Research Article

Detecção Automatizada de Espaço Articular Melhora a Precisão da Segmentação Óssea

DOI:

10.3791/69252

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November 28th, 2025

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1Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center, 2Department of Pathology & Laboratory Medicine, University of Rochester Medical Center, 3Department of Medicine, University of Rochester Medical Center, 4Thermo Fisher Scientific, 5Arthritis and Tissue Degeneration Program, Department of Research, Hospital for Special Surgery, 6Department of Urology, University of Rochester Medical Center, 7Department of Biomedical Engineering, University of Rochester Medical Center, 8Department of Orthopaedics, University of Rochester Medical Center, 9Department of Obstetrics and Gynecology, University of Rochester Medical Center, 10Department of Neuroscience, University of Rochester Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O desenvolvimento de um fluxo automatizado de detecção de espaço articular permitiu segmentação de alto rendimento de ossos distintos da pata traseira murina com >98% de precisão em animais selvagens. A aplicação flexível nas patas dianteiras e patas com artrite inflamatória-erosiva foi alcançada, mas com desempenho obsoleto que justifica otimização adicional em estudos futuros usando dados públicos.

Abstract

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A descrição quantitativa de estruturas anatômicas complexas continua desafiadora devido à expertise necessária para segmentação manual, trabalho de trabalho e variabilidade entre observadores. Para superar isso, a detecção automatizada de marcos específicos pode ser realizada por técnicas de análise digital de imagens, incluindo modelos de aprendizado profundo (DL). Para isso, realizamos uma análise automatizada supervisionada de conjuntos de dados de microtomografia computacional (micro-CT) das patas traseiras e dianteiras murinas. Avançando além dos algoritmos de bacia hidrográfica semi-automatizados (SA) baseados em marcadores publicados anteriormente, adicionamos aprimoramento estrutural, votação tensorial e dilatação de saída para identificar espaços articulares. A segmentação foi aprimorada utilizando um modelo de predição de espaço articulado DL (arquitetura 3D U-Net, espinha dorsal ResNet-18) usando rótulos de backpaw wild-type (WT) como base de verdade. A previsão foi estendida para as patas traseiras e dianteiras de camundongos WT e fator de necrose tumoral transgênico (TNF-Tg) com artrite inflamatória-erosiva de ambos os sexos ao longo da idade. A precisão da segmentação melhorou drasticamente usando a metodologia DL. A precisão diminuiu com o aumento da gravidade da doença e da idade em camundongos TNF-Tg. Testes subsequentes nas patas dianteiras também mostraram redução progressiva da precisão com o aumento da gravidade da artrite. No geral, esse modelo automatizado supervisionado supera abordagens recentes de SA em articulações saudáveis para aprimorar a investigação da anatomia óssea complexa. Embora a aplicação flexível a conjuntos de dados novos e modificados por doenças demonstre desempenho obsoleto, a utilização pode, ainda assim, catalisar o desenvolvimento de modelos de segmentação específicos para estruturas.

Introduction

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A análise de imagem de alta qualidade não apenas aprimora os esforços de pesquisa, mas também tem o potencial de ajudar radiologistas clínicos na busca para detectar e quantificar mudanças patológicas, uma tarefa fundamental para o cuidado ao paciente. A análise de imagem é uma sequência detalhada de procedimentos, incluindo extração de características, tradução de uma imagem genérica em rótulos significativos e derivação de métricasquantitativas 1. Grande parte desse processo é impulsionada por conhecimento prévio, como estruturas de limiar baseadas em densidade ou cor, e depois a aplicação de algoritmos de processamento de imagem a jusante (ou seja, dilatação, erosão, suavização, separação) para alcançar a segmentação desejada. Uma vez otimizadas, as imagens segmentadas podem fornecer entradas para aprendizado de máquinasupervisionado 2, incluindo aprendizado profundo (DL) que codifica e decodifica características complexas usando redes neurais,2,3 resultando em maior precisão e produtividade na segmentação de imagens.

De fato, a implementação de várias redes neurais convolucionais 3D (CNNs) proporcionou avanços críticos em algoritmos automatizados de segmentação óssea para análise de imagens esqueléticas, onde alguns modelos superam a segmentaçãohumana 4. Embora as CNNs de segmentação 3D funcionem por meio de arquiteturas distintas (ou seja, AlexNet, ResNet, UNet), suas saídas são fundamentalmente as mesmas, uma máscara de imagem que indica volume positivo ósseo a partir do fundo. Esses modelos de aprendizado profundo na análise de imagens musculoesqueléticas têm sido rapidamente desenvolvidos, e o campo rapidamente evoluiu de resolver problemas simples de detecção de fraturas2D 5 para problemas complexos de múltiplasarticulações 6 , com a capacidade de lidar com ruído artifactual ou características anômalas em conjuntos de dados. Por exemplo, Woo et al notaram que anomalias estruturais (ou seja, lesões de medula óssea, cistos ósseos) na ressonância magnética estavam degradando suas previsões de segmentação para a cartilagem articular nas articulações do joelho. Assim, eles desenvolveram um modelo de segmentação consciente de anomalias para identificar primeiro estruturas anômalas não relacionadas, o que melhorou dramaticamente a segmentação do osso eda cartilagem 7. He et al treinaram 14 modelos separados, cada um com um ROI de articulações manuais-chave, para estimar a idade esquelética e então integraram seus resultados para melhorar as previsões a partir dos raios-x da mão, em vez de usar toda a estruturada mão 8. Da mesma forma, incluir contexto nos modelos, como características de segmentação regional e relações anatômicas globais, tem demonstrado melhorar as previsões. O uso de CNNs multi-regionais para fornecer contexto sobre as características esperadas de segmentação também melhora a avaliação da maturidade esquelética em raios-X manuais ao restringir o problema de classificação a locais anatomicamenteapropriados 9. Avanços adicionais incluem SVTNet com segmentação óssea baseada em CNN, seguido por processamento adicional por modelos de transformadores de visão para capturar informações globais sobre a relação espacial entre regiões segmentadas de interesse, estimando resultados quantitativos como a idadeóssea de 10 anos.

Como demonstrado nessas abordagens de segmentação, a imagem de pesquisa em artrite foca na articulação das superfícies entre dois ou mais ossos, onde métodos para separação óssea são críticos para a avaliação bem-sucedida de processos patológicos diferenciais em articulações complexas. Avanços nos algoritmos de processamento de imagem demonstraram utilidade notável para aumentar o débito analítico de ossos do carpo ou tarso próximos11,12. No entanto, a adoção limitada devido a imprecisões que exigem intervenção do usuário e dificuldades na tradução para estruturas distintas destaca a necessidade de implementar fluxos de trabalho otimizados. Esses processos em múltiplas etapas podem se beneficiar enormemente de ferramentas discretas para aprimoramento de imagem (por exemplo, detecção de bordasósseas 13). Além das operações estritamente morfológicas, outros estudos implementaram técnicas baseadas em registro aproveitando a confiabilidade e consistência típicas na anatomia para identificaçãode estruturas 14,15,16,17. A alternativa de entradas manuais para gerar rótulos de verdade é cara e tediosa, mas pode ser igualmente bem-sucedida, onde a utilização pode ser essencial em ossos complicados e entrelaçados com limites menos discretos (por exemplo,crânio 18). De forma semelhante, abordagens alternativas de imagem com variabilidade multicolor/matiz mesmo dentro de uma estrutura discreta, como a ressonância magnética (MRI 19,20,21) ou histologia de tecidos 22, também apresentam complexidade que pode se beneficiar da segmentação manual inicial para guiar processos automatizados. Juntos, esses métodos podem oferecer benefícios adicionais ao impulsionar ainda mais automação, onde os resultados servem como conjuntos de dados de treinamento para implementar abordagens de DL. Os benefícios da automação de segmentação são numerosos, mas especialmente esses métodos permitem métricas quantitativas detalhadas e espacialmente relevantes, incluindo mudanças regionais/específicas de volume erosivo 23,24,25,26, bem como a identificação de áreas com alta suscetibilidade a danos 27.

