Integração da Terapia de Reposição Renal Contínua na Perfusão Ex Situ Normothermic Fígado

Resumo

Este protocolo descreve um método para integrar a terapia de reposição renal contínua (CRRT) na perfusão hepática normotérmica exsitu , conectando-a ao reservatório de perfusão. Essa configuração apoia a estabilidade hemodinâmica, ajuda a prevenir pressões intravasculares excessivas e pode reduzir o risco de edema tecidual, especialmente durante perfusão prolongada.

Resumo

A perfusão normotérmica ex situ (PNM) do fígado surgiu como uma estratégia dinâmica de preservação, permitindo a manutenção da atividade metabólica e a avaliação dos enxertos antes do transplante. Perfusões prolongadas, no entanto, são limitadas pelo acúmulo de resíduos metabólicos, desequilíbrios eletrolíticos e mediadores inflamatórios que podem comprometer a função do enxerto. Terapias de substituição renal contínua (CRRT), especialmente a hemodiafiltração venovenosa contínua (CVVHDF), oferecem um meio potencial para apoiar a depuração de solutos e a regulação homeostática durante períodos prolongados de perfusão.

Neste protocolo, descrevemos um método reprodutível e seguro para integrar o CVVHDF em um sistema ex situ de NMP hepático, conectando o circuito de filtração independentemente do circuito principal de perfusão do órgão. Essa configuração apoia a estabilidade hemodinâmica, ajuda a prevenir pressões intravasculares excessivas e pode reduzir o risco de edema tecidicular. A conexão física, o esforcemento e o monitoramento do circuito CRRT são explicados em detalhes, juntamente com instruções sobre como utilizar uma pinça Hoffman para simular a pressão venosa fisiológica. Quando comparado à integração direta em circuito em linha, resultados representativos sugerem que a abordagem fora do circuito está associada à redução do edema do enxerto, mantendo a pressão estável do circuito e a liberação dos solutos. Essa abordagem pode ser facilmente integrada a outros dispositivos de perfusão semelhantes para melhorar o manuseio dos solutos, mantendo a dinâmica estável da perfusão.

Introdução

A perfusão normotérmica ex situ (NMP) é uma estratégia dinâmica de preservação que visa manter a atividade metabólica do órgão, fornecendo oxigênio e substratos metabólicos em temperaturas^{fisiológicas 1,2,3}. Nessas condições, é possível avaliar a lesão e, em certa medida, a funcionalidade dos órgãos antes do transplante. Além disso, o NMP ex situ oferece uma plataforma potencial para o recondicionamento, tratamento e avaliação de órgãos, tanto para fins de transplante quanto não^{transplante 3,4}.

A duração da perfusão ex situ do órgão é condicionada por diferentes processos fisiopatológicos que surgem decorrentes da própria perfusão. A maioria das perfusões, tanto em estudos pré-clínicos quanto clínicos relatados até o momento, foi realizada por períodos relativamente limitados, geralmente de 6 a 24 horas nos protocolos padrão, com relatos selecionados se estendendo até ou excedendo dias a semanas sob condições^{experimentais} 5,6,7,8. Processos e eventos adversos que surgem durante a NMP ex situ incluem o acúmulo de resíduos metabólicos, alteração da composição do eletrólito perfuso, produção de intermediários e mediadores inflamatórios, como padrões moleculares associados a danos (DAMPs), e edema/ganho de peso relacionados a deslocamentos de fluidos, que podem alterar a viabilidade do^{enxerto 9}. Consequentemente, a incorporação de métodos de purificação extracorpórea do sangue (EBP) tem sido avaliada como um meio importante para regular e remover esses diferentes produtos^. De todas as disponíveis, as mais amplamente utilizadas são as terapias de reposição renal contínua (CRRT).

