanobiologia que direcionam e ajustam o desenvolvimento muscular. Muitas dessas vias celulares são alteradas em miopatias humanas, e os estudos de IFM fornecem informações relevantes sobre a etiologia molecular da doença muscular. Em particular, as moscas são adequadas para microscopia para analisar a morfologia e função de miofibras e sarcômeros em todo o processo de miogênese IFM, desde a especificação de mioblastos até a formação, maturação e manutenção de miofibrilas. Aqui, um protocolo é apresentado para a dissecção de IFMs de D. melanogaster em pontos de tempo de pupa e adulto para abordagens de microscopia. Protocolos ilustrados são fornecidos para dissecção de hemitórax de IFMs de pupa tardia e adulta, bem como dissecção em livro aberto de IFMs de pupa precoce. Os procedimentos de fixação, coloração e montagem de amostras e artefatos comuns de dissecção são descritos, com dados representativos demonstrando a compatibilidade da dissecção IFM com diferentes reagentes de fixação. Esses protocolos são aplicados para estudar o alelo SmnE33 hipomórfico do neurônio motor de sobrevivência da proteína de ligação ao RNA (Smn) 26 h após a formação do pupário (APF), APF de 72 h e em IFMs adultos, fornecendo uma nova visão sobre um modelo de atrofia motora espinhal (SMA) e ilustrando a utilidade geral deste protocolo. Este protocolo detalhado facilita o acesso ao sistema modelo IFM e a aquisição de dados de microscopia de alta qualidade para investigar os princípios da miogênese.

Introdução

Os animais têm centenas de músculos que controlam diferentes movimentos, desde permitir a deambulação até facilitar a fala e agarrar uma ferramenta. Para suportar uma gama tão ampla de funções, os músculos diferem em tamanho, inserção, capacidade contrátil, metabolismo e expressão gênica1. Um foco importante no campo da biologia muscular é entender como essas diferenças estruturais e funcionais surgem durante o desenvolvimento e são alteradas na doença muscular2. A contração muscular é alimentada por sarcômeros construídos com filamentos finos contendo actina ancorados no disco Z que se interdigitam com filamentos grossos bipolares contendo miosina ancorados na linha M3. Os sarcômeros são organizados de ponta a ponta em miofibrilas, e esse arranjo regular no músculo estriado aparece como faixas claras e escuras alternadas sob um microscópio4, fornecendo um método visual prático para monitorar as mudanças na montagem e organização do sarcômero. Em combinação com abordagens genéticas e bioquímicas, a microscopia forneceu informações importantes sobre processos celulares, como regulação transcricional, processamento de RNA, metabolismo e mecanotransdução 5,6,7 que instruem e ajustam o desenvolvimento e a função muscular. Muitos desses processos celulares são interrompidos em miopatias humanas e distúrbios neuromusculares 8,9, ressaltando a importância de entender o desenvolvimento muscular para obter informações sobre a etiologia da doença muscular. Os avanços na engenharia genética, permitindo a manipulação de células individuais e a marcação endógena de proteínas 10,11 juntamente com os avanços tecnológicos na aquisição e resolução de imagens12,13 garantem a importância contínua da microscopia para a pesquisa muscular. Sistemas modelo com protocolos claros e facilmente implementados para dissecção muscular e preparação de amostras são, portanto, valiosos no campo muscular.

Os músculos de voo indireto (IFMs) de D. melanogaster são um modelo poderoso e bem caracterizado para estudar os princípios básicos da miogênese8. As IFMs consistem em seis músculos dorsais-longitudinais (DLMs) por hemitórax que se formam em modelos de músculos larvais e sete fibras musculares dorso-ventrais (DVMs) que são construídas de novo durante o desenvolvimento pupal 14. Devido à sua acessibilidade perto da linha média, muitos estudos de IFM se concentram nos DLMs, o maior músculo em moscas adultas, abrangendo todo o comprimento de 1 mm do tórax15. No início da pupação, os mioblastos IFM migram de seu nicho na dobradiça do disco da asa para o tórax, onde se fundem para formar miotubos sinciciais16. Após a fixação do tendão em torno de 24 h APF a 27 °C, as miofibras IFM organizam progressivamente seu citoplasma e citoesqueleto, compactam e iniciam a miofibrilogênese de 30-32 h APF17. Novos sarcômeros são adicionados às miofibrilas e as miofibras crescem para preencher o tórax até cerca de 48 h APF. Os IFMs então passam por um processo de maturação concordante com mudanças na transcrição e no splicing que promove a aquisição de propriedades metabólicas e contráteis adultas e a ativação do estiramento18. As moscas adultas eclose da caixa de pupa entre 90 h e 100 h APF a 27 ° C e em aproximadamente 100 h APF (fêmeas em cerca de 98 h APF e machos em cerca de 102 h APF) a 25 ° C19. Os IFMs são um sistema de modelo versátil e relevante. Eles podem ser monitorados em todos os estágios da miogênese, são morfológica e funcionalmente distintos de outros tipos de miofibras na mosca e se beneficiam de uma ampla variedade de ferramentas genéticas acessíveis e abordagens de manipulação 8,20. O mecanismo contrátil, a morfologia básica do sarcômero e muitos componentes estruturais são conservados de moscas para vertebrados5, permitindo a tradução de princípios miogênicos de moscas para humanos. De fato, modelos de doenças neuromusculares como distrofia miotônica, atrofia motora espinhal (AME), miopatias miofibrilares e actinopatias forneceram insights etiológicos e terapêuticos21,22. Notavelmente, as moscas são adequadas para microscopia para analisar a morfologia da miofibra e do sarcômero em toda a miogênese, desde a especificação do mioblasto até a miofibrilogênese e a maturação e manutenção do sarcômero.

Os IFMs de Drosophila têm sido usados para aplicações de microscopia há mais de quatro décadas, contribuindo muito para a compreensão do crescimento e desenvolvimento muscular8. Durante esse período, os protocolos de dissecção IFM foram continuamente adaptados à medida que a tecnologia avançava, levando a uma ampla gama de protocolos apresentados em níveis variáveis de detalhes que são ideais para alguns e abaixo do ideal para outras técnicas de imagem. Por exemplo, os protocolos desenvolvidos para microscopia eletrônica envolvem fortes condições de fixação, seccionamento ultrafino e coloração de contraste com metais pesados 3,23,24,25, mas não são ideais para microscopia de luz. Protocolos desenvolvidos para dissecar rapidamente IFMs do tórax para uso em ensaios bioquímicos ou análises moleculares26,27 perdem o contexto tecidual e podem interromper a estrutura miofibrilar e, portanto, são subótimos para abordagens de microscopia. Abordagens de dissecção foram desenvolvidas para análise do músculo larval ou músculo abdominal adulto 20,28, mas não são ideais para o isolamento de IFMs intactos. As abordagens de imagem ao vivo requerem dissecções minimamente invasivas ou meios especiais para manter o tecido IFM vivo durante o processo de imagem29,30 e não envolvem as etapas de fixação necessárias para preservar os músculos para imuno-histoquímica. Existem vários protocolos para inclusão em parafina ou crioseccionamento de tecidos IFM e são compatíveis com histoquímica ou coloração de anticorpos 27,31,32, mas essas abordagens geralmente envolvem congelamento e desidratação de tecidos que podem alterar a ultraestrutura muscular e limitar o reconhecimento de certos antígenos por anticorpos primários. Protocolos que fixam diretamente os IFMs preservam a morfologia muscular e limitam as mudanças na conformação do antígeno e são desejáveis para muitos experimentos de imuno-histoquímica24. No entanto, esses protocolos também são direcionados a aplicações específicas, por exemplo, protocolos que dissociam IFMs permitindo a análise de miofibrila única por fluorescência, crioEM ou microscopia de superresolução 20,33,34. Outros exemplos incluem protocolos para dissecar fibras IFM intactas do tórax32,35 ou para gerar preparações de montagem inteira ou hemitórax 20,32,36 que permitem a análise de miofibras e sarcômeros em um contexto intacto. Pode ser um desafio para um novo usuário classificar o grande número de protocolos existentes, a maioria dos quais são baseados em texto. Estagiários e pesquisadores de graduação se beneficiariam de um protocolo detalhado de dissecção IFM aplicado a aplicações imuno-histoquímicas padrão.