Aqui, baseamos nos métodos semi-automatizados (SA) de segmentação murinebackpaw 12 estabelecidos, com melhorias nos algoritmos de processamento de imagem em combinação com segmentações groundtruthbone 28 para treinar modelos DL para detecção de espaço articular. Essa estratégia analítica inovadora demonstrou uma precisão significativamente melhorada na segmentação óssea individual das patas traseiras, o que reduziu os esforços manuais para correções de erros desegmentação 12 e acelerar o processamento das métricas quantitativas posteriores. Também demonstramos o potencial para implementação desses avanços técnicos em estruturas novas, incluindo as patas dianteiras e traseiras com artrite erosiva severa. Como a segmentação manual é demorada e exige altos níveis de expertise7, estratégias semelhantes para utilizar sequencialmente segmentação semi-automatizada e automatizada para produzir filtros de entrada aprimorados podem reduzir a barreira para o desenvolvimento de CNNs de alta qualidade para aplicações específicas. Os métodos associados desenvolvidos no software Amira (Arquivo Suplementar 1) e os conjuntos de dados relevantes são fornecidos publicamente para apoiar a adoção e colaboração em futuros esforçosde pesquisa 28,29.

Protocol

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Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os protocolos da IACUC aprovados pelo Comitê Universitário de Recursos Animais do Centro Médico da Universidade de Rochester.

Modelos animais
Os camundongos eram alojados em um vivário credenciado pela AAALAC. Um total de 19 camundongos foi utilizado nos experimentos descritos, incluindo 4 machos do tipo selvagem (WT), 4 fêmeas WT, 4 machos transgênicos TNF (TNF-Tg) e 7 fêmeas TNF-Tg, com avaliações mensais longitudinais. Camundongos TNF-Tg (linha 3647, C57BL/6 fundogenético 30) foram inicialmente obtidos do Dr. George Kollias com manutenção contínua na Universidade de Rochester. Os camundongos TNF-Tg foram cruzados como heterozigotos, com camundongos WT servindo como controles irmãos de ninhada. A genotipagem do transgene TNF foi realizada usando as seguintes sequências de primer: TNF-Tg Forward: 5-TAC-CCC-CTC-CTT-CAG-ACA-CC-3; TNF-Tg Reverso: 5-GCC-CTT-CAT-AAT-ATC-CCC-CA-3.

Camundongos TNF-Tg desenvolvem artrite inflamatória-erosiva crônica, progressiva eespontânea 31, com início mais rápido de manifestações articulares e extraarticulares em camundongos, levando à mortalidade precoce aproximadamente entre 5 e 6 mesese 32 anos. Assim, camundongos adicionais foram alocados à coorte feminina TNF-Tg. Indicado em descrições anteriores desta coortedo estudo: 23, n=2 mulheres TNF-Tg morreram antes da conclusão do estudo, n=1 antes dos 4 meses e n=1 antes dos 5 meses. Como os camundongos TNF-Tg apresentam progressão assimétrica bem estabelecida da doença nas patastraseiras 33,34, membros individuais foram considerados a unidade de medida (2 patas dianteiras e 2 patas traseiras por animal).

Coleção de imagens Micro-CT
Conjuntos de dados de Micro-CT foram coletados conforme descritoanteriormente 12,23. Brevemente, os camundongos foram colocados em um tubo acrílico plástico e transparente Derlin com anestesia isoflurana de 1%-3% para imagem com micro-CT usando os seguintes parâmetros: 55 kV, 145 μA, tempo de integração de 300 ms, 2048 x 2048 pixels, 1000 projeções acima de 180°, resolução de vóxels isotrópicos de 17,5 μm. Para segurança no uso de isoflurano, foi utilizado o equipamento de proteção individual adequado (luvas de nitrila, jaleco ou jaleco, óculos de segurança), e o vaporizador de isoflurano era mantido dentro de uma exaustão usando um filtro de carvão para capturar resíduos gasosos com tubos bem vedados para garantir continuidade no sistema de entrega. O isoflurano vaporizado foi utilizado para indução anestesica em uma câmara selada, depois a anestesia foi mantida por fluxo contínuo de isoflurano em um cone nariz murinho na máquina micro-CT. Tanto as patas traseiras quanto as dianteiras foram coladas para estabilização durante as sessões de imagem. Cada conjunto de dados foi coletado em aproximadamente 30-45 minutos (60-90 minutos no total) com dados da pata traseira e da pata dianteira derivados dos mesmos animais e pontos de tempo. Os camundongos foram avaliados em intervalos mensais, começando aos 2 meses de idade até os 5 meses (fêmeas, TNF-Tg com mortalidadeprecoce 32) ou 8 meses (machos). Partes dos dados do Hindpaw utilizados neste estudo já foram publicadas anteriormente (WT:12,35; WT e TNF-Tg:23) e estão disponíveispublicamente 28. Os dados da pata dianteira foram disponibilizados publicamente para os fins desteestudo 29.

Algoritmo de segmentação conjunta do espaço com facilitação de aprendizado profundo
Um algoritmo de processamento de imagem SA de alto rendimento para segmentar os ossos individuais da pata traseira complexa em camundongos (30-31 ossos) foi desenvolvidoanteriormente 12, fornecendo uma estrutura para investigar biomarcadores individuais da progressão da artrite inflamatória-erosiva usando o softwareAmira 23. Esse método de segmentação de SA de base utilizou um algoritmo de baciahidrográfica baseado em marcadores 36 para separação nas fronteiras ósseas. O algoritmo de bacia hidrográfica baseado em marcadores separa diferentes objetos em uma imagem tratando os valores dos pixels como topografia local baseada em marcadores definidos pelo usuário. Esses marcadores específicos do osso foram gerados de forma SA por meio de várias etapas de processamento de imagem, incluindo black top-hat (BTH), na tentativa de destacar regiões locais de grandes mudanças de densidade, como bordas e articulações ósseas. Juntos, essa abordagem criou uma versão erodida de cada osso individual, que foi então expandida para as bordas ósseas por meio da aplicação de uma máscara binária de fronteira. Embora o método da bacia hidrográfica tenha melhorado em relação ao uso anterior do contorno manual, a precisão (ossos segmentados corretamente / ossos totais) foi de aproximadamente 80% por conjunto de dados devido ao ruído de baixo contraste, levando a regiões articulares de ponte (ossos sobreconectados; 2+ ossos como um único material) ou identificação equivocada de bordas (excesso de divisão; 1 osso como 2+ materiais). Assim, a geração de marcadores SA para a abordagem da bacia hidrográfica exigiu procedimentos manuais consistentes e frequentesde correção 12 para desenvolver um recurso de rótulos padrãoouro 23,28.

O desenvolvimento do modelo DL para a previsão de articulações ósseas baseou-se na arquitetura de uma U-Net 3D com uma espinha dorsal ResNet-18. A função de perda de treinamento era Dice, a métrica de validação era interseção sobre união (IoU), a descida gradiente usava otimização Adam com taxa inicial de aprendizado de 0,0001, e os pesos eram inicializados aleatoriamente. O modelo foi treinado usando 20 conjuntos de dados WT (40 hindpaws) com distribuição igual por sexo e idade (de 2 a 6 meses), cada um dividido em 6 subvolumes (3 por poppaw) de 200 x 200 x 200 voxels com um conjunto de validação aleatória de 25% de subvolumes (30 validação, 120 no total) para evitar superajuste. Essas peças 3D foram posicionadas uniformemente nos tarsos, falanges distais e regiões de fundo. O tamanho do patch de treinamento foi definido em 96 x 96 x 96 voxels (Figura Suplementar 1). O modelo foi treinado ao longo de 500 épocas, levando aproximadamente 6 horas. As regiões conjuntas de verdade de base foram obtidas por uma receita automática de rótulos de verdade de solo, que expandiam as interfaces de etiquetas com um tamanho de dilatação 3D de 5 tanto para espessura quanto para extensão.

Em conjunto com a previsão do espaço articular DL, várias etapas de processamento de imagem foram implementadas para aumentar a identificação do espaço articular e a segmentação óssea. Essas estratégias incluíram a utilização do método BTH combinado com o aprimoramentoestrutural 37, o aumento de membranas e o vototensorial 38 para reforçar a continuidade do espaço articular limitando as lacunas de membrana. Juntas, essas abordagens fortalecem os espaços articulares para a separação óssea, limitando o vazamento de segmentação entre ossos adjacentes, que gera erros de superconexão à medida que o algoritmo da bacia hidrográfica se propaga por múltiplos ossos. O resultado final separa e segmenta conjuntos de dados micro-CT originais em rótulos específicos para ossos.

Um protocolo detalhado passo a passo do método de segmentação facilitada por DL é fornecido abaixo.