A CRRT compreende um conjunto de técnicas tipicamente usadas em pacientes com insuficiência renal para filtrar sangue e eliminar diferentes componentes, regulando assim a acidose e os desequilíbrios eletrolíticos e eliminando resíduos^11,12. Estes incluem hemodiálise (HD), hemofiltração (HF) e hemodiafiltração (HDF⁾¹³. A HD depende da difusão para remover pequenos solutos (<15 kDa), como ureia ou β2-microglobulina, e é eficaz na correção de desequilíbrios^{eletrolíticos} 14,15,16,17. No entanto, a EH apresenta limitações, como baixa eficácia na remoção de toxinas maiores ou ligadas a proteínas e indução da atividade imune devido ao contato com^membranas 17,18,19. A HF depende de mecanismos convectivos para remover moléculas maiores, incluindo citocinas pró e anti-inflamatórias, embora também possa remover componentes essenciais do plasma, como vitaminas, oligoelementos e micronutrientes 20,21,22,23. O HDF combina mecanismos de difusão e convecção para alcançar uma eliminação mais ampla de toxinas de tamanho médio e mediadores inflamatórios, permitindo assim uma modulação mais eficaz do meio^{inflamatório} 24,25,26,27,28.

A CRRT depende de gradientes cuidadosamente controlados para facilitar a troca de solutos e fluidos entre membranas. No caso da HD, a difusão é impulsionada por diferenças de concentração, enquanto HF e HDF requerem gradientes de pressão transmembrana para permitir o transporte^{convectivo 29}. Quando esses sistemas são integrados a circuitos de perfusão ex situ , o controle da dinâmica de pressão torna-se especialmente relevante. Os sistemas de perfusão de órgãos dependem de um equilíbrio preciso de pressões para manter fluxo adequado, oxigenação tecidual, integridade vascular e função metabólica^{dos órgãos 30}. A adição de um sistema CRRT introduz mudanças de pressão que podem alterar o delicado equilíbrio dentro do circuito de perfusão do órgão.

Aqui, descrevemos uma estratégia prática e reprodutível para conectar a CRRT durante a NMP hepática ex situ , independentemente do circuito principal de perfusão, conectando tanto as linhas de acesso quanto de retorno com o reservatório de perfusão, em vez do laço vascular. Comparada à integração direta "no circuito" (ou seja, conectando-se a um circuito de perfusão vascular), essa configuração fora do circuito desacopla hidraulicamente a CRRT da vasculatura do órgão, apoiando uma regulação mais estável da pressão e do fluxo e ajudando a mitigar a formação de edema induzida por pressão causada pela configuração em linha. Essa abordagem ajuda a preservar a estabilidade hemodinâmica e o manuseio de solutos durante perfusões prolongadas de órgãos. Além disso, a conexão baseada em reservatório facilita etapas operacionais, como o preparo e a troca de filtros, sem interromper o circuito principal NMP. Esse protocolo é facilmente adaptável a plataformas de perfusão que fornecem acesso a reservatórios, e seus princípios podem ser aplicados em modalidades CRRT com pequenos ajustes de configuração.

Protocolo

Os protocolos de cuidado animal e experimentais foram aprovados pelos comitês de ética institucionais e regionais (Divisão de Agricultura, Pecuária e Alimentação da Comunidade de Madri e o Organismo de Bem-Estar Animal [OEBA] da Universidade Autônoma de Madri). Todos os animais foram alojados e os procedimentos foram realizados no Serviço de Cirurgia Experimental do Hospital Universitario La Paz, de acordo com as regulamentações nacionais e europeias vigentes, credenciadas pela Organização Internacional de Normalização (ISO9001:2015) e autorizadas pela autoridade regional (ES280790001941). Dezessete fígados foram obtidos de doadores suínos saudáveis e submetidos a um modelo de lesão mínima.