Este artigo inclui uma série de protocolos para a dissecção e preparação de IFMs de D. melanogaster nos estágios pupal e adulto para abordagens de microscopia imuno-histoquímica. Essa abordagem tem sido usada em publicações recentes que rastreiam as funções de desenvolvimento das proteínas de ligação ao RNA Bruno137 e Rbfox138 ao longo da miogênese do IFM. O protocolo inclui ilustrações detalhadas e imagens passo a passo para orientar os usuários em potencial através da dissecção de hemitórax IFM de IFMs adultos e pupais tardios (48 h a 96 h APF), onde o tórax é dividido ao longo da linha média, mantendo a estrutura da miofibra intacta. Além disso, este protocolo abrange a dissecção em livro aberto dos estágios iniciais de pupa (8 h a 48 h APF), onde a porção ventral do tórax é cortada e levantada, como se abrisse um livro, para expor os IFMs intactos ligados à epiderme dorsal. Outras etapas do protocolo incluem fixação, coloração e montagem de amostras, e dados representativos demonstram que essa abordagem é compatível com diversos métodos de fixação para preparar tecidos para imuno-histoquímica e microscopia de fluorescência. Exemplos representativos são fornecidos para ajudar novos usuários a identificar artefatos comuns de dissecação. O protocolo é aplicado para analisar o fenótipo IFM de desenvolvimento de SmnE33, um alelo hipomórfico do neurônio motor de sobrevivência (Smn) usado como modelo de mosca de Atrofia Motora Espinhal (SMA) 21 , 39 , em 26 h APF, 72 h APF e em IFMs adultos. Os dados apresentados aqui fornecem informações sobre a função muscular específica do Smn e destacam a aplicabilidade deste protocolo de dissecção para estudar o desenvolvimento muscular e a etiologia da doença muscular.

Protocolo

Declaração ética:
Todos os experimentos neste protocolo usam Drosophila melanogaster, um inseto holometábolo. Os invertebrados não estão sujeitos aos regulamentos de bem-estar animal nos Estados Unidos da América e seu uso não requer aprovação ética. Todo o trabalho foi conduzido de acordo com as diretrizes institucionais padrão de biossegurança e segurança laboratorial e foi aprovado pelo Comitê Institucional de Biossegurança da Universidade de Missouri Kansas City sob o protocolo número 21940 (22-11).

1. Dissecção do hemítórax da IFM adulta (Figura 1)

  1. Reúna os suprimentos necessários, incluindo duas pinças Dumont # 5 com dicas de biologia, uma pinça Dumont # 3, uma tesoura de mola Vannas, uma pipeta de plástico, um pincel, uma placa de 24 poços, lenços sem fiapos, uma lâmina de microscópio e lâminas de criostato (consulte a Tabela de Materiais). Prepare 1x PBS, PBS-T 0,05% e soluções de fixação (consulte o Arquivo Suplementar 1). Uma visão geral do fluxograma da seguinte dissecção de hemitórax adulto está disponível (Figura Suplementar 1).
  2. Colete adultos com o genótipo e a idade desejados (por exemplo, recém-fechados, adultos de 1 dia ou adultos de 5 dias). Anestesiar moscas de amostra em CO2 ou gelo.
    NOTA: As moscas usadas neste protocolo foram cultivadas em um dia de 12 horas: ciclo noturno de 12 horas em uma incubadora com temperatura e umidade controladas. Drosophila é cultivada de acordo com padrões a 25 °C ou 27 °C, e pode ser cultivada a 18 °C, o que estende o ciclo de crescimento de 10 dias para aproximadamente 20 dias.
  3. Use uma pipeta de plástico para transferir uma gota de 1x PBS40 para uma lâmina de microscópio sob um microscópio de dissecação estéreo.
  4. Transfira as moscas de amostra para a queda de PBS em pequenos grupos usando um pincel ou fórceps (Figura 1A). Remova a cabeça (Figura 1B), asas (Figura 1C - D) e abdômen (Figura 1E) usando uma tesoura de mola Vannas. Deixe as pernas presas (Figura 1F).
  5. Transfira suavemente os toráceos usando uma escova ou pinça para uma solução de fixação de 500 μL em um poço de uma placa de 24 poços. Fixe pelo período de tempo desejado (normalmente 15-60 min) em um nutator/agitador de balanço.
    NOTA: Este protocolo é compatível com vários tampões de fixação, incluindo paraformaldeído, glutaraldeído, metanol, solução de glioxal e outros. Consulte Resultados Representativos e Arquivo Suplementar 1 para obter detalhes sobre como otimizar as condições de fixação. Os fixadores devem ser manuseados com luvas e equipamentos de proteção individual (EPI) apropriados de acordo com as diretrizes de produtos químicos perigosos de sua instituição.
  6. Remova o fixador com uma pipeta de 200 μL e lave em 1 mL de PBS-T a 0,05% em um nutador / agitador por 5 min em temperatura ambiente.
    NOTA: Descarte o fixador seguindo as diretrizes de produtos químicos perigosos da instituição. Para a maioria dos antígenos, os tórax fixos podem ser armazenados em 1 mL de PBS-T a 0,05% por até 2 semanas a 4 °C antes do corte e coloração. Concentrações mais altas de Triton X-100 devem ser testadas antes do uso, pois incubações longas em detergente podem degradar a estrutura do sarcômero.
  7. Remova o tampão com uma pipeta de 200 μL e transfira o tórax usando uma escova ou fórceps para uma gota de 0,05% de PBS-T em uma lâmina de microscópio sob um microscópio de dissecação estéreo.
  8. Oriente o tórax com o escutelo apontando para cima e estabilizado entre um par de pinças Dumont # 3 (Figura 1G-H).
  9. Deslize uma lâmina de criostato pelo tórax para entalhar o escutelo (Figura 1H, J, L) e, em seguida, corte suavemente para baixo ao longo da linha média (Figura 1I, J, L - N) para gerar a hemissecção do tórax expondo os IFMs (Figura 1K).
    NOTA: É importante que a cutícula seja "entalhada" ou rachada antes de cortar os IFMs para evitar o alongamento de artefatos que danificam a estrutura do sarcômero. Não "serra" a lâmina para frente e para trás, pois esse movimento danifica mecanicamente os IFMs, resultando em miofibrilas desgastadas. Muito tampão desestabiliza o tórax entre as pinças e torna o corte mais difícil. Abordagens alternativas incluem estabilizar os tórax, um de cada vez, em fita adesiva dupla para facilitar os cortes, bem como cortar do lado ventral do tórax.
  10. Mova as duas metades do tórax para uma posição na lâmina onde elas permanecerão cobertas de tampão para evitar o ressecamento, mas não atrapalham cortes futuros. Repita os passos 1.8-1.10 até que todos os toráceos tenham sido cortados.
  11. Use uma pinça para transferir hemisseções do tórax da lâmina do microscópio para 500 μL de PBS-T a 0,05% em um poço de uma placa de 24 poços e prossiga com o bloqueio e a imunocoloração (consulte a seção 4 abaixo).