Passo 1: Abra o software Amira (requer licença pessoal ou institucional). Passo 2: Abra a aba de Python, selecione Criar um novo ambiente Python com nome do ambiente: deep-learning-environment-2022_2. Verificar Instale Pacotes de Aprendizado Profundo. Passo 3: Reiniciar o software, abrir a aba Python, selecionar ambiente do usuário ambiente-aprendizado profundo-2022_2. Passo 4: Dados abertos - Pilhas DICOM podem ser carregadas selecionando todos os arquivos DICOM individuais ou abrindo arquivos .am que contenham pilhas DICOM embarcadas, se disponíveis. Passo 5: Aplique o módulo de Previsão de Deep Learning ao objeto de dados importado com os seguintes detalhes:
Data: Objeto de dados importado
Arquitetura: arquivo .json (Arquivo Suplementar 2)
Pesos: arquivo .hdf5 (Arquivo Suplementar 3)
Tiling: manual - otimização possível reduzindo o tamanho dos pixels do tiling e aumentando a sobreposição do tiling conforme possível, dependendo do hardware computacional. O módulo falhará se os requisitos de processamento forem insuficientes. Garanta que em Editar, Preferências, Grandes dados, a alocação de memória para o software seja maximizada ao máximo.
Largura, altura, profundidade do mosaico: 352 pixels
Sobreposição de tiling: 0 pixels
Passo 6: Aplicar o Image Recipe Player, clique com o botão direito em a Área do Projeto sem direcionar um objeto de dados específico. Contribua/avalie o seguinte:
Receita aberta: arquivo .hxisp (Arquivo Suplementar 4)
Data: Objeto de dados importado
Articulações de entrada: Resultado do Passo 5 (Previsão de Aprendizado Profundo)
Faixa de intensidade do passo 3: 2500 - 20000
Passo 7: Avalie o objeto de dados processado resultante que contém a segmentação final – certifique-se de ajustar o Colormap para Labels256 para apreciar o total de segmentações individuais resultantes (o padrão é apenas 8 cores). Para 2D: Aplicar Ortho Slice e para 3D: Aplicar Volume Rendering. Detalhes sobre receita incorporada (BTH+DL+SEF+MEF_D2.hxisp) aplicados na etapa do Image Recipe Player fornecidos abaixo (Arquivo Suplementar 5). Note que, no Designer de Receitas de Imagens, etapas individuais podem ser visualizadas e exportadas conforme necessário para avaliar etapas de otimização em conjuntos de dados específicos. No protocolo, etapas específicas são destacadas que precisarão de ajuste para qualquer aplicação única, pois dependem das saídas de imagem (ou seja, densidade) e/ou tamanho dos objetos (ou seja, ossos):
Passo 1: Aplicar filtro mediano com dados: Objeto de dados importado; Interpretação: 3D; Bairro: 26; Iterações: 3; Tipo: Iterativo.
Passo 2: Aplicar Limiar - essa etapa exigirá otimização dependendo dos conjuntos de dados e do limiar específico que mira o objeto de interesse, neste caso, o osso com Dados: Resultado do Passo 1 (Filtro Mediano); Faixa de intensidade: 2500 - 20000.
Passo 3: Aplicar Fechamento - essa etapa exigirá otimização dependendo do tamanho dos espaços articulares entre ossos com Dados: Resultado da Etapa 1 (Filtro Mediano); Tipo: Cubo; Interpretação: 3D; Bairro: 26; Tamanho do pixel: 3.
Passo 4: Aplicar Aritmética de Imagem com Entrada A: Resultado do Passo 3 (Fechar); Entrada B: resultado do Passo 1 (filtro mediano); Canais de resultado: como entrada A; Expressão: A-B.
Passo 5: Aplicar Limiar com Dados: Resultado do Passo 4 (Aritmética de Imagem); Faixa de intensidade: 750 - 20000.
Passo 6: Aplicar Aritmética de Imagem com Entrada A: Resultado do Passo 2 (Limiar); Entrada B: Resultado do Passo 5: (Limiar); Canais de resultado: como entrada A; Expressão: A-(B>0)
Passo 7: Aplicar o Filtro de Aprimoramento de Estrutura com Imagem de entrada: Objeto de dados importado; Interpretação: 3D; Tipo tensorial: Arça; Desvio padrão min/max: 1 - 3 pixels; Passo de desvio padrão: 1 pixel; Contraste: Escuro; Tipo de estrutura: Plano.
Passo 8: Aplicar Auto Thresholding com Imagem de Entrada: Resultado do Passo 7 (Filtro de Aprimoramento de Estrutura); Tipo: Alto Limite Auto; Interpretação: 3D; Modo: Min-max; Critério: Factorização.
Passo 9: Aplicar o Filtro de Aprimoramento de Membrana com Dados: Objeto de dados importado; Seleção de saída: Votação do Tensor de Planidade; Escala de votação tensorial: 3 pixels; Escala de densificação: 3 pixels; Tipo: Crista
Contraste: Escuro; Escala: 1 pixel.
Passo 10: Aplicar Auto Thresholding com Imagem de Entrada: Resultado do Passo 9 (Filtro de Realce de Membrana); Tipo: Alto Limite Auto; Interpretação: 3D; Modo: Min-max; Critério: Factorização.
Passo 11: Aplicar Dilatação - essa etapa exigirá otimização dependendo do tamanho dos espaços de junta - com Imagem de entrada: Resultado do Passo 10 (Limite Automático); Tipo: Bola; Interpretação: 3D; Tamanho: 1 pixel; Precisão: Mais rápido.
Passo 12: Aplicar Aritmética de Imagem com Entrada A: Resultado do Passo 11 (Dilatação); Entrada B: resultado do Passo 8 (Auto Threshold); Entrada C: Resultado da Previsão de Aprendizado Profundo; Canais de resultado: como entrada A; Expressão: A||B||C.
Passo 13: Aplicar Remover Pequenos Pontos com Imagem de Entrada: Resultado do Passo 12 (Aritmética da Imagem); Interpretação: 3D; Tamanho: 500 pixels.
Passo 14: Aplicar Aritmética de Imagem com Entrada A: Resultado do Passo 13 (Remover Pequenas Manchas); Entrada B: Resultado do Passo 6 (Aritmética de Imagem); Canais de resultado: como entrada A; Expressão:! A*B.
Passo 15: Aplicar Remover Pequenas Manchas com Imagem de Entrada: Resultado do Passo 14 (Aritmética da Imagem); Interpretação: 3D; Tamanho: 500 pixels.
Passo 16: Aplicar Rotulagem com Imagem de Entrada: Resultado do Passo 15 (Remover Pequenas Manchas); Interpretação: 3D; Bairro: 26.
Passo 17: Aplicar Converter Tipo de Imagem com Dados: Resultado do Passo 1 (Filtro Mediano); Tipo de saída: 16-bit sem sinal; Modo de normalização: Escalonamento; Escalonamento: Escala 3, Offset 2000.
Passo 18: Aplicar a Máscara Interior da Bacia Baseada em Marcadores com Dados: Resultado da Etapa 17 (Converter Tipo de Imagem); Marcadores: Resultado do Passo 16 (Rotulagem); Máscara binária: resultado do passo 6 (Aritmética de Imagem); Tipo dividido: Baixa intensidade.

Teste e quantificação do método de segmentação
O método de segmentação foi testado por meio da geração de uma receita que incorporava a previsão conjunta DL com a receita de processamento de imagem a jusante em uma faixa de intensidade de 2500 a 20000 unidades de Hounsfield. A geração de receitas permitia o processamento em lote (Aplicar uma Receita em um Batch de Arquivos) dos conjuntos de dados micro-CT originais (formato .am como pilha de imagens salvas após a importação de arquivos iniciais de .dcm para o Amira). O hardware do computador incluía 16 núcleos de uma unidade central de processamento (CPU) Intel Xeon Gold 5218 a 2,30 GHz, 128 GB de código de correção de erros de quarta geração (DDR4) com taxa dupla (DDR4), memória de acesso aleatório (RAM) a 2666 megatransferências (MT)/s, e 24 GB de unidade virtual de processamento gráfico (vGPU/VRAM) em um sistema operacional de 64 bits rodando Windows 10 (versão do sistema operacional: 19044.4780). Cada conjunto de dados do hindpaw (2 hindpaws) foi segmentado em aproximadamente 32,7 ± 8,42 min (média ± desvio padrão) sem intervenção do usuário. Isso é comparado ao modelo anterior do SA, onde o tempo de segmentação dependia da experiência do usuário, com usuários iniciantes em 40,5 ± 9,06 minutos por conjunto de dados e usuários experientes em 19,3 ± 5,34 minutos por conjunto de dados (apenas conjuntos de dados WT, incluindo correção de erros de segmentação)12. Tanto os métodos DL quanto os SA demonstram melhorias notáveis em relação ao padrão ouro anterior de contorno manual para segmentação, com 190,6 ± 30,4 min por conjunto de dados por um usuário experiente (realizado usando análise convencional Scanco)12. Os conjuntos de dados das patas dianteiras (2 patas dianteiras) foram segmentados em aproximadamente 53,4 ± 23,6 minutos sem intervenção do usuário, onde o aumento do tempo de segmentação pode ser atribuído a estruturas adicionais dentro dos conjuntos de dados de imagem originais (ou seja, coluna e costelas), que não estão presentes nas patas traseiras mais isoladas distalmente e inflam o tempo de segmentação na ausência de etapas anteriores de edição de volume.