1. Modelo de lesão mínima

1. Induza isquemia morna relativa in vivo (13 ± 5 min) para recuperar sangue doador para uso na máquina, seguida por isquemia fria (77 ± 16 min).
2. Para cada experimento, inicie a CRRT usando CVVHDF com os seguintes parâmetros operacionais: vazão sanguínea (BFR) 100 mL/min, vazão de diálisado (DFR) 250 mL/h e fluxo de fluido de reposição entregue após o filtro (PBP) 100 mL/h. Ajuste a ultrafiltração líquida (UF) para 20 mL/h para considerar as entradas de fluidos (por exemplo, heparina, nutrição parenteral, antibióticos) e as saídas (por exemplo, bile), buscando um equilíbrio líquido próximo ao neutro.
3. Certifique-se de que o hemofiltro utilize uma membrana de alto fluxo de poliétersulfona com área de superfície efetiva de aproximadamente 0,3^m² e corte de peso molecular de cerca de 40 kDa.
4. Anticoagular todo o circuito de perfusão ex situ , incluindo o sistema CRRT, com heparina não fracionada (UFH), administrado diretamente no reservatório de perfusão como um bolus inicial de 5.000 UI, seguido por infusão contínua a 1.500 UI/h diluída em soro fisiológico normal para prevenir a coagulação e garantir a permeabilidade do circuito.
5. Mantenha o circuito NMP em 37,0 ± 0,2 °C usando um trocador de calor integrado dentro do dispositivo de perfusão. Certifique-se de que a máquina CRRT utilize um aquecedor de fluido em linha para que o fluxo de retorno entre no reservatório a 37 °C, mitigando o resfriamento das soluções de substituição/diálise. Monitore a temperatura continuamente tanto no perfusado quanto pelos sensores internos do CRRT.

2. Conexão física e funcional do CRRT com o sistema de perfusão de máquinas ex situ

1. Identifique pontos de conexão.
   1. Identifique uma porta de saída apropriada no reservatório do sistema de perfusão para servir como ponto de acesso (puxão) para o circuito CRRT.
   2. Identifique uma porta de entrada apropriada no reservatório do sistema de perfusão para servir como ponto de retorno (reinfusão).
   3. Instale tubos estériles garantindo contato com o reservatório perfusado, caso ainda não esteja presente.
      NOTA: Tanto as portas de acesso quanto de retorno devem idealmente estar fora do circuito regulado por pressão do sistema de perfusão ex situ , para evitar perturbar a resistência vascular, prejudicar a estabilidade do fluxo e, por fim, danificar o enxerto. O reservatório sanguíneo é o local preferido para conexão.
2. Limpar e proteger as linhas de conexão.
   1. Conecte conectores Luer-lock machos estéreis tanto nas portas de acesso quanto de retorno do sistema de perfusão, caso já não estejam presentes.
   2. A ceba de saída do sistema de perfusão com a perfusão, usando uma seringa para eliminar o ar.
   3. Prenda a linha de saída para evitar o retorno até a conexão final.
3. Conecte o sistema CRRT ao sistema de perfusão.
   1. Conecte a linha de acesso à porta de saída purgada do sistema de perfusão usando o conector Luer-lock.
   2. Coloque uma pinça Hoffman ou equivalente na linha de retorno do CRRT próxima à sua conexão com o sistema de perfusão para simular a pressão venosa fisiológica (Figura 1).
      NOTA: A grampa Hoffman serve para fornecer resistência suficiente a jusante, prevenindo alarmes ou interrupções de contrapressão durante o CRRT. Certifique-se de que a gramposa não esteja totalmente fechada e que o retorno seja contínuo e visível após o início do tratamento.
   3. Conecte a linha de retorno à porta de entrada do sistema de perfusão usando o conector Luer-lock.
4. Inicie o tratamento de purificação por perfusão.
   1. Desclampe tanto a linha de acesso quanto a saída do sistema de perfusão antes de iniciar o tratamento com CRRT.
   2. Confirme que o sistema inicia o tratamento e que o fluxo sanguíneo é visível por ambas as linhas.
   3. AVISO: Todos os componentes do sistema, incluindo o perfusado e o órgão, devem ser tratados como material biológico potencialmente infeccioso. Sempre use equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, incluindo luvas, viseiras e jalecos, durante a instalação, operação e descarte de resíduos.
5. Monitore a funcionalidade do circuito CRRT.
   1. Registre os valores de temperatura e pressão do sistema a cada hora, incluindo pressão de acesso, pressão de retorno, pressão de pré-filtro, pressão transmembrana (TMP) e pressão do efluente.
   2. Observe o fluxo sanguíneo pelo tubo e certifique-se de que não haja bolhas de ar.
   3. Confirme que o diálisado e os fluxos de fluido de substituição estão ocorrendo conforme programado.
      ATENÇÃO: Desvios súbitos dos valores normais podem indicar coagulação, obstrução do filtro, dobramento das linhas ou resistência venosa inadequada no local de retorno. Valores de referência típicos e suas variações e justificativas durante a CRRT podem ser encontrados na Tabela 1 e na Tabela 2, respectivamente.