2. Dissecção do hemitórax da IFM pupal tardia (~ 48 h a 96 h APF) (Figura 2, Figura 3)

  1. Estágio das pupas do genótipo desejado e idade até o ponto selecionado no desenvolvimento da pupa (Figura 2). Coletar pré-pupas brancas masculinas ou femininas (Figura 2A, B) com um pincel úmido e incubar em papel de filtro umedecido em uma placa de cultura de células de 60 mm. O estadiamento e a remoção da pupa do caso da pupa foram descritos anteriormente20,26.
    NOTA: As pupas sofrem múltiplas alterações morfológicas à medida que envelhecem, como eversão da cabeça e pigmentação da caixa da pupa, olhos e cerdas19,41 (Figura 2C). Essas características morfológicas podem ser usadas como um guia aproximado para identificar a idade de uma pupa (Figura 2D-E) e para identificar pupas que não se desenvolvem normalmente (Figura 2F). No entanto, para garantir uma linha do tempo de estadiamento precisa, recomenda-se coletar pré-pupas brancas em janelas de tempo estreitas, por exemplo, estadiamento a cada 30 minutos ou a cada 2 h. Pontos de tempo bem posicionados são necessários para distinguir as principais mudanças na estrutura do citoesqueleto e no comprimento da miofibra que ocorrem de 24 h a 35 h APF, bem como para distinguir diferenças na estrutura do sarcômero em 35h, 48 h, 60 h, 72 h, 80 h e 90 h APF18,42.
  2. Reúna os suprimentos necessários, incluindo um pincel, duas pinças Dumont # 5 com dicas de biologia, uma tesoura de mola Vannas, fita adesiva dupla, uma lâmina de microscópio, uma pipeta de plástico, uma placa de 24 poços, Kimwipes e lâminas de criostato (consulte a Tabela de Materiais). Prepare 1x PBS, PBS-T 0,05% e soluções de fixação (consulte o Arquivo Suplementar 1). Uma visão geral do fluxograma da seguinte dissecção do hemitórax pupal está disponível (Figura Suplementar 2).
  3. No momento desejado, use um pincel para transferir as pupas do papel de filtro para uma tira de fita adesiva dupla aderida a uma lâmina de microscópio sob um microscópio de dissecação estéreo com ampliação de 10-20x (Figura 3A, B). Alinhe as pupas na fita voltadas para a mesma direção, com o lado ventral voltado para baixo.
  4. Use uma pinça # 5 para abrir a frente da caixa pupal da primeira pupa, removendo suavemente o opérculo (a região sobre a cabeça) (Figura 3C, D, I).
  5. Com cuidado, use uma pinça # 5 para cortar ao longo da caixa de pupa apenas dorsal à asa e retire a caixa de pupa da pupa em incrementos de 1-2 mm. Fixe a caixa pupal na fita adesiva dupla enquanto se trabalha de anterior para posterior (Figura 3E - G, I). Evite cutucar a pupa em si, em vez disso, insira a ponta da pinça entre a caixa da pupa e a membrana basal / saco pupal ao redor da pupa.
  6. Após a remoção do estojo, use um movimento de escavação com a pinça para levantar (Figura 3H, I) e transfira suavemente a pupa para fora do estojo para uma gota de 1x PBS em uma segunda lâmina de microscópio (Figura 3J, K) para evitar desidratação. Repita as etapas 2.4-2.6 (Figura 3I) até que todas as pupas tenham sido removidas da caixa de pupas.
  7. Remover o abdome das pupas dissecadas com tesoura de mola Vannas (Figura 3L).
    NOTA: O abdômen é removido para permitir uma melhor penetração por fixador na etapa seguinte. Para evitar danos ao tórax, corte diretamente no abdômen, deixando até 30% do abdômen preso ao tórax.
  8. Transfira suavemente a cabeça da pupa com o tórax (Figura 3M) usando uma escova ou pinça para 500 μL de solução de fixação em um poço de uma placa de 24 poços. Fixe pelo período de tempo desejado (normalmente 15-60 min) e lave em 1 mL de PBS-T a 0,05% conforme descrito nas etapas 1.5-1.6.
  9. Remova o tampão com uma pipeta de 200 μL e transfira o tórax usando uma escova ou pinça para uma gota de 0,05% PBS-T em uma lâmina de microscópio sob um microscópio de dissecação estéreo com ampliação de 10x.
  10. Separe uma amostra do resto e oriente-a com o lado ventral para baixo e estabilizada entre um par de pinças Dumont # 3 (Figura 3N).
  11. Deslize uma lâmina de criostato pelo tórax apenas até que a membrana basal e a cutícula estejam abertas e, em seguida, corte em um golpe suave para baixo ao longo da linha média ( Figura 3O ) para gerar as hemisseções do tórax expondo os IFMs ( Figura 3P ).
    NOTA: Não "serra" a lâmina para frente e para trás, pois esse movimento danifica mecanicamente os IFMs, resultando em miofibrilas desgastadas. Muito tampão desestabiliza o tórax entre as pinças e torna o corte mais difícil. Os tórax pupais podem ser cortados com a cabeça presa e orientada para a esquerda ou para a direita.
  12. Mova as duas metades do tórax para uma posição na lâmina onde elas permanecerão cobertas de tampão para evitar o ressecamento, mas não atrapalham cortes futuros. Repita as etapas 2.10-2.12 até que todos os tórais tenham sido cortados.
  13. Use uma pinça para transferir hemisseções do tórax da lâmina do microscópio para 500 μL de PBS-T a 0,05% em um poço de uma placa de 24 poços e prossiga com o bloqueio e a imunocoloração (consulte a etapa 4 abaixo).

3. Dissecção em livro aberto do IFM pupal inicial (~ 15 h a 48 h APF) (Figura 4)

  1. Estágio das pupas do genótipo desejado e idade até o ponto selecionado no desenvolvimento da pupa (Figura 2), conforme descrito acima (Etapa 2.1).
    NOTA: Para dissecações em livro aberto, as pupas devem ser dissecadas em grupos de no máximo 8 a 10 moscas.
  2. Reúna os suprimentos necessários, incluindo um pincel, duas pinças Dumont # 5 com dicas de biologia, uma tesoura de mola Vannas, fita adesiva dupla, uma lâmina de microscópio, uma pipeta de plástico, um prato de dissecação de silicone preto, um prato de mancha de vidro preto, alfinetes de insetos e lenços sem fiapos (consulte a Tabela de Materiais). Prepare 1x PBS, PBS-T 0,05% e soluções de fixação (consulte o Arquivo Suplementar 1). Uma visão geral do fluxograma da seguinte dissecção pupal em livro aberto está disponível (Figura Suplementar 3).
  3. No momento desejado, remova as pupas da caixa de pupas conforme descrito nas etapas 2.3-2.6. Transfira as pupas para uma placa de dissecação de silicone preto preenchida com 1x PBS após a remoção da caixa de pupa (Figura 4A).
  4. Depois que todas as pupas forem liberadas da caixa de pupa, use uma pinça Dumont # 5 para superar a tensão superficial e empurre suavemente as pupas dissecadas para a superfície do silício. Disponha as pupas em uma linha perto do centro do prato (Figura 4B).
  5. Insira duas agulhas de insetos usando uma pinça Dumont # 5 através do abdômen de cada pupa para mantê-la no lugar (Figura 4C, D). Certifique-se de que as pupas estejam orientadas com o lado ventral para cima.
  6. Use uma tesoura de mola Vannas para abrir a membrana basal e a região anterior da cabeça de cada pupa (Figura 4E).
  7. Insira a tesoura na abertura e corte ao longo dos lados direito e esquerdo de cada pupa (Figura 4F, G, Q). Posicione a tesoura e corte logo abaixo do notum em desenvolvimento de volta à junção entre o tórax e o abdômen para remover as pernas e asas com a porção ventral. Certifique-se de que a tesoura esteja inserida horizontalmente e não entre em contato com a porção dorsal do tórax (Figura 4Q).
  8. Use uma pinça Dumont # 5 para agarrar e levantar a porção ventral da pupa e removê-la com uma tesoura de mola Vannas (Figura 4H, I, Q).
  9. Remova o cérebro, o cordão nervoso ventral (VNC), a traqueia e o intestino usando uma pinça Dumont # 5 ( Figura 4J, K , Q ). Tenha cuidado para não perturbar os IFMs em desenvolvimento, que estão diretamente abaixo da traqueia e VNC ligados à epiderme na porção dorsal do tórax.
  10. Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 200 μL para criar uma abertura mais larga. Use uma pipeta de 200 μL com a ponta cortada para lavar suavemente 1x tampão PBS sobre o tórax para remover a maioria dos corpos de gordura restantes para expor os IFMs ( Figura 4L , M ). Seja gentil para evitar rasgar os anexos do tendão que conectam as miofibras à epiderme.
  11. Use uma tesoura de mola Vannas para cortar a linha média do tórax dorsal, criando dois "folhetos" contendo IFMs (Figura 4N).
  12. Corte os folhetos do tórax dorsal do abdome com uma tesoura (Figura 4O, Q) e transfira os folhetos para 300 μL de solução fixadora em uma placa de vidro preto usando uma pinça Dumont # 5 (Figura 4P). Segure os folhetos no estojo da cabeça com a pinça para evitar danificar as miofibras ou tendões do IFM.
  13. Fixe para o período de tempo desejado (normalmente 15 min). Use uma pipeta de 200 μL para remover cuidadosamente o fixador e lave em 500 μL de PBS-T a 0,05%. Prossiga com o bloqueio e a imunocoloração (consulte a etapa 4 abaixo).
    NOTA: Não nutate ou rock samples em pratos de vidro preto. As inserções músculo-tendinosas nos estágios iniciais de pupa são muito frágeis e se rompem com agitação tampão constante, resultando em perda de IFMs. Pipetar lenta e cuidadosamente as extremidades do tampão na cápsula para evitar aspirar as amostras para a ponta da pipeta ao mudar as soluções.