A quantificação da precisão foi realizada por inspeção visual (HMK) para identificar segmentação correta ou tipo de erro com base na anatomia óssea esperada (Hindpaw:12,39; Pata dianteira: 40). A precisão foi calculada como porcentagem por:

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onde verdadeiros positivos eram ossos segmentados corretamente, verdadeiros negativos eram 0 (não há circunstâncias em que ossos devam estar faltando, e o background não era relevante para quantificação), falsos positivos eram ossos excessivamente divididos, e falsos negativos eram ossos sobreconectados. Foi determinado que a precisão era uma métrica quantitativa apropriada dado o problema de classe única (ou seja, identificação de espaços articulares), e os verdadeiros negativos (ou seja, antecedentes) não contribuíram nos cálculos de precisão, reduzindo assim o risco de superestimação do desempenho. O método automatizado de segmentação não inclui nomeação óssea; os nomes dos ossos são posteriormente associados manualmente ao segmentado dos materiais pelo usuário.

A avaliação das patas traseiras envolvidas neste estudo confirmou a fusão fixa nos tarsos do cuneiforme navicular e lateral (NAVLAT) em camundongos C57BL/641, e determinou adicionalmente que o cuneiforme intermediário adjacente (INT) também pode estar variadamente fundido com a estrutura NAVLAT (NAVLATINT)12,39. Fusão variável semelhante foi apreciada na região do carpo das patas dianteiras, onde os ossos trapezoides (ZOID; multiangular menor) e central (CENT) podem se apresentar como uma única estrutura fundida (CENTZOID) ou subdivididos em seus ossos individuais, particularmente nas patas dianteiras. Ossos do carpo adicionais investigados para precisão de segmentação incluíram o trapézio (ZIUM; maior multiangular), capitado (CAP), hamato (HAM), triquetrum (TRI; triangular), pisiforme (PIS), escafóide (navicular)/lunado (SCAPHATE; fusão fixa) e falciforme (FALC). Os metacarpos da pata dianteira (MET-F; 1-5), falanges proximais (PP-F; 1-5), falanges distais (DP-F; 2-5) e sesamoides (S-F; 1-10) são numerados de lateral a medial, ao contrário dos equivalentes da pata traseira (metatarsos (MET-H), PP-H, DP-H e S-H), que são numerados de12 de medial a lateral. Junto com o NAVLATINT, ossos tarsais adicionais foram avaliados para as patas traseiras, conforme descritoanteriormente 12,23, incluindo o calcâneo (CALC), cuboide (CUB), cuneiforme medial (MED), talus (TAL) e tíbia (TIB). Note que as quantificações de precisão geral das coortes variam ligeiramente ao comparar a avaliação da precisão média por conjunto de dados com um número variável de ossos devido a fusões anatômicas versus a precisão calculada com base no total de ossos individuais analisados.

Análise estatística
A análise estatística, incluindo análise de efeitos mistos de 3 ou 2 vias com efeitos de interação ou comparações múltiplas de Sidack e teste exato de Fisher, foi realizada conforme apropriado no GraphPad Prism (v10.2.0; San Diego, CA, EUA). Machos (2-8 meses) e fêmeas (2-5 meses) foram analisados separadamente, considerando os distintos períodos de avaliação baseados na mortalidade feminina inicialdo TNF-Tg 32. Os tamanhos das amostras das patas traseiras WT usadas para treinamento/validação e testes metodológicos são fornecidos na Tabela Suplementar 1, juntamente com detalhes do tamanho da amostra para as patas traseiras e dianteiras WT e TNF-Tg testadas na Tabela Suplementar 2, Tabela Suplementar 3 e Tabela Suplementar 4. Como certos momentos para o teste de pata traseira WT incorporaram avaliação de precisão para <3 patas traseiras, efeitos de interação foram relatados sem comparações múltiplas pós-hoc em análises que incluíram patas traseiras WT. Partes inteiras ou partes das patas traseiras foram omitidas da análise caso houvesse erros de imagem com captura incompleta da pata, artefato de movimento considerável que tornasse os exames ininterpretáveis e/ou se o animal morresse antes da sessão de imagem agendada, pois todos os dados foram coletados in vivo.

Results

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A implementação da identificação automatizada do espaço articular melhora a precisão da segmentação óssea
Dada a heterogeneidade do formato e arquitetura óssea em estruturas complexas como a pata traseira murina, desenvolvemos nosso algoritmo sistemático de processamento de imagens12 até previsões de treinamento DL (azul), combinadas com etapas de processamento de imagem para uma identificação robusta de espaços articulares entre ossos em conjuntos de dados micro-CT (Figuras 1A-B; processo descrito abaixo e mostrado na Figura Suplementar 1). A identificação dos espaços entre os ossos permitiu a separação e segmentação precisa dos ossos individuais da pata traseira (cores separadas; Figura 1C). Para o componente DL, os conjuntos de dados de treinamento e validação (WT) consistiram em idades iguais (2-6 meses de idade, n=8 patas traseiras por idade) e sexo (n=20 patas traseiras por sexo). O restante dos traseiros WT (n=44, de 2 a 8 meses de idade, excluindo 6 meses, pois todos eram usados para treinamento e validação) serviu como conjunto de dados de teste para quantificar a precisão da segmentação óssea (Figura 1D). Havia 2 traseiras machos WT aos 2 meses e 2 fêmeas WT às 3 meses que foram omitidos devido a erro de imagem (Tabela Suplementar 1).

Além da implementação em patas traseiras WT, também testamos a abordagem automatizada de segmentação em patas traseiras de camundongos TNF-Tg (n=56 patas traseiras machos, n=48 fêmeas) com artrite espontânea inflamatória-erosiva. Havia 4 fêmeas com TNF-Tg nas patas traseiras tanto aos 4 quanto aos 5 meses que foram omitidas devido a erro de imagem ou morte prematura antes do desfecho aos 5 meses (Tabela Suplementar 2). O inovador algoritmo de segmentação detectou automaticamente os espaços articulares (azul, à esquerda) para separação óssea individual (cores, à direita) entre ambos os sexos e genótipos (Figura 2A-D). Para a precisão de segmentação de ossos individuais mostrada nas Tabelas Suplementares 5 e Tabelas Suplementares 6, a WT superou os conjuntos de dados TNF-Tg tanto para homens (WT 98,4% versus TNF-Tg 93,1%, p<0,0001) quanto para mulheres (WT 98,7% versus TNF-Tg 92,1%, p<0,0001). A fonte do erro foi demonstrada visualmente como o fechamento incompleto dos espaços articulares (setas em uma caixa branca tracejada), assim, inadvertidamente, conectando dois ossos distintos em uma única segmentação (Figura 2C-D). Esses erros superconectados demonstrados nas patas traseiras do TNF-Tg podem representar sequelas de danos crônicos que levam à fusão articular, onde o espaço entre os ossos deixa de existir. De fato, a diferença de precisão entre os conjuntos de dados WT e TNF-Tg torna-se mais pronunciada ao longo do tempo à medida que a gravidade da artrite aumenta (Figura 2E-F), especialmente nos ossos tarsais (Figura 2G-H, amarelo = maior precisão, verde = diminuição da precisão), que normalmente servem como biomarcadores confiáveis para a progressão da erosãoóssea 23. No entanto, em comparação com nossa abordagem anterior de segmentação SA, houve uma melhora notável na precisão geral do conjunto de dados (Figura 2E-F; WT masculino: SA 79,39% ± 5,73% contra DL 98,16% ± 1,47%, p<0,0001; Mulher em WT: SA 79,16% ± 4,84% contra DL 99,19% ± 1,63%, p<0,0001), demonstrando avanços metodológicos robustos tanto em automaticidade quanto em confiabilidade. Assim, nosso novo modelo estratégico para segmentação do osso da pata traseira usando identificação facilitada pelo espaço articular por DL oferece uma precisão significativamente maior na segmentação em conjuntos de dados WT (>98%) em comparação com métodos anteriores de SA (~79%), mas com desempenho levemente deprecado quando aplicado em patas traseiras com artrite inflamatória-erosiva (92%-93%).