Figura 1: Grampo Hoffman posicionado na tubulação para regular a pressão de retorno venosa. A gramposa é instalada na linha de retorno antes da conexão ao reservatório do sistema de perfusão normotérmica. Essa configuração permite uma regulação precisa da resistência do fluxo e simula a pressão venosa fisiológica, o que é crucial para evitar pressões negativas de retorno e falsos alarmes na máquina CRRT. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Parâmetro	Alcance Esperado (mmHg)	Interpretação
Pressão de acesso	–50 a –200	Pressão negativa devido à coleta de sangue do reservatório.
Pressão de retorno	< 200	Reflete uma resistência leve na linha de retorno.
Pressão pré-filtro	100–300	Indica a entrada de sangue para filtrar sob fluxo padrão.
Pressão transmembrana (TMP)	< 300	Marcador de desempenho do filtro e risco de coágulo.
Pressão do efluente	< 300	Varia dependendo do enchimento do saco, com resistência e resistência.

Tabela 1: Referências das faixas de pressão para terapia de reposição renal contínua durante a perfusão ex situ . Esta tabela resume as faixas esperadas de pressão (em mmHg) para pontos-chave de monitoramento no circuito extracorpóreo, incluindo pressão de acesso, pressão de retorno, pressão pré-filtro, pressão transmembrana e pressão do efluente. Esses valores de referência servem como indicadores de referência de estabilidade do circuito, eficiência hidráulica e desempenho do filtro quando a CRRT é integrada a um sistema de perfusão ex situ . O desvio para essas faixas pode sugerir fluxo, resistência, oclusão ou coagulação do filtro que requer avaliação do circuito. Abreviações: CRRT = terapia de reposição renal contínua; TMP = pressão transmembrana.

Parâmetro	Achados Anormais (mmHg)	Causa Possível	Ação Recomendada
Pressão de acesso	> –50	Contato ruim do reservatório, oclusão da linha, linha dobrada ou clampada, ar na linha ou baixo fluxo sanguíneo	Verifique o nível e a posição do fluido do reservatório, remova dobras, certifique-se de que a linha esteja totalmente submersa e sem pinça, aumente o fluxo sanguíneo
Pressão de retorno	> 200	Linha de retorno submersa muito fundo, oclusão da linha, clampagem muito apertada, dobramento ou coagulação	Ajuste a profundidade da linha de retorno, afrouxe a pinça, reposicione a linha ou verifique se há dobras ou coágulos, considere trocar o filtro
Pressão pré-filtro	> 300	Obstrução do fluxo, viscosidade excessiva, coagulação do filtro ou grampos deixados	Verifique a permeabilidade do circuito, reduza o fluxo, verifique coágulos, remova as grampos.
Pressão transmembrana (TMP)	> 300	Coágulos do filtro, alta resistência, linha ou saco, filtro de ar dentro do filtro	Troque o filtro, verifique se tem coágulos ou dobras, desaperte as linhas, remova o ar, refaça a primeira se necessário.
	< -30	Fluxo sanguíneo baixo do reservatório, ou filtrado bombeando mais devagar que a bomba de tratamento.	Verifique o nível do reservatório ou aumente o fluxo
Pressão do efluente	> 300	Bolsa de efluente cheia, oclusão da linha ou bolsa não pendurada livremente	Troque o saco de efluente, verifique se tem dobraduras, certifique-se de que o saco está pendurado livremente
Queda súbita de qualquer pressão		Vazamento ou desconexão	Inspecione todo o circuito imediatamente.

Tabela 2: Guia de solução de problemas para terapia de reposição renal contínua durante a perfusão ex situ . Esta tabela fornece um guia sistemático para identificar e resolver leituras anormais de pressão ou desvios de desempenho no circuito CRRT. Para cada parâmetro de pressão, os achados anormais comuns são listados com suas possíveis causas e ações corretivas recomendadas. Esta referência de solução de problemas apoia a rápida detecção de falhas no circuito, manutenção de desempenho adequado de filtragem e prevenção de complicações relacionadas à pressão durante a perfusão ex situ de órgãos.