4. Imunocoloração e histoquímica de amostras fixas de IFM

  1. Reúna os suprimentos necessários, incluindo uma pipeta, pontas de pipeta e anticorpos ou corantes necessários. Prepare PBS-T a 0,05%, solução de bloqueio e misturas de anticorpos/corantes (consulte o Arquivo Suplementar 1).
  2. Pipete a solução de lavagem (0,05% PBS-T) das amostras e adicione a solução de bloqueio. Incubar as amostras em solução de bloqueio durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente (com balanço para os passos 1-2, sem balanço para o passo 3).
    NOTA: As amostras podem ser bloqueadas durante a noite a 4 °C. Neste protocolo, as amostras foram bloqueadas em 5% de soro de cabra normal (NGS) em 0,05% de PBS-T. Mais informações sobre as opções de solução de bloqueio são fornecidas no Arquivo Suplementar 1.
  3. Remova a solução de bloqueio dos toráceos usando uma pipeta. Adicione a mistura de anticorpos primários e incube pelo menos 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C (com balanço para as etapas 1-2, sem balanço para a etapa 3).
    NOTA: Este protocolo é compatível com a maioria dos anticorpos primários. Os anticorpos devem ser diluídos em solução de bloqueio. As diluições de anticorpos primários testadas com este protocolo variam de 1:10 a 1:2000 e são determinadas experimentalmente para cada anticorpo individual. Mais detalhes sobre a otimização da coloração de anticorpos primários são fornecidos no Arquivo Suplementar 1.
  4. Remova a mistura de anticorpos primários usando uma pipeta e lave as amostras 3x por 10 min cada, em 0,05% PBS-T.
  5. Adicione anticorpo secundário ou mistura de corantes à amostra. Cubra a amostra com um pedaço de papel alumínio para minimizar o branqueamento. Incubar pelo menos 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C (com balanço para o passo 1-2, sem balanço para o passo 3).
    NOTA: A maioria dos anticorpos secundários e colorações celulares fluorescentes podem ser usados com este protocolo. Muitos anticorpos secundários são usados em uma diluição de 1:500. Nos dados representativos abaixo (ver Resultados Representativos), os núcleos foram marcados com DAPI (estoque de 1 mg / mL, diluído 1: 1: 1000 em 0,05% PBS-T) e F-actina com faloidina rodamina (estoque de 300 unidades / mL, diluído 1: 500 em 0,05% PBS-T).
  6. Remova a mistura secundária/mancha usando uma pipeta e lave as amostras 4x por 10 min cada, em 0,05% PBS-T em temperatura ambiente. Prossiga para a montagem (etapa 5) diretamente após a lavagem.

5. Montagem de amostras coradas em lâminas para análise microscópica (Figura 5)

  1. Monte os suprimentos necessários, incluindo pincel, pinça, lâminas de microscópio fosco, lamínulas (espessura # 1), esmalte transparente, meio de montagem e lenços sem fiapos (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Rotule a área de escrita fosca de uma lâmina de microscópio com o número de amostra relevante ou informações de identificação preferidas (data, genótipo, anticorpo, número da lâmina, etc.).
  3. Adicione espaçadores de lamínula (# 1 lamínulas), deixando cerca de 1 cm entre as lamínulas para a colocação da amostra (Figura 5A-C). Use uma pequena gota de glicerol a 50% para manter os espaçadores no lugar (Figura 5A, D).
    NOTA: Os espaçadores evitam a distorção da amostra ao montar amostras espessas. Os tóraxes adultos normalmente requerem um espaçador de 2 lamínulas de espessura, 48 h APF thoraces um espaçador de 1 lamínula de espessura e folhetos de livro aberto sem espaçador.
  4. Adicione uma gota de meio de montagem ao poço entre os espaçadores de lamínula ou ao centro da lâmina do microscópio se estiver montando amostras de pupa iniciais (Figura 5C-D). Coloque a lâmina sob um microscópio de dissecação estéreo.
    NOTA: Vários tipos de mídia de montagem estão disponíveis. Se estiver usando um meio auto-endurecido, considere um com um tempo de cura de várias horas para permitir tempo suficiente para orientar adequadamente as amostras antes que o meio endureça. Foi demonstrado que os meios de montagem influenciam as dimensões do sarcômero 43,44,45, portanto, o mesmo reagente deve ser usado para todas as amostras em um experimento.
  5. Use uma pipeta para remover o máximo possível de tampão de lavagem das amostras. Transfira imediatamente as amostras usando uma pinça ou pincel para a gota do meio de montagem na lâmina (Figura 5E).
  6. Usando a pinça Dumont #5, organize as amostras em linhas e colunas, certifique-se de que as amostras não estejam sobrepostas e oriente os tóraxos com os IFMs voltados para cima (Figura 5F, J, Q, S). A orientação pode exigir a virada cuidadosa das amostras onde as cerdas/cutícula estão voltadas para cima (Figura 5G, H, K, L, R). Tenha cuidado para não tocar nos IFMs, pois o contato danificará a estrutura do sarcômero (consulte Resultados representativos).
  7. Adicione cuidadosamente uma lamínula # 1 (18 x 18 mm ou 22 x 22 mm) sobre as amostras de tórax (Figura 5M). Se estiver usando espaçadores, pressione suavemente a lamínula até que ela entre em contato com os espaçadores em ambos os lados das amostras (Figura 5N).
  8. Use uma ponta de pipeta ou conta-gotas para preencher a área de sample com meio de montagem até que todos os tórax estejam envoltos (Figura 5O). Evite criar bolhas de ar que interrompam a aquisição da imagem.
  9. Use esmalte transparente para selar a montagem úmida. Lembre-se de selar ao redor da lamínula da amostra e das lamínulas espaçadoras (Figura 5P, S).
    NOTA: Evite usar top coat ou esmalte de secagem rápida, pois eles vedam mal e bolhas de ar se formarão à medida que o meio de montagem evapora.
  10. Lâminas secas por 10 min em temperatura ambiente. Conservar numa caixa deslizante a 4 °C. Os slides podem ser fotografados por vários dias ou semanas.
  11. Amostras de imagem em um microscópio fluorescente, microscópio confocal ou outro sistema de acordo com o projeto experimental. Protocolos para aquisição e análise de imagens estão disponíveis em outros lugares 14,30,46,47,48.

Resultados

O protocolo de dissecção apresentado acima pode ser usado para gerar amostras de alta qualidade para análise microscópica da morfologia da miofibra e do sarcômero IFM desde 8 h após a formação do pupário (APF) usando o método de livro aberto (etapa 3) até os estágios adultos usando a abordagem de dissecção do hemitórax (etapas 1 e 2). Essas dissecções têm sido aplicadas para investigar a formação muscular e sarcômero 18,42,49, função do fator de transcrição 50,51 e regulação do RNA37,38, entre outros. Os resultados representativos fornecidos abaixo demonstram a compatibilidade deste protocolo com diferentes métodos de fixação, detalham artefatos comuns de dissecação e usam o fenótipo mutante SmnE33 para ilustrar a utilidade deste protocolo para abordar questões morfológicas e biológicas celulares no modelo IFM.

A dissecção IFM é compatível com vários métodos de fixação

Um aspecto crítico da preparação de amostras para amostras de histoquímica ou imunofluorescência é a preservação precisa das estruturas celulares por meio da fixação. Os fixadores preservam a estrutura e a morfologia do tecido, prevenindo a degradação e estabilizando as estruturas proteicas e lipídicas por meio da reticulação52,53. Diferentes classes de fixadores, por exemplo, solventes à base de aldeído versus solventes orgânicos, têm diferentes eficiências de penetração e reticulação e afetam diferencialmente o reconhecimento de alvos de anticorpos, visando grupos funcionais distintos53,54. As dissecções IFM são compatíveis com vários métodos de fixação, incluindo paraformaldeído a 4% (PFA), glioxal a 9% e fixação de metanol (Figura 6), enfatizando a utilidade geral desse protocolo de dissecção.

Para comparar o tamanho e a morfologia do sarcômero com a aplicação de diferentes métodos de fixação, foram realizadas dissecções de hemitórax de moscas adultas w1118 de 1 dia. A fixação de PFA a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Figura 6A, E) ou solução relaxante (RS) (Figura 6B, F) foi comparada. A solução relaxante contém ATP e é recomendada para uso na quantificação das dimensões do sarcômero para preservar os sarcômeros em seu estado relaxado20,55 (ver Arquivo Suplementar 1). A fixação de 4% de PFA preserva efetivamente a morfologia do sarcômero, mas uma diferença significativa na largura do sarcômero foi observada entre a fixação de 4% de PFA em PBS vs. RS (Figura 6I, J). A fixação em metanol preservou a miofibra e a estrutura do sarcômero (Figura 6C, G), mas os sarcômeros eram significativamente mais curtos e finos do que com a fixação de PFA a 4% ( Figura 6I As IFMs puderam ser efetivamente preservadas com uma fixação noturna de glioxal a 9% (Figura 6D, H) (a fixação de glioxal a 3% foi ineficaz), o que também alterou significativamente a largura do sarcômero em comparação com a fixação de PFA a 4% (Figura 6I, J). Em conclusão, os hemitórax IFM podem ser efetivamente preservados com múltiplos fixadores. No entanto, como tanto o fixador quanto o tampão podem influenciar a medição das dimensões do sarcômero, os experimentos devem ser planejados com controles adequados e um protocolo de fixação bem definido e consistente.