A aplicação flexível do método de segmentação às patas dianteiras destaca destruição articular pronunciada e fusões ósseas em camundongos TNF-Tg, com rápida redução na precisão da segmentação
Ampliamos ainda mais a aplicação do novo método de segmentação às patas dianteiras murinas (n=55 patas dianteiras machos WT, n=29 patas dianteiras femininas WT, n=54 patas dianteiras masculinas TNF-Tg e n=50 patas dianteiras femininas TNF-Tg) com tamanho ósseo e anatomia únicos. Havia 1 pata dianteira aos 4 meses do macho WT, 1 pata dianteira aos 4 meses e 2 patas dianteiras aos 5 meses para a fêmea WT, 2 patas dianteiras aos 3 meses para o macho TNF-Tg, e 2 patas dianteiras aos 4 meses e 4 patas dianteiras aos 5 meses para a fêmea TNF-Tg, que foram omitidos devido a erro de imagem ou morte prematura antes do desfecho final. Além disso, houve um erro parcial de imagem para 1 pata dianteira aos 3 meses na fêmea WT, com a omissão de DP-F3, PP-F3, DP-F4 e PP-F4 (Tabela Suplementar 3 e Tabela Suplementar 4). Para orientação, fornecemos um modelo da pata dianteira WT com cada osso individual separado por cor e nomenclatura específica do osso, indicada a partir de diferentes pontos de vista (Figura 3). Investigações anteriores em camundongos TNF-Tg focaram principalmente na pata traseira, enquanto aqui demonstramos a arquitetura das patas dianteiras murinas tanto em camundongos WT quanto TNF-Tg. Destacamos especialmente os carpos (círculo tracejado amarelo) e os sesamoides (círculo tracejado azul) que apresentam doenças erosivas visualmente profundas, especialmente em mulheres com TNF-Tg (Figura 4A-D). Assim, a comparação da precisão da segmentação da pata traseira e da parte dianteira mostrou redução significativa nas patas dianteiras (efeito do tipo de pata p<0,0001), principalmente impulsionada pelo declínio acentuado da integridade óssea com aumento da idade e gravidade da doença nos conjuntos de dados TNF-Tg (Figura 4E-F; efeito genótipo pata-pata p=0,0083; patas dianteiras machos: WT 87,29% ± 2,07% contra TNF-Tg 72,65% ± 11,70%), p<0,0001). Semelhante aos traseiros, a queda na precisão da segmentação do TNF-Tg com o envelhecimento e a gravidade da doença é mais pronunciada nos carpos, assim como nos sesamoides (Figura 4G-H, Tabela Suplementar 7 e Tabela Suplementar 8). Essa patologia óssea regional pode ser impulsionada por atividade erosiva aumentada na articulação adjacente da articulação MET-F e PP-F (articulação metacarpopalângica). A avaliação do tipo de erro revelou que as patas dianteiras do TNF-Tg tendem a apresentar uma proporção maior de ossos completamente erodidos em comparação com as patas traseiras (Figura Suplementar 2, vermelha como ausente). Embora certamente representative da gravidade progressiva da artrite, a ausência de ossos nas patas dianteiras do TNF-Tg também pode evidenciar uma limitação na resolução da imagem. As erosões severas nas patas dianteiras do TNF-Tg são ainda mais demonstradas por imagens representativas ao longo do tempo que destacam a região do carpo (setas brancas) e a luxação completa progressiva da pata do antebraço (setas amarelas), mais notável em fêmeas TNF-Tg (Figura Suplementar 3). Assim, a aplicação flexível do método automatizado de segmentação óssea a estruturas únicas da pata dianteira mostrou desempenho notável nos conjuntos de dados de WT (~87%) com redução semelhante na precisão nas patas dianteiras TNF-Tg com artrite inflamatória-erosiva (67%-72%).

Disponibilidade de dados:
Como descrito na seção de coleta de imagens micro-CT, os dados do Hindpaw foram publicados anteriormenteem 12, 23, 35 e estão disponíveis publicamente a28 https://doi.org/10.5281/zenodo.11191782. Os dados para quantificação da precisão no método de segmentação SA para os conjuntos de dados WT12 eTNF-Tg 23 foram reaproveitados para comparação direta com o novo modelo DL descrito aqui. Nenhum dado específico do estudo anterior adicional foireaproveitado em 35, mas os mesmos conjuntos de dados hindpaw que estão publicamentedisponíveis em 28 também foram utilizados. Detalhes adicionais sobre licenciamento e reutilização de dados são fornecidos abaixo. Para os fins do estudo descrito, os dados correspondentes da pata dianteira também foram disponibilizados publicamente no repositório Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.14865639)29.

Os dados de precisão para o método de segmentação SA WT12 foram reaproveitados na Figura 2. O reuso deste material é protegido pela Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-NãoDerivados 4.0 International https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode. Como autores da obra referenciada, mantemos o direito de preparar outras obras derivadas por meio dos Direitos do Autor da Elsevier https://beta.elsevier.com/about/policies-and-standards/copyright. Os pontos de dados foram revisualizados para comparação com precisão ao longo do tempo com os equivalentes TNF-Tg e diretamente comparados ao novo método DL descrito aqui.

Os dados de precisão para os conjuntos de dados WT e TNF-Tg 23 do método de segmentaçãoSA foram reaproveitados para a Figura 2, e os conjuntos de dados WT e TNF-Tg do Hindpaw foram posteriormente avaliados para medições volumétricasanteriormente 23. O reuso do material é protegido pela Licença de Atribuição Creative Commons (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), que permite uso, distribuição e reprodução irrestritos em qualquer meio, desde que o autor original e a fonte sejam creditados. Os pontos de dados foram revisualizados para avaliação da precisão ao longo do tempo e diretamente comparados com o novo método DL descrito aqui.

Os mesmos conjuntos de dados de dados posteriores WT e TNF-Tg disponíveispublicamente 28 foram ainda utilizados para medições volumétricas ósseas anteriormente para comparações inovadoras com coortes de corrida derodas 35. O reuso do material é protegido pela Licença Internacional Creative Commons Attribution 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), que permite uso, compartilhamento, adaptação, distribuição e reprodução em qualquer meio ou formato, desde que você dê o devido crédito ao(s) autor(es) original(es) e à fonte, forneça um link para a licença Creative Commons e indique se foram feitas alterações. Os mesmos conjuntos de dados disponíveispublicamente, 28 , foram utilizados no trabalho atual, mas sem qualquer utilização específica ou modificação de pontos de dados previamente publicados.