3. Descarte de resíduos

1. Colete o efluente gerado pelo circuito CRRT em sacos de coleta de resíduos selados conectados diretamente às linhas de efluente da máquina. Uma vez cheios, sigile e descarte firmemente esses sacos como resíduos biológicos líquidos, de acordo com as regulamentações institucionais e locais de biossegurança.
2. Descarte o perfusado utilizado, junto com quaisquer agentes farmacológicos ou aditivos residuais, em recipientes de resíduos clínicos designados, destinados a materiais líquidos e cortantes de risco biológico.
3. Após a conclusão da perfusão, drene os filtros e tubos em sacos de resíduos líquidos para remover qualquer perfuso residual antes do descarte. Coloque todos os componentes que tenham estado em contato com material biológico em recipientes de resíduos clínicos aprovados para resíduos médicos regulados e processe-os de acordo com os procedimentos institucionais.
4. Coloque o órgão perfundido em sacos de resíduos biológicos selados e descarte por canais certificados de descarte de resíduos biohazardos, seguindo os protocolos institucionais e regionais de biossegurança aplicáveis.
   AVISO: Todos os componentes do sistema, incluindo o perfusado e o órgão, devem ser tratados como material biológico potencialmente infeccioso. Sempre use equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, incluindo luvas, viseiras e jalecos, durante a instalação, operação e descarte de resíduos.

Resultados

O objetivo deste protocolo é permitir a integração da CRRT durante a NMP hepática ex situ de maneira que preserve a estabilidade da perfusão. A CRRT opera sob condições negativas de pressão e fluxo que, quando conectadas diretamente a um circuito de perfusão dentro do sistema, podem perturbar a hemodinâmica do circuito (Figura 2A). Para superar isso, o protocolo introduz uma configuração em que o circuito CRRT interage com o reservatório de enxerto/...

Discussão

Este protocolo apresenta um método detalhado e reproduzível para integrar um dispositivo CRRT durante a NMP ex situ do fígado, conectando o circuito de filtragem ao reservatório de perfusão. A principal vantagem dessa abordagem é a preservação da hemodinâmica dos circuitos de perfusão e a prevenção das alterações prejudiciais de pressão tipicamente observadas com a integração direta de CRRT no circuito. Passos críticos incluem a colocação correta das linhas de CRRT dentro do res...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa Luer de 20 mL	Nipro Medical Espanha SL	SY3-10ESC-GEC
Accusol 35 K+ 2 (Potássio 2 mmol/L)	NIKKISO Europe GmbH	PPE02	Fluido de reposição para CRRT
Linhagem AqualineS	NIKKISO Europe GmbH	AQUASET03LV	Conjunto de linhagem pediátrica para CRRT
Filtro Aquamax HF03	NIKKISO Europe GmbH	AQUASET03LV	Hemofiltro pediátrico (até 30 kg doadores)
Sistema AquariusTM	NIKKISO Europe GmbH		Máquina de terapia de reposição renal contínua
Sistema de perfusão hepática ex situ	Guangdong Devocean Medical Instrument Co., Ltd.	Devocean-Liver& Kidney 3000	Plataforma principal de perfusão do órgão composta por duas bombas centrífugas com perfusão pulsátil/pressão contínua, painel de controle (sensores para pressão, fluxo e temperatura) e unidade de aquecedor
Solução salina isotônica Fresenius 500 mL	Fresenius Kabi	138900
Grampo Hoffman	Guangdong Devocean Medical Instrument Co., Ltd.	Feito sob medida	Regulação da pressão na linha de retorno
Conectores Luer-lock macho	Fornecida pelo Hospital	N/A	Para a conexão entre o tubo do sistema de perfusão e a linhagem da máquina CRRT
Heparina de Sódio 25.000 UI	Laboratórios Farmacé Uticos Rovi S.A	641639.6
Conjunto de tubos estéreis	Guangdong Devocean Medical Instrument Co., Ltd.	Feito sob medida	Para acesso e retorno de reservatórios
Braçadeira universal para mangueira	Achim SchuLz-Lauterbach Vertrieb medizinischer Producte GmbH	KL 20