Artefatos comuns de dissecção e fixação em IFMs

Um desafio com a microscopia, especialmente para novos usuários e estagiários, é distinguir artefatos técnicos de fenótipos de ossos. Para ajudar nessa distinção em IFMs de Drosophila, são apresentados dados representativos dos artefatos e falhas de dissecção mais comumente observados (Figura 6). Os protocolos de fixação requerem otimização do tipo, concentração e comprimento da fixação para evitar sub ou sobrefixação 52,53,54. Usando um curso de tempo de fixação de w1118 dissecções de hemitórax adulto de 1 dia incubadas em PFA a 4% em solução relaxante, observou-se que, enquanto o tempo de fixação de 15 ou 30 minutos preserva com precisão a morfologia do sarcômero, uma fixação de 7 minutos produz morfologias de sarcômero inconsistentes (Figura 6K-M). Além disso, o tecido é menos rígido com um tempo de fixação mais curto, tornando mais difícil cortar e bissetar o tórax sem danificar os IFMs. Artefatos adicionais podem surgir durante o processo de corte e montagem. A estrutura da miofibra IFM pode parecer irregular se a lâmina estiver cega e causar rasgos ou desgaste ( Figura 6N ) ou se a lâmina escorregar ou o corte estiver inclinado ( Figura 6O ). Se as pinças entrarem em contato direto com IFMs fixos durante o manuseio ou montagem, elas causarão uma impressão que pode levar a reentrâncias ou alongamentos e separar os sarcômeros (Figura 6P). O estiramento ou deformação do tórax, seja durante o corte, manuseio ou montagem, também separam os sarcômeros e resultam na perda de um disco Z claramente demarcado (Figura 6Q). Por fim, "serrar" ou "esfregar" os IFMs com uma pinça ou lâmina leva à abrasão e desfiamento, desgaste e desorganização das miofibrilas, especialmente na superfície da miofibra (Figura 6R). Os usuários em potencial devem se familiarizar com esses artefatos técnicos e excluí-los da análise fenotípica.

Progressão do desenvolvimento do fenótipo Smn E33 em IFMs

As dissecções de livro aberto e hemitórax são particularmente úteis para rastrear a trajetória de desenvolvimento de um fenótipo muscular e identificar quando, em desenvolvimento, um gene de interesse atua ou surge fenótipos miofibrilares. O fenótipo de desenvolvimento IFM de SmnE33, um alelo hipomórfico da proteína de ligação ao RNA Neurônio motor de sobrevivência (Smn)39 é apresentado como dados representativos que ilustram a ampla utilidade das dissecções de livro aberto e hemitórax.

As pequenas ribonucleoproteínas nucleares (snRNPs) que formam o spliceossomo, o complexo macromolecular que catalisa a reação de splicing para gerar mRNAs7, são montadas pelo complexo SMN. O complexo SMN, consistindo de neurônio motor de sobrevivência (Smn) e proteínas Gemin, é necessário para a viabilidade em todos os organismos56. Níveis reduzidos de SMN em humanos levam ao grave distúrbio neuromuscular hereditário Atrofia Motora Espinhal (AME)21. Drosophila tem sido usada como modelo para entender a etiologia da AME e a função celular do Smn, incluindo o desenvolvimento do alelo hipomórfico SmnE33. As moscas SmnE33 são viáveis e férteis, mas não podem voar ou pular39. Embora as moscas SmnE33 tenham defeitos de arborização do neurônio motor, elas também exibem estrutura IFM desorganizada e perda de expressão de Actin88F específica do músculo de voo39,57. O SMN é co-localizado com a alfa-actinina no disco Z em moscas e camundongos39, sugerindo que o Smn pode ter uma função específica do músculo.

Para obter uma melhor compreensão de quando a estrutura miofibrilar é perdida e a função Smn é necessária no desenvolvimento muscular, foi realizada uma análise do curso de tempo de desenvolvimento do fenótipo SmnE33 em IFMs em 26 h APF, 72 h APF e adulto de 1 a 5 dias. Enquanto o controle w1118 IFMs em APF de 72 h e em adultos tem forte sinal de F-actina corado com faloidina ( Figura 7E, E ', I, I ') e estrutura de sarcômero regular ( Figura 7 G, G ', K , K '), o sinal de faloidina é drasticamente reduzido ( Figura 7 F , F ', J , J ') e as estruturas do sarcômero estão ausentes ( Figura 7 H , H ', L , L ') em SmnE33 IFMs. Em vez disso, a F-actina é observada em estruturas semelhantes a redes ao redor dos núcleos ou em feixes irregulares ou estruturas de "explosão de estrelas" no citoplasma (Figura 7H, H ', L, L '), consistente com uma perda de expressão de Act88F18, 39 e uma incapacidade de montar filamentos finos. Dissecações abertas foram realizadas para examinar o fenótipo SmnE33 em 26 h APF e revelaram que o desenvolvimento inicial do IFM prossegue normalmente em SmnE33. Comparável aos IFMs de controle w1118 (Figura 7A, A ', C, C '), as moscas SmnE33 têm 6 fibras IFM longitudinais dorsais por hemitórax, formam cabos de F-actina organizados na periferia da miofibra antes da miofibrilogênese ( Figura 7B , B ') e exibem uma rede de F-actina em forma de malha em toda a miofibra ( Figura 7D , D '). Esses resultados indicam que os estágios iniciais da diferenciação do IFM ocorrem normalmente, enquanto o Smn é necessário nos estágios posteriores do desenvolvimento do IFM para sustentar a expressão do Act88F e construir sarcômeros. É importante ressaltar que esses resultados representativos ilustram o detalhe fenotípico e a resolução que podem ser alcançados por dissecções de livro aberto e hemitórax.