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Figura 1: Detecção automatizada do espaço articular por processamento estratégico de imagens e previsões de aprendizado profundo para segmentação óssea. Conjuntos de dados micro-CT de Murine com visualização de (A) as superfícies dorsal (superior) e plantar (inferior) foram processados para (B) identificação automatizada subsequente dos espaços articulares (azuis) usando um modelo DL (descrito na Figura Suplementar 1) desenvolvido a partir de segmentações ósseas padrãoouro 12,23. (C) A separação óssea final bem-sucedida (cores específicas do osso) foi realizada por meio de uma combinação adicional de etapas de processamento de imagem, incluindo um top hatpreto 12, aprimoramentoestrutural 37 e aprimoramento de membrana com votação tensorial38 para identificação robusta do espaço articular para rotular ossos individuais. (D) Treinamento e validação (n=40 patas traseiras) do componente DL foram realizadas com patas traseiras murinas WT de igual idade (de 2 a 6 meses, n=8 patas traseiras em cada momento temporal) e distribuição sexual (n=20 patas traseiras macho/fêmea), com 25% dos subvolumes usados para validação (3 subvolumes por pata traseira, total de 120 subvolumes). As demais patas traseiras WT (n=44) foram avaliadas como casos de teste para análise posterior. A combinação do modelo DL e dos algoritmos de processamento de imagem foi avaliada usando conjuntos de dados previamente publicados e publicamentedisponíveis 23,28. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: A implementação da identificação automatizada do espaço articular com facilitação de aprendizado profundo melhora a precisão da segmentação óssea. (A-B) Após o desenvolvimento da detecção automatizada do espaço articular, aplicamos o modelo DL (esquerda: espaços articulares azuis; direita: cores de segmentação específicas do osso) aos demais casos de teste para homens e mulheres WT. (C-D) Também avaliamos o desempenho em coortes com idade pareada (homens: 2 a 8 meses; fêmeas: 2 a 5 meses) de camundongos TNF-Tg com artrite progressiva inflamatória-erosiva associada à mortalidade precoce emmulheres de 32 anos. Imagens inseridas demonstram erros de segmentação de alta ampliação (caixas tracejadas) onde desconexões nos espaços articulares previstos (setas brancas) levam a um vazamento na separação óssea, resultando em erros de segmentação óssea sobreconectada. (E-F) Note que o ponto de tempo masculino de 6 meses foi omitido, pois todos os conjuntos de dados WT foram utilizados para treinamento e validação, então não foram incluídos na coorte de testes DL. Comparado aos nossos algoritmos anteriores de segmentaçãoSA 12,23, a precisão da segmentação (ossos corretamente segmentados / ossos totais) foi notavelmente melhorada para conjuntos de dados WT e TNF-Tg com a abordagem DL, independentemente do sexo (linhas médias de precisão: preto sólido = DL WT, preto tracejado = DL TNF-Tg, cinza sólido = SA WT, cinza tracejado = SA TNF-Tg). No entanto, a precisão das segmentações TNF-Tg diminuiu notavelmente com o tempo e o dano progressivo associado às articulações em comparação com WT, embora continuasse a superar o método SA. (G-H) Mapas de calor com precisão especificados aos compartimentos ósseos (T = tarsos, MT = metatarsais, PP = falanges proximais, DP = falanges distas, S = sesamoides) demonstram o aumento da taxa de erro em camundongos TNF-Tg como predominantemente localizado na região tarsal (claro (amarelo) = alto (100%), escuro (roxo) = baixa (20%) precisão). Como mencionado, imagens inseridas (C-D) destacam a fonte do erro com espaços articulares desconectados (setas, imagem à esquerda), levando a ossos sobreconectados (cores, imagem à direita). Na verdade, os erros eram predominantemente sobreconectados (ossos 2+ segmentados como 1 material; observado na Figura Suplementar 2), o que pode representar o processo patológico de fusões articulares com gravidade crescente da artrítica. Estatística: análise de efeitos mistos em 3 vias (SA versus DL; método x genótipo x tempo; E-F), análise de efeitos mistos em duas vias (WT vs TNF; genótipo x tempo; E-H); p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05 (efeitos de interação); dados apresentados como média ± desvio padrão. Tamanhos das amostras: n=34 patas traseiras macho WT (n=2 aos 2 meses, n=4 aos 3 meses, n=6 aos 4-5 meses, n=0 aos 6 meses [todos os dados usados para testes], n=8 aos 7-8 meses), n=10 patas traseiras WT fêmea (n=4 aos 2 meses, n=2 aos 3-5 meses), n=56 patas traseiras TNF-Tg macho (n=8 aos 2-8 meses), e n=48 patas traseiras TNF-Tg fêmea (n=14 aos 2-3 meses e n=10 aos 4-5 meses). Os dados usados nesta figura foram modificados em relação a estudos anteriores12,23. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: A aplicação flexível da segmentação de aprendizado profundo no espaço articular a outras estruturas complexas destaca a anatomia óssea da pata dianteira murina. Em seguida, avaliamos o potencial do modelo DL de segmentação articular no espaço articular para separar automaticamente ossos em estruturas complexas adicionais além da pata traseira. O método de segmentação foi implementado nos conjuntos de dados correspondentes de micro-CT da pata dianteira visualizados das superfícies (A) dorsal, (B) plantares, (C) laterais e (D) mediais, com cores representando ossos segmentados individuais. Identificamos o potencial para segmentação precisa dos ossos da pata dianteira, incluindo carpos distintos, metacarpos (#, MET-F), falanges proximais (^, PP-F), falanges distais (~, DP-F), sesamoides (círculos tracejados, S-F) e garras (*) com rotulagem específica para osso correspondente à anatomia conhecida da patadianteira 40. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: Camundongos TNF-Tg apresentam destruição pronunciada das articulações da pata dianteira e fusões ósseas, com rápida redução na precisão da segmentação. (A-B) Dada a complexidade e a pequena arquitetura das patas dianteiras murinas, destacada pela visualização dorsal (esquerda) e plantar (direita) de imagens micro-CT de camundongos machos e fêmeas WT, (C-D) a anatomia e a artrite associada em camundongos TNF-Tg não haviam sido avaliadas anteriormente. A aplicação de nossa nova abordagem DL no espaço articular proporcionou uma oportunidade inicial para avaliar essas estruturas complexas ao reduzir os desafios analíticos com >85% de precisão das patas dianteiras WT, embora com precisão deficiente em comparação com as traseiras (linhas médias de precisão: azul sólido = traseira WT, azul tracejado = pata traseira TNF-Tg, vermelho sólido = pata dianteira WT, vermelho tracejado = pata dianteira WT, vermelho tracejado = pata dianteira TNF-Tg). (E-F) Além disso, as patas dianteiras do TNF-Tg apresentaram um declínio rápido e dramático na precisão da segmentação devido a erros localizados nos carpos (círculos amarelos pontilhados em A a D) e nos sesamoides (círculos azuis pontilhados em A a D) ao longo do tempo. (G-H) As reduções regionais diminuídas na precisão da segmentação são mostradas por mapas de calor (luz (amarelo) = alto (100%), escuro (roxo) = baixa precisão (20%) dos compartimentos ósseos (C = carpos, MC = metacarpos, PP = falanges proximais, DP = falanges distas, S = sesamoides). Note que o ponto de tempo masculino de 6 meses foi omitido em (E), pois todos os conjuntos de dados do Backpaw WT foram utilizados para treinamento e validação, portanto não foram incluídos na coorte de teste DL. Estatísticas: análise de efeitos mistos em três vias (pata traseira vs pata dianteira, WT vs TNF; genótipo tipo x pata x tempo, efeitos de interação reportados; E-F), análise de efeitos mistos bidirecionais com comparações múltiplas de Sidack (WT vs TNF; genótipo x tempo; G-H); p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05; dados apresentados como média ± desvio padrão. Tamanhos das amostras: n=55 patas dianteiras macho WT (n=8 aos 2-3 e 5-8 meses, n=7 aos 4 meses), n=29 patas dianteiras WT fêmea (n=8 aos 2-3 meses, n=7 aos 4 meses, n=6 aos 5 meses), n=54 patas dianteiras TNF-Tg macho (n=8 aos 2 e 4-8 meses, n=6 aos 3 meses), e n=50 patas dianteiras (n=14 aos 2-3 meses, n=12 aos 4 meses e n=10 aos 5 meses). Dados da pata traseira do DL (E-F) reproduzidos da Figura 2E-F para comparação adicional com dados da pata dianteira do DL. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1: Desenvolvimento e treinamento do modelo de deep learning com detecção conjunta. (A) Regiões articulares de verdade no solo foram obtidas a partir de segmentações iniciais do osso da verdade do solo por uma receita automática usando Amira, que combina expansão do rótulo, extração de interfaces de rótulos, mascaramento e dilatação. (B) Para cada um dos 20 conjuntos de dados micro-CT de treinamento (40 patas traseiras), 6 subvolumes de 200 x 200 vóxeis foram extraídos manualmente de tarsos, falanges distais e regiões de fundo, divididos igualmente entre as patas esquerda e direita (3 patches por pata traseira). Os 120 subvolumes resultantes foram então usados como entrada para um módulo de treinamento Amira de segmentação 3D, juntamente com regiões articulares rotuladas correspondentes como alvo de verdade no solo. Um subconjunto randomizado de patches de 25% foi usado para validação e controlar o sobreajuste do modelo durante o treinamento. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 2: Distribuição distinta dos tipos de erro entre as patas traseiras e as patas dianteiras. Semelhante ao algoritmo de segmentação SA desenvolvidoanteriormente no 12,23, o modelo DL do espaço articular produziu a maior proporção de erros ao sobreconectar ossos (verdes, ossos 2+ segmentados como 1 material), mais notável nas patas traseiras (A-D) ou (E-F) WT nas patas dianteiras. Como observado na Figura 2, erros de superconexão ocorrerão se houver uma lacuna no espaço articular detectado que pode ocorrer por vários motivos, incluindo maior proximidade óssea do que resolução da imagem, artefato de movimento que desfoca o espaço articular ou remodelação óssea no contexto da artrite, levando a fusões articulares. (G-H) Curiosamente, as patas dianteiras do TNF-Tg apresentam uma proporção notavelmente maior de ossos ausentes (vermelho), o que significa que o osso estava completamente ausente da segmentação. Esses erros provavelmente são atribuídos a uma combinação de erosões severas e deficiências na resolução da imagem, dado o tamanho relativamente menor dos ossos das patas dianteiras, especialmente carpos e sesamoides, como principal fonte de erro (Figura 4), em comparação com os ossos das patas traseiras. Tipos adicionais de erros incluem over-split (azul, 1 osso segmentado como 2+ materiais) ou tanto over-connected quanto over-split (laranja). Gráficos de pizza representam proporções de erros totais atribuídos a subtipos específicos de erro. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 3: Avaliação da artrite progressiva da pata dianteira com TNF-Tg com erosões ósseas severas e luxações articulares. Para visualizar as mudanças estruturais nas patas dianteiras ao longo do tempo, fornecemos imagens representativas da superfície dorsal de (A) macho WT, (B) macho TNF-Tg, (C) fêmea WT e (D) fêmea TNF-Tg das patas dianteiras ao longo do tempo de 2 a 5 meses (da esquerda para a direita) para destacar particularmente a região do carpo (setas brancas). Note as severas erosões ósseas e remodelações que ocorrem aproximadamente 4 meses em mulheres e 5 meses em machos. Esses períodos antecedem o início típico de erosões ósseas severas nas patas traseiras, aproximadamente 5 meses nas fêmeas e 7 a 8 meses nosmachos com 23 anos. (E) Uma vista lateral das patas dianteiras femininas do TNF-Tg também é mostrada para demonstrar a deslocação progressiva de toda a pata em relação ao antebraço (setas amarelas) associada à destruição da articulação. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Tamanhos de amostra dos traseiros WT para treinamento de DL, validação e testes metodológicos. Os tamanhos das amostras no número de patas traseiras são fornecidos ao longo da idade (meses 2-8) e organizados por conjuntos de dados usados para treinamento/validação de DL, testes metodológicos totais ou aqueles omitidos, seja por erro de imagem, artefato de movimento severo ou morte antes da micro-tomografia programada. Células negras dos meses 6 a 8 nas mulheres indicam a interrupção planejada dos exames após 5 meses devido à mortalidade precoce dos equivalentes experimentais com TNF-Tg. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Tamanhos de amostra dos traseiros do TNF-Tg para testes metodológicos. Os tamanhos das amostras no número de patas traseiras são fornecidos ao longo da idade (meses 2-8) e organizados por conjuntos de dados usados para testes metodológicos totais ou por aqueles omitidos devido a erro de imagem, artefato de movimento severo e/ou morte antes da micro-tomografia programada. Glóbulos negros dos meses 6 a 8 para as fêmeas indicam a interrupção planejada dos exames após 5 meses devido à mortalidade precoce de camundongos fêmeas com TNF-Tg. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 3: Tamanhos das amostras das patas dianteiras WT para testes metodológicos. Os tamanhos das amostras no número de patas dianteiras são fornecidos entre idades (meses 2 a 8) e organizados por conjuntos de dados usados para testes metodológicos totais ou por aqueles omitidos devido a erro de imagem, artefato de movimento severo e/ou morte antes da micro-tomografia programada. Células negras dos meses 6 a 8 nas mulheres indicam a interrupção planejada dos exames após 5 meses devido à mortalidade precoce dos equivalentes experimentais com TNF-Tg. *Aos 3 meses para fêmeas WT, n=1 pata dianteira havia omitido DP-F3, PP-F3, DP-F4 e PP-F4 devido a erro de imagem, embora o restante da pata dianteira tenha sido avaliado. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 4: Tamanhos de amostra das patas dianteiras do TNF-Tg para testes metodológicos. Os tamanhos das amostras no número de patas dianteiras são fornecidos entre idades (meses 2 a 8) e organizados por conjuntos de dados usados para testes metodológicos totais ou por aqueles omitidos devido a erro de imagem, artefato de movimento severo e/ou morte antes da micro-tomografia programada. Glóbulos negros dos meses 6 a 8 para as fêmeas indicam a interrupção planejada dos exames após 5 meses devido à mortalidade precoce de camundongos fêmeas com TNF-Tg. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 5: Precisão óssea individual das patas traseiras dos machos. Para identificar os ossos específicos que reduzem a precisão de segmentação em TNF-Tg versus traseiras WT, são fornecidos detalhes sobre o número de ossos segmentados corretamente, incorretamente e a porcentagem correta em relação ao total de ossos avaliados em camundongos machos. Na região tarsal onde ocorrem os déficits primários (Figura 2), o calcâneo (CALC), o cuneiforme intermediário (não fundido, INT) e o cuneiforme navicular/lateral (não fundido) apresentaram a queda mais proeminente na precisão para as patas traseiras do TNF-Tg. Estatísticas: teste exato de Fisher; *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 6: Precisão óssea individual das patas traseiras das fêmeas. Para identificar os ossos específicos que reduzem a precisão da segmentação em TNF-Tg versus patas traseiras WT, são fornecidos detalhes sobre o número de ossos segmentados corretamente, incorretamente e a porcentagem correta em relação ao total de ossos avaliados em camundongos fêmeas. Dada a utilização de conjuntos de dados para treinamento e validação de DL, juntamente com a redução do prazo para 5 meses para comparação com camundongos TNF-Tg que apresentam mortalidadeprecoce 32, o número total de patas traseiras de teste de DL alocadas para fêmeas WT limita a capacidade de comparações ósseas individuais para explicar a diminuição geral da precisão nos conjuntos de dados TNF-Tg. Estatísticas: teste exato de Fisher; p<0,0001. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 7: Precisão óssea individual das patas dianteiras masculinas. Para identificar os ossos específicos que reduzem a precisão de segmentação entre as patas dianteiras TNF-Tg versus WT, são fornecidos detalhes sobre o número de ossos segmentados corretamente, incorretamente e a porcentagem correta em relação ao total de ossos avaliados em camundongos machos. Nas regiões do carpo e dos sesamoides, onde ocorrem os déficits primários (Figura 4), o capitado (CAP), triquetrum (TRI), central (não fundido, CENT), escafoide/lunado (SCAPHATE), trapézio (ZOID) e sesamoides 2-10 apresentaram a queda mais proeminente na precisão para as patas dianteiras do TNF-Tg. Vale ressaltar que a precisão dos sesamoides 1 e 2 é deficiente tanto para os conjuntos de dados WT quanto TNF-Tg. Curiosamente, o metacarpo 1 apresentou melhorias na precisão de segmentação em camundongos com TNF-Tg, possivelmente devido a articulações próximas com ossos adjacentes, levando a erros de superconexão que são mitigados com erosões artríticas. Estatísticas: teste exato de Fisher; *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 8: Precisão óssea individual das patas dianteiras das fêmeas. Para identificar os ossos específicos que reduzem a precisão de segmentação entre as patas dianteiras TNF-Tg e WT, são fornecidos detalhes sobre o número de ossos segmentados corretamente, incorretamente e a porcentagem correta em relação ao total de ossos avaliados em camundongos fêmeas. Nas regiões do carpo e dos sesamoides, onde ocorrem os déficits primários (Figura 4), o capitado (CAP), hamato (HAM), triquetrum (TRI) e sesamoides 1-10 demonstraram a queda mais proeminente na precisão para as patas dianteiras do TNF-Tg. Vale ressaltar que a precisão dos sesamoides 1 e 2 é deficiente tanto para os conjuntos de dados WT quanto TNF-Tg. Estatísticas: teste exato de Fisher; *p<0,05, ***p<0,001, ****p<0,0001. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Receita conjunta de segmentação para treinamento de modelos de aprendizado profundo. Série de etapas embutidas para extrair espaços articulares segmentados de micro-CTs pré-segmentados de padrão ouro que foram usados para treinar o modelo DL para identificação de espaço articular. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Receita de segmentação óssea usando processamento de imagem com facilitação de aprendizado profundo. Série de etapas embutidas para transformar dados originais de micro-CT em segmentações de ossos individuais, usando etapas de processamento de imagem combinadas com a saída da identificação do espaço articular DL para guiar a separação óssea. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Pesos de previsão de deep learning. Arquivo usado como entrada para pesos durante a previsão de aprendizado profundo da segmentação do espaço conjunto. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 4: Arquitetura de previsão de deep learning. Arquivo usado como entrada para arquitetura durante a previsão de deep learning da segmentação conjunta do espaço. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 5: Script de aprendizado profundo em python. Arquivo usado como script em Python para previsão de deep learning da segmentação conjunta do espaço. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ao final das análises totalmente automatizadas dos volumes ósseos em camundongos, geramos melhorias adicionais na segmentação de dados de micro-CT em estruturas complexas, especialmente nas patas traseiras murinas. A estratégia foi focar nos espaços articulados das articulações para criar limites para a separação óssea, onde focar no espaço negativo entre os ossos permitiu uma implementação flexível em estruturas alternativas como a pata dianteira, já que a abordagem não era específica para o formato e anatomia dos ossos distintos da pata traseira. Embora a precisão da segmentação tenha diminuído quando realizada nas patas dianteiras, os conjuntos de dados WT ainda demonstraram precisão óssea de >85%. Processos corretivos bem descritos12 poderiam ser aplicados para criar conjuntos de dados de modelos pré-anotados de pata dianteira para treinamento de DL, reduzindo drasticamente barreiras para a criação de algoritmos específicos para estrutura. Essa abordagem inovadora também permitiu a aplicação em patas TNF-Tg com artrite inflamatória-erosiva severa e progressiva. Nas patas do TNF-Tg, a queda na precisão da segmentação foi marcante ao longo do tempo, correspondendo ao aumento progressivo das erosões ósseas e eventuales fusões patológicas osso-osso devido à remodelação de superfícies erodidas com o aumento da idade. Assim, a aplicação notavelmente bem-sucedida de um modelo automatizado e altamente preciso de segmentação em estruturas de WT tem o potencial de orientar futuras aplicações em modelos de doenças ou outras articulações complexas. Investigações adicionais focarão na otimização da segmentação das articulações artríticas que podem quantificar os efeitos patológicos das erosões e fusões ósseas para identificar biomarcadores de doenças, conforme descritoanteriormente 23.