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Figura 1: Dissecção de hemissecção de IFMs adultos. (A) Posicione uma mosca adulta em 1x PBS em uma lâmina de microscópio. (B) Usando uma pinça (ciano, ponto) para estabilizar a mosca, remova a cabeça com uma tesoura (laranja). (CE) Remova as asas esquerda (C) e direita (D) e o abdômen (E). (F) Descarte a cabeça, o abdômen e as asas e transfira o tórax para o fixador. (G,H) Orientar um tórax fixo em uma lâmina em uma queda de 1x PBS-T com a parte posterior (P) e o escutelo apontando para cima (G), usando uma pinça para estabilizar a orientação (H). (I-K) Use uma lâmina de criostato para cortar o tórax ao meio (I-J), para gerar duas hemi-seções do tórax (K). (L) Diagrama de uma lâmina de criostato e um tórax, ilustrando a posição do corte sagital para produzir hemi-secções. A lâmina é deslizada para a direita para entalhar o escutelo do tórax e, em seguida, movida para baixo em um movimento suave (setas amarelas) para cortar o tórax (linha vermelha pontilhada). (M, N) Esquema de uma visão coronal (M) e transversal (N) do tórax, ilustrando a posição dos principais grupos musculares e a posição do corte (entre os triângulos amarelos). A orientação do tórax é indicada (L, esquerda; R, certo; V, ventral; D, dorsal; A, anterior; P, posterior). Barras de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Estadiamento da pupa e características do desenvolvimento da pupa. (A) As pupas masculinas e (B) femininas podem ser distinguidas como pré-pupas brancas em 0-2 h APF. As pupas masculinas têm estruturas emparelhadas, redondas e translúcidas (o testículo em desenvolvimento) em direção à parte posterior (setas). (C) Tabela de características que servem como marcas do desenvolvimento da pupa. As características incluem maturação da caixa de pupa, eversão da cabeça e descolamento da pupa da caixa de pupa, desenvolvimento da pigmentação dos olhos, pigmentação das cerdas, asas, pernas, epândrio e cutícula e visibilidade da mancha virgem (mecônio). A cor dos olhos e a pigmentação escurecem progressivamente. O tempo e os estágios de desenvolvimento da pupa rotulados no topo de cada coluna da tabela (pontos de tempo indicados em texto preto, estágio correspondente no desenvolvimento da pupa abaixo em texto azul) foram previamente definidos por Bainbridge e Bownes19,41. (D-E) Curso temporal do desenvolvimento da pupa em 0-2 h, 24 h, 48 h, 72 h e 96 h APF em uma pupa intacta com olhos vermelhos (D; Mef2-Gal4, fln-GFP) e em uma pupa com olhos laranja dissecados para fora da caixa de pupa (E; Fln-Gal4). Observe o escurecimento progressivo dos olhos e cerdas de 48 h a 96 h APF. (F) Exemplos de letalidade pupal em pontos de tempo iniciais, médios e tardios de desenvolvimento. As moscas letais faratos estão totalmente formadas, mas não conseguem se fechar completamente da caixa de pupa. Barras de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Dissecção de hemissecção de IFMs de pupa (>48 h APF). (A-H) Remoção de uma pupa da caixa de pupa. Afixe as pupas em uma tira de fita adesiva dupla (A,B). Abra a crista anterior (C) e remova o opérculo (D) usando um par de pinças Dumont # 5 (azul, a seta indica a direção do movimento, o ponto está estacionário). Use uma pinça para abrir (E) e descascar (F) a caixa de pupa em tiras (G). Tiras da caixa de pupa são aderidas à fita adesiva dupla. Depois de expor o abdômen, levante a pupa para fora da caixa (H). (I) Esquema ilustrando o processo de dissecar uma pupa da caixa da pupa. Os painéis de figuras correspondentes a cada etapa do esquema são rotulados (parte inferior). A linha pontilhada vermelha marca onde a pinça pode ser inserida sem danificar a pupa para abrir a caixa da pupa. (JL) Após retirar a pupa da caixa (J) e transferir para uma lâmina de microscópio em uma gota de 1x PBS (K), use uma tesoura para remover o abdômen (L). (M) Descarte o abdômen e transfira o tórax para o fixador. (N) Após a fixação, transfira o tórax pupal para uma lâmina em uma gota de 1x PBS-T. Oriente o lado dorsal da pupa para cima e estabilize com uma pinça. (OP) Use uma lâmina de criostato (O) para cortar uma hemisseção de pupa (P). A colocação do corte é a mesma da Figura 1 MN. Barras de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Dissecção em livro aberto de IFMs pupais (<48 h APF). (A) Depois de remover a pupa da caixa de pupa, conforme mostrado na Figura 3 A-I, transfira a pupa para 1x PBS em uma placa de dissecação de silicone preto. (BD) Empurre suavemente a pupa para baixo até a superfície da placa de silicone usando uma pinça (B) e prenda o lado ventral para cima usando dois pinos de insetos (C,D). (E) Abra a membrana basal (bm) e a cutícula da cabeça usando uma tesoura (laranja). (F, G) Corte ao longo do lado direito (F) e esquerdo (G). A posição do corte está diagramada em (Q). (H, I) Levante a seção ventral com uma pinça (H) e remova com uma tesoura (I). (J, K) Use uma pinça para remover o cérebro (J), a traqueia lateral do tronco e o intestino (K). (L-M) Use um jato suave de tampão de uma pipeta para remover corpos gordurosos e expor os IFMs. (N) Corte o tórax em dois folhetos. (O, P) Corte os folhetos e transfira-os para o fixador. (Q) Esquema resumindo as etapas em uma dissecação em livro aberto. Os painéis de figuras correspondentes a cada etapa são rotulados (parte inferior). As vistas superior e lateral são fornecidas para ilustrar a colocação dos cortes (linha vermelha pontilhada) no lado esquerdo e direito da pupa. As asas, pernas e tromba (marcadas) são usadas para distinguir os lados dorsal e ventral da pupa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Montagem de amostras em lâminas de microscópio. (A-D) Os espaçadores de lamínula são usados para montar amostras espessas de hemissecção do tórax. O glicerol (A) é usado para fixar espaçadores (lamínulas # 1) em uma lâmina rotulada (B) e as amostras são montadas em meio de montagem no espaço entre os espaçadores (C). Pupas tardias e tórax adultos requerem dois espaçadores de lamínula # 1 (D). Os pontos de tempo de pupa intermediária requerem um único espaçador de lamínula # 1, e as dissecções pupais iniciais podem ser montadas sem espaçador. (E-H) As amostras de hemitórax adulto são transferidas para o meio de montagem com uma pinça ou pincel (E). Os tórax são inicialmente orientados aleatoriamente (F) e podem precisar ser invertidos usando uma pinça (G) para que os IFMs sejam orientados para cima em direção à lamínula (H). (IL) Os folhetos das dissecações em livro aberto do início da pupa são transferidos para montagem usando uma pinça (I). Os folhetos são orientados aleatoriamente (J) e podem ser invertidos usando uma pinça (K) para que os IFMs fiquem voltados para cima em direção à lamínula (L). (M-P) Depois que as amostras estiverem devidamente orientadas, coloque uma lamínula sobre as amostras (M) e bata-a mesmo contra os espaçadores (N). Encha ao redor das amostras com meio de montagem (O), tomando cuidado para evitar a formação de bolhas. Vede todas as bordas abertas da lamínula e espaçadores com esmalte (P) para evitar a evaporação do meio de montagem. (Q-R) Imagens de amostras de tórax adulto montadas corretamente (Q, ampliação de 10x) orientadas com os IFMs voltados para cima em direção à lamínula (R, ampliação de 20x). (S) Um esquema do slide completo, com amostras orientadas IFM-up entre espaçadores e esmalte selando todas as bordas abertas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: As dissecções IFM são compatíveis com diferentes fixadores. (A-H) Projeção z confocal da estrutura da miofibra (A-D) ou imagens de plano único da miofibrila e da estrutura do sarcômero (E-H) do controle w1118 IFM adulto. A dissecção do hemitórax é compatível com vários métodos de fixação, incluindo paraformaldeído (PFA) a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (A,E) ou solução relaxante (RS) (B,F), metanol (C,G) ou solução de glioxal a 9% (D,H). DAPI (1:1000), azul; F-actina corada com faloidina (1:500), cinza. (I, J) Quantificação do comprimento (I) e largura (J) do sarcômero de E-H. O método de fixação e o tampão podem afetar significativamente a medição do comprimento e largura do sarcômero. Um comprimento de sarcômero de 3,040 ± 0,2935 μm com fixação de metanol foi significativamente menor do que os comprimentos medidos de 3,271 ± 0,2736 μm, 3,190 ± 0,2586 μm e 3,217 ± 0,2023 μm com fixação de PFA (PBS), PFA (RS) e 9% de glyoxal, respectivamente (p < 0,001). A largura do sarcômero foi significativamente diferente entre todos os métodos de fixação testados (PFA (PBS), 1,410 ± 0,1331 μm; PFA (RS), 1,284 ± 0,2514 μm; metanol, 1,280 ± 0,1538 μm; e fixação de glioxal a 9%, 1,137 ± 0,2032 μm). Boxplots são mostrados com bigodes de Tukey com pontos de dados discrepantes marcados como pontos pretos. A significância foi determinada por ANOVA com teste post hoc de Tukey (**, p < 0,01; ***, p < 0,001). (KM) Imagens confocais de plano único de um curso de tempo de fixação de adulto w1118 em 4% de PFA na fixação de RS, demonstrando que tempos de fixação de 15 (L) ou 30 (M) min, em comparação com 7 min (K), resultam em estrutura de sarcômero bem preservada e consistente. (N,O) Projeções Z-stack de IFMs Act88F-Gal4 adultos fixados em PFA a 4% demonstrando artefatos de dissecção em miofibras. Artefatos comuns incluem miofibras cortadas, desgastadas ou parciais de uma lâmina cega (N) ou um corte angular (O). (PR) Imagens confocais de plano único de amostras adultas w1118 fixadas em PFA a 4% em PBS demonstrando artefatos comuns de dissecção em sarcômeros e miofibrilas. Artefatos técnicos comuns incluem alongamento irregular de sarcômeros devido ao contato com fórceps durante a montagem (P), puxando discos Z para fora do registro esticando miofibras durante cortes longitudinais (Q) e miofibrilas desgastadas, desorganizadas ou onduladas devido à abrasão ou uma lâmina cega (R). DAPI (1:1000), azul; F-actina corada com faloidina (1:500), cinza. Barra de escala = 100 μm (A-D, N-O), 5 μm (E-H, K-M, P-R). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Aplicação de dissecações para investigar o fenótipo IFM de desenvolvimento de SmnE33. (A-D) Estrutura muscular em pupas precoces em 26 h APF. Imagem confocal de plano único da estrutura da miofibra (A, A', B, B') e estrutura da miofibrila e do sarcômero (C, C', D, D') no controle (A, A', C, C') e SmnE33(B, B', D, D'). Tanto o controle quanto o SmnE33 têm seis miofibras IFM por hemitórax e formam cabos de F-actina. (E-H) Estrutura muscular em pupas tardias em 72 h APF. Imagem de projeção Z da estrutura da miofibra no controle (E, E') e SmnE33 (F, F'). IFMs em SmnE33 estão presentes com base na coloração DAPI, mas não possuem um forte sinal de F-actina. Imagens confocais de plano único revelam que os IFMs de controle têm uma estrutura de sarcômero altamente organizada (G, G'). Por outro lado, os IFMs SmnE33 (H, H') têm estruturas anormais de F-actina semelhantes a estrelas (setas amarelas) e não possuem a estrutura de sarcômero organizada observada em IFMs de controle. (IL) Estrutura muscular adulta em controle (I, I', K, K') e SmnE33(J, J', L, L'). A projeção Z (I, J) e as imagens confocais de plano único (K, L) revelam conteúdo de actina F muito reduzido e estruturas anormais de actina (setas amarelas) em IFMs SmnE33. DAPI (1:1000), azul; F-actina corada com faloidina (1:500), magenta ou cinza. Barra de escala = 50 μm (A, B), 10 μm (C, D, G, H, K, L), 100 μm (E, F, I, J). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar 1: Uma descrição detalhada dos métodos de fixação e coloração usados no texto e, em particular, para gerar os dados mostrados na Figura 6 e na Figura 7. Estão incluídas informações adicionais sobre a determinação das diluições dos anticorpos primários. Uma lista de componentes de buffer e receitas usadas neste protocolo também é fornecida. Esses dados motivam o protocolo de dissecção e demonstram sua utilidade para microscopia confocal e análise de fenótipos de IFM de desenvolvimento. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 1: Fluxograma das etapas da dissecção do hemitórax de IFMs adultos. Resumo textual das etapas da Figura 1 para preparar cortes de IFM de hemitórax. Após a dissecção, fixação e bissecção do tórax, os cortes são corados para análise microscópica. Clique aqui para baixar esta figura.