Apesar da utilização bem-sucedida da micro-TC para monitorar a erosão de ossos pequenos em modelos pré-clínicos de artrite 12,23,25,35,42, houve pouca aplicação das modalidades de TC na avaliação clínica. Em particular para artrite reumatoide, sistemas de pontuação são implementados principalmente para MRI43, ultrassom44,45 e/ou raio-X convencional46, a fim de gerar medidas semi-quantitativas e dependentes do usuário da gravidade da doença, frequentemente em conjunto com métricasclínicas 47. Como a TC é considerada a referência padrão ouro para avaliação da integridadeóssea 48,49, uma otimização adicional das abordagens analíticas clinicamente traduíveis promete proporcionar um benefício tremendo para uma avaliação quantitativa confiável e longitudinal dos volumes ósseos, tanto para informar medidas da gravidade da doença quanto para avaliar a resposta ao tratamento. Embora modalidades de imageamento como a ressonância magnética ofereçam uma maior variedade de informações, incluindo regiões de inflamação, alterações na medula óssea e patologia dos tecidos moles, abordagens inovadoras de imagem computorizada com entradas multi-energiaoferecem potencial para estender a utilização da tomografia além da arquitetura óssea. Apesar desses benefícios propostos, também reconhecemos os imensos desafios na tradução clínica a partir de ferramentas analíticas pré-clínicas desenvolvidas, considerando a aplicação a imagens clínicas de tomografia computológica de baixa resolução e a implementação em anatomia humana distinta. Semelhante à nossa recente identificação de biomarcadores específicos para ossos em modelos pré-clínicos de artrite23, um esforço clínico detalhado investigando métricas puramente quantitativas da erosão óssea seria um grande avanço no monitoramento de doenças.