Figura suplementar 2: Fluxograma das etapas na dissecção do hemitórax de IFMs pupais. Resumo textual das etapas da Figura 3 para preparar seções de hemitórax de IFMs pupais. Após a remoção da caixa de pupa, as pupas são fixadas, divididas e coradas para microscopia. Clique aqui para baixar esta figura.

Figura Suplementar 3: Fluxograma de etapas na dissecção em livro aberto de IFMs pupais iniciais. Resumo textual das etapas mostradas na Figura 4 para realizar a dissecção em livro aberto de IFMs pupais antes de 48 h APF. Após a dissecção e fixação, os folhetos epiteliais com IFMs anexados são corados para microscopia. Clique aqui para baixar esta figura.

Discussão

Este protocolo apresenta um procedimento para dissecção de hemitórax de IFMs de D. melanogaster adulto (Figura 1) e pupal tardia (48 h - 96 h APF) (Figura 3), bem como dissecção em livro aberto de IFMs em pontos de tempo iniciais de pupa (8 h - 48 h APF) (Figura 4). Este protocolo é ideal para aplicações de imuno-histoquímica e microscopia de fluorescência. O protocolo é ilustrado com diagramas esquemáticos e fotografias passo a passo do procedimento de dissecção. Os diagramas de visão geral tornam o protocolo acessível a cientistas novos no campo da Drosophila , bem como a pesquisadores de graduação e estagiários em estágio inicial. Exemplos representativos de artefatos de fixação e preparação de amostras deficientes são incluídos para permitir que os usuários do protocolo distingam artefatos de fenótipos de sarcômeros genuínos .

O passo mais difícil na dissecção do hemitórax IFM é a bissecção do tórax (Figura 1I, J, L e Figura 3O). Esta etapa requer tempo e prática para dominar. Para maior estabilidade durante o corte, tórax individuais podem ser colocados em fita adesiva dupla e cortados36, mas deve-se tomar cuidado para evitar a dessecação dos IFMs. Também é possível cortar do lado ventral do tórax, com o lado dorsal orientado para baixo, para que novos usuários possam testar qual abordagem é mais eficaz com sua configuração. Os cortes devem ser realizados com lâminas novas e afiadas para evitar danificar os IFMs, e uma lâmina deve ser substituída quando ficar cega. As lâminas de micrótomo (criostato) são usadas para cortar o tórax de forma limpa neste protocolo, em comparação com outros protocolos que empregam uma agulha, fórceps ou lâmina de bisturi24, 32, 36. As lâminas de barbear são outra alternativa para dividir o tórax de forma limpa. A fixação também é importante antes da bissecção, pois o tecido levemente fixado, embora preservado de forma estável, pode ser "mole" e mais difícil de cortar. Tempos de fixação de 30-60 min equilibram a disponibilidade de antígenos e a rigidez do tecido facilitando os cortes, e podem ser encurtados para 15 min com a experiência.

Uma limitação das preparações de hemitórax é a penetração de anticorpos. Os hemitórax são amostras espessas32, e as micrografias confocais de melhor qualidade são obtidas dos 10-20 μm superiores dos IFMs42, 58. Uma concentração de detergente muito baixa ou um tempo de permeabilização muito curto podem levar a manchas fracas e inconsistentes. A penetração de anticorpos também pode ser melhorada por uma incubação mais longa (2-3 d) no anticorpo primário. Um sistema de dois fótons ou uma objetiva com uma distância de trabalho maior também pode aumentar a profundidade da imagem59. Se o experimentador precisar obter imagens de todo o diâmetro da miofibra IFM, uma abordagem alternativa, como micrótomo24, 58 ou criossecção27 no plano sagital, deve ser considerada.

Um aspecto importante que não é abordado no protocolo principal é a análise dos dados de imagem. Para análise de miofibras IFM em imagens 10x ou 20x (Figura 6A-D, Figura 7A, B, E, F, I, J), a análise padrão inclui determinar se as miofibras estão ligadas e se a morfologia macroscópica da miofibra está intacta37, 38. Exemplos de parâmetros que podem ser quantificados, dependendo do experimento, incluem comprimento, largura, número, número anexado ou número de miofibras rasgadas37, 60. Uma grande vantagem deste protocolo é a compatibilidade com a microscopia de fluorescência e a capacidade de analisar a morfologia do sarcômero e da miofibrila em ampliações mais altas de 60x ou 100x (Figura 6E-H, Figura 7C, D, G, H, K, L). A morfologia do sarcômero deve ser analisada em amostras livres de artefatos técnicos (Figura 6K-P). Várias categorias de possíveis fenótipos de miofibrilas e sarcômeros foram previamente definidas60. Mais comumente, o comprimento e a largura do sarcômero são medidos desenhando e medindo uma linha de disco Z a disco Z em software de processamento de imagem ou, alternadamente, usando uma das várias ferramentas automatizadas disponíveis gratuitamente18, 45, 61. A avaliação da morfologia do sarcômero pode ser aprimorada com a inclusão de marcadores que rotulam o disco Z ou a linha M, ou os filamentos grossos ou finos30, 34,58. Esses dados podem ser usados para descrever quantitativamente os fenótipos de miofibras, miofibrilas e sarcômeros entre uma amostra de controle e teste preparada usando este protocolo de dissecção.

Os usuários do protocolo devem estar cientes de que, embora a fixação preserve a morfologia da miofibra e do sarcômero, o fixador, bem como os tampões e o meio de montagem podem causar encolhimento ou inchaço do tecido e podem influenciar a medição dos parâmetros morfológicos45. Sabe-se que a fixação e desidratação do glutaraldeído necessárias para a microscopia eletrônica diminuem o diâmetro do sarcômero43, enquanto a esfola e a gliceração das fibras aumentam o diâmetro do sarcômero 44,45. Esse fenômeno pode estar subjacente às diferenças nos parâmetros do sarcômero na literatura e enfatiza a importância da inclusão de amostras controle e teste em cada experimento. As IFMs de controle e teste devem ser processadas simultaneamente nos mesmos tampões para uma comparação precisa dos parâmetros quantitativos do sarcômero.