Embora nosso trabalho atual forneça uma base para a implementação clínica, dado o potencial para aplicação flexível em estruturas novas ao focar em espaços articulares, uma limitação principal é a dependência de um software pré-clínico e orientado para pesquisa bem documentado no Amira, não destinado ao diagnóstico clínico. No entanto, os algoritmos subjacentes e o design estratégico podem ser facilmente implementados em ambientes de software alternativos por meio da metodologia detalhada fornecida. Independentemente do software de pesquisa utilizado, a incorporação ao uso clínico (em vez da investigação) requer esforços translacionais que atendam aos requisitos regulatórios para introdução à prática clínica. Para a aplicação da nova estratégia de segmentação, também é importante considerar as possíveis limitações na resolução diferencial de imagem, onde já descrevemos anteriormente que a resolução da imagem (ou seja, voxel/tamanho da estrutura) é um determinante-chave da precisão da segmentação usando apenas algoritmos de processamentode imagem 12. Na verdade, isso possivelmente está associado à leve redução na precisão de segmentação das patas dianteiras, onde o tamanho reduzido das estruturas das patas dianteiras produziria uma qualidade de imagem relativamente inferior em comparação com as patas traseiras. Também é importante reconhecer a discrepância na faixa etária dos conjuntos de dados de treinamento (2-6 meses) e testes (incluindo 7-8 meses), que podem impactar a aplicação e a precisão com mudanças relacionadas à idade, incluindo crescimento ósseo contínuo ou início adicional de patologia articular. Nossos achados apoiam a precisão mantida para as patas traseiras WT na análise DL além de 6 meses de idade (Figura 2E), sugerindo que a depreciação no desempenho de segmentação em contrapartes do TNF-Tg provavelmente está mais relacionada à progressão inflamatória-erosiva independentemente da própria idade. No entanto, são necessários estudos adicionais com camundongos selvagens idosos e idosos para garantir uma precisão consistente, independentemente da faixa etária específica da coorte de treinamento DL. Por fim, expandir os métodos descritos além de uma abordagem de separação óssea de classe única para uma ferramenta analítica multiclasse mais robusta, que inclua nomes ósseos previstos com base na arquitetura estrutural ou na localização de coordenadas em anatomia fixa (ou seja, semelhante a uma árvore atlas), certamente proporcionará melhorias essenciais e provavelmente aumentará a adoção de métodos.

Em conclusão, desenvolvemos uma nova estratégia de segmentação micro-CT facilitada por processamento de imagens e DL para isolar ossos individuais dentro de estruturas complexas. Essa inovação demonstra uma melhoria notável tanto na automaticidade quanto na precisão da segmentação em comparação com nosso fluxo de trabalho SA12 recentemente criado, que serviu aqui como base para a produção de inúmeras segmentações de padrão ouro para treinar modelos DL e otimizar as melhorias atuais. Embora a tradução dos métodos de segmentação nas patas dianteiras e patas com artrite inflamatória-erosiva tenha apresentado desempenho depreciado, a implementação dessa abordagem de segmentação DL poderia reduzir os esforços manuais necessários para gerar conjuntos de dados completamente anotados que permitam modelos específicos de treinamento de DL para patologia ou estrutura. A utilização desse método DL em estudos futuros pode permitir a otimização da segmentação óssea entre diferentes espécies e modelos de doenças em pesquisas pré-clínicas, permitindo uma análise quantitativa detalhada a jusante. Incentivamos ainda a incorporação dessas estratégias na pesquisa clínica, pois prometem benefícios futuros para o cuidado ao paciente.

Disclosures

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Daniel Lichau e Rémi Blanc são funcionários da ThermoFisher Scientific envolvidos no desenvolvimento e manutenção do software Amira usado para produzir os métodos descritos neste manuscrito. Todos os outros autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

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Fontes de Financiamento: F30AG076326 (HMK), T32GM007356 (HMK), R01AR069000 (CTR), R01AR056702 (EMS) e P30AR069655 (LS, EMS e HAA). HMK foi um trainee no Programa de Treinamento de Cientistas Médicos financiado pelo NIH T32GM007356. O conteúdo é exclusivamente responsabilidade dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais ou NIH. Gostaríamos de agradecer ao corpo docente e funcionário do núcleo de Histologia, Bioquímica e Imagem Molecular, do núcleo de Biomecânica, Biomateriais e Imagem Multimodal de Tecidos, e ao Centro de Pesquisa Musculoesquelética do Centro Médico da Universidade de Rochester por suas contribuições para este trabalho.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sistema computacionalDetalhes fornecidos na seção de Protocolo  Detalhes fornecidos na seção de Protocolo  
Software de visualização de imagensThermoFisher Scientificv2022.2 ou posteriorAmira
IsofluranoVetOne13985-528-60Fluriso, 1-3% para anestesia
RatosCentro Médico da Universidade de RochesterN/AC57BL/6, TNF-transgênico
Micro-CTScanco MedicalN/AVivaCT 40
Software estatísticoGraphPad Software, Incv10.2.0 ou posteriorGraphPad Prisma
FitaN/AN/AFixar as patas dos animais para exames de imagem
TubulaçãoN/AN/APlástico Derlin e acrílico transparente para estabilização animal

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