Este protocolo detalhado visa tornar a dissecção de IFM adulto e pupal para imuno-histoquímica e microscopia fluorescente mais acessível a drosófilos iniciantes e avançados. Este protocolo pode ser adaptado para uso com outros insetos, bem como para outras técnicas de imagem, como microscopia crioeletrônica (cryo-EM), hibridização in situ de fluorescência de molécula única (smFISH) ou transcriptômica espacial. A combinação de poderosas ferramentas genéticas de Drosophila com microscopia de fluorescência oferece oportunidades únicas para investigar princípios conservados de miogênese e função muscular. Como os IFMs também são passíveis de abordagens moleculares e bioquímicas26, 27, estudos futuros ligando fenótipos moleculares à morfologia, biologia celular e função muscular fornecerão uma compreensão mais profunda da miogênese e da etiologia dos distúrbios musculares.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Gregory Matera por fornecer o alelo SmnE33 e por discussões úteis sobre Smn. Os autores agradecem a Frank Schnorrer, Cornelia Schoenbauer, Manuela Weitkunat e Aynur Kaya-Copur pelas discussões e apoio úteis. Os autores reconhecem o centro de estoque de Bloomington por fornecer moscas. Este trabalho foi apoiado por financiamento inicial da Escola de Ciências e Engenharia da Universidade de Missouri Kansas City (UMKC), Divisão de Sistemas Biológicos e Biomédicos (MLS), do Programa de Financiamento para Excelência da UMKC (MLS) e do Escritório de Pesquisa de Graduação e Bolsa Criativa da UMKC (SF, MLS).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de cultura de tecidos de 60 mmFisher ScientificFB01292160 mm, poliestireno
Ácido Acético, Glacial (ACS Certificado)Fisher ScientificA38S-212
Adenosina Trifosfato (ATP)Millipore SigmaA1852
Papel alumínio, de alta resistênciaAmazon12 pol. x 1000 pés.
Recipientes de dissecação de silicone preto: pó de carvão ativadoMillipore SigmaC9157Também disponível na maioria das farmácias
Pratos de dissecação de silicone preto: Sylgard 184Millipore Sigma761036Para fazer pratos de dissecação de silício, combine os componentes do Sylgard em um saco ziploc e misture bem. Adicione o pó de carvão ativado (~200 mg) ao Sylgard (~50 g), misture bem, corte o canto do saco, encha panelas de cultura de 60 mm, remova as bolhas com a ponta de uma pipeta e cure durante a noite.
Bandeja de papelão para slides, Research Products International Corp.Fisher Scientific50-136-7558
Microscópio confocal, confocal invertida Nikon AXRNikonwww.microscope.healthcare.nikon.com/
Microscópio confocal, Zeiss LSM 780 confocal invertidoZeisswww.zeiss.com
Câmara de Criação de Insetos Darwin (Incubadora)Fisher Scientific/Câmaras de DarwinIN034Incubadora com controle de luz, temperatura e umidade
Prato de dissecação (vidro preto)Mikroskop Technik Diethelm398011Lymphbecken (tigelas de tingimento/tanques linfáticos), vidro preto, 4x4 cm, com cobertura de vidro transparente
Pinças Dumont #3Ferramentas Científicas Finas11231-30Pinça Dumoxel com ponta reta de 12 cm com ponta de 0,17 x 0,1 mm  
Pinça Dumont #5Ferramentas Científicas Finas11252-20Pinça de ponta reta Inox de 11 cm, grau de Biologia com ponta de 0,05 x 0,02 mm  
EGTA (Ácido Egtázico)Millipore Sigma324626
Etanol, Absoluto (200 Proof)Fisher ScientificBP28184Grau em Biologia Molecular
Vidro Fishing Premium Cover (18 x 18 mm), coberturasFisher Scientific12548AVidro, quadrado, espessura #1 (0,13 - 0,16 mm)
Vidro de cobertura premium Fisherbrand (22 x 22 mm), coberturasFisher Scientific12548BVidro, quadrado, espessura #1 (0,13 - 0,16 mm)
Placas de cultura celular de fundo plano (24 poços)Fisher Scientific7200740
câmera de microscópio fluorescente dissecante, câmera Infinity8Teledyne (Visual Dynamix)6 megapixels, baixa luz, monocromático
Voar: Smn[E33]Estoque de moscas; Presente de Gregório Matera
Voar: w[1118]Centro de Estoques de BloomingtonRRID:BDSC_3605Material de mosca
glicerolFisher ScientificBP229-1Grau em Biologia Molecular
Solução glioxal (40% em peso em H2O)Millipore Sigma128465  Essa é uma solução padrão de 40%
Software de processamento de imagem, Affinity Designer 2Afinidadehttps://affinity.serif.com/en-us/
Software de processamento de imagem, Image J (Fiji)ImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Pinos de insetosFerramentas Científicas Finas26002-10aço inoxidável, 0,1 mm de diâmetro (pinos minúcil)
Cloreto de Magnésio (MgCl2)Fisher ScientificAA12315A1
Metanol (HPLC)Fisher Chemical (Fisher Scientific)A452-4Relaxar em -20? Antes do uso
Lâminas de microscópio, foscasFisher Scientific12-550-400Área de escrita, sem carga, 75 mm x 25 mm x 1 mm
Lâminas de microscópio, vidro simplesFisher Scientific12-544-4Pré-limpo, 75 mm x 25 mm
Lâminas de microtomo MX35 Ultraepredia (Fisher Scientific)3053835Perfil baixo, 34 graus; ângulo de corte; Lâminas C35 feather 80mm funcionam bem
Esmalte de unhas, transparente (Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish)Amazon0,4 fl. oz.
Soro normal de cabraMillipore SigmaS26 LITROS
Nutator (Mini Nutating Rocker, Benchmark)Midwest ScientificH3D102024 rpm, fixo; 8 x 6 pol. plataforma com tapete com covinhas
Pincel (Rodada nº 0)AmazonPincel redondo nº 0 ou similar de qualquer material de arte
Paraformaldeído (PFA)Millipore Sigma158127-500G
Soro Tamponado com Fosfato (PBS): KClMillipore Sigma529552-250GMPrepare PBS de acordo com o Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Soro Tamponado de Fosfato (PBS): KH2PO4Millipore SigmaP0662-500GPrepare PBS de acordo com o Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Soro Tamponado de Fosfato (PBS): Na2HPO4Millipore SigmaS9763-500GPrepare PBS de acordo com o Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Soro Tamponado com Fosfato (PBS): NaClFisher Chemical (Fisher Scientific)S271-1Prepare PBS de acordo com o Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Pontas de pipeta PR1MA (10 & micro; L)Midwest ScientificPR10XLRK-NSUniversal 10 & micro; Pontas da pipeta em L
Pontas de pipeta PR1MA (1000 e micro; L)Midwest ScientificPR-1000RK-FLUniversal 1000 & micro; Pontas da pipeta em L
Pontas de pipeta PR1MA (200 & micro; L)Midwest ScientificPR-200RK-NSUniversal 200 & micro; Pontas da pipeta em L
Rodamina-FaloidinaInvitrogen, Sondas MolecularesR415
Fita dupla face escocêsScotch/3M (Staples)649280ambos os lados são revestidos com adesivo, 0,5" x 7 jardas, disponível na maioria dos manuseadores de materiais de escritório
Dihidrogénio fosfato de sódio diidratado (NaH2PO4)Fisher ScientificAAA1131636
Software: GraphPad PrismGraphPad Prismawww.graphpad.com
Software: Infinity Analyze 7Teledyne (Visual Dynamix)https://www.teledynevisionsolutions.com/products/infinity-analyze/
Software: Microscoft ExcelMicrosofthttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
Limpadores delicados de tarefas, 1 camada Kimtech Science KimwipesFisher Scientific06-666Lenços de papel padrão
Pipeta de transferênciaFisher Scientific13-711-9AMMDPipeta plástica
Trition X-100Millipore SigmaT9284-100ML
Tesoura mola VannasFerramentas Científicas Finas15000-00Aresta de corte de 3 mm, diâmetro da ponta 0,05 mm, comprimento 8 cm
Vectashield com DAPILaboratórios VectorH-2000
Vectashield sem DAPILaboratórios VectorH-1900
Papel WhatmanMillipore SigmaWHA1004070Círculos de papel de filtro, Grau 4, 70 mm
Microscópio estéreo fluorescente de dissecação Z10Visual Dynamix (Midwest Scientific)http://www.visualdynamix.net/
Microscópio estéreo estéreo ergonômico de dissecação Z850Visual Dynamix (Midwest Scientific)http://www.visualdynamix.net/

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