Explorando a Aplicação da Biosensição Baseada em Espalhamento Raman Aprimorado em Superfícies de SEVs individuais no diagnóstico e terapêuticas de doenças

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar pequenas vesículas extracelulares individuais (sEVs) usando espectroscopia Raman aprimorada superficial sem marcação (SERS), possibilitando diagnósticos minimamente invasivos de doenças e avaliação de sEVs como veículos terapêuticos de entrega.

Abstract

Esse protocolo descreve uma plataforma abrangente e livre de rótulos, que integra espectroscopia Raman aprimorada em superfície (SERS) com aprendizado de máquina (ML) para detectar e perfilar molecularmente pequenas vesículas extracelulares individuais (sEVs) para aplicações diagnósticas e terapêuticas. O método começa com o isolamento de sEV usando cromatografia de exclusão de tamanho ou ultracentrifugação. Vesículas isoladas são então analisadas em substratos de nanopirâmide plasmônica de ouro 2D engenheirada capazes de sensibilidade a vesícula única. Ao aproveitar impressões digitais bioquímicas intrínsecas Raman, o protocolo possibilita detecção de alta especificidade sem rótulos externos. Após a aquisição espectral, os dados passam por pré-processamento e são analisados usando algoritmos treinados de aprendizado de máquina (por exemplo, LDA, SVC) para classificar estados doológicos, distinguindo com sucesso o câncer gástrico dos controles saudáveis usando sEVs de tecido, plasma e saliva, com precisões de classificação respectivas de 90,1%, 70,9% e 60,7%. Além disso, sua aplicação terapêutica é demonstrada pela quantificação da carga de doxorrubicina em sEVs individuais, uma medição aprimorada pelo uso de substratos revestidos com grafeno como padrão interno. Essa abordagem permite uma análise de alto rendimento que captura a heterogeneidade populacional essencial para a detecção precoce da doença e para a compreensão da eficiência do carregamento de medicamentos no nível de vesícula única.

Introduction

Pequenas vesículas extracelulares (sEVs), tipicamente com diâmetro entre 30 e 200 nm, são naturalmente secretadas pelas células em fluidos biológicos e transportam proteínas, lipídios e ácidos nucleicos indicativos de sua célula de^{origem 1,2,3}. Como biomarcadores não invasivos estão presentes na saliva, urina e outros fluidos^{corporais 4}, eles apresentam potencial para o diagnóstico precoce da doença, prognóstico e monitoramento terapêutico, especialmente em^{oncologia ....}

Protocol

A coleta de espécimes humanos foi realizada de acordo com a Declaração de Helsinque e aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) da UCLA. Todos os doadores forneceram consentimento escrito e informado antes de participarem do estudo.

NOTA: Um total de 4 linhagens celulares, AGS (CRL-1739), A549 (CCL-185), NCI-N87 (CRL-5822), Hs 738.St/Int (CRL-7869), todas adquiridas de um fornecedor comercial, foram usadas neste estudo. Essas linhas celulares foram cultivadas e processadas estritamente de acordo com as instruções e reagentes do fornecedor. Os meios condicionados eram coletados e armazenados a -2....

Results

A implementação bem-sucedida do protocolo SERS de vesícula única gera espectros Raman distintos de cada sEVs, permitindo classificação diagnóstica posterior e monitoramento da carga terapêutica de medicamentos. A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho do estudo diagnóstico para câncer gástrico e da aplicação de monitoramento de sEVs carregada com medicamentos, usando nosso protocolo relatado aqui, respectivamente.

Discussion

Um aspecto fundamental deste protocolo é a preparação do substrato e a purificação do sEV. O desempenho do SERS sem marcação depende fortemente da produção de substratos plasmônicos uniformes e de alta conformidade, com forte "ponto quente" de realço. Da mesma forma, o isolamento de sEV de alta pureza por meio de cromatografia de exclusão de tamanho é essencial para fornecer espectros SERS confiáveis e reprodutíveis. Impurezas como agregados proteicos ou lipoproteínas não apenas.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Thermo Fisher Scientific	J61196. AP
Grade de cobre de 300 malhas	Ciências da Microscopia Eletrônica	EMS200-
Solução de paraformaldeído a 4%	Sigma Aldrich	1004960700
4″ Si wafers	MSE Supplies	WA0810	(100) orientado
Linha celular A549	ATCC	CCL-185
Linha celular de AGS	ATCC	CRL-1739
Rotor da centrífuga F-35-6-30, 5430	Eppendorf	22654306
CHA Mark 40	CHA Mark 40	https://chaindustries.com/mark-40-system/	Evaporação por feixe de e-feixe
Solução de cr etchant	Sigma Aldrich	651826-500ML
Doxorubicina  D-4000	Laboratórios LC	D-4000_3g
Sistema ExoView R100 e ExoView Human Tetraspanin Kit	NanoView Biosciences	https://www.nowmedicalstudios. com/portfolio/nanoview- biosciences-3d-product-illustrations
Solução FeCl3	Sigma Aldrich	451649
Solução HF	Sigma Aldrich	695068-500ML
Hs 738.St/Int linha celular	ATCC	CRL-7869
Em Microscópio Raman confocal via	Renishaw	https://www.renishaw.com/en/ invia-confocal-raman-microscope --6260?srsltid=AfmBOoqbZlyW qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0 GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
Solução KOH	Sigma Aldrich	417661
Shakers de bancada MaxQ 4000 para incubação/refrigeração	Termo Científica	SHKA4000 (4320)
Incubadora MCO-19AIC	SANYO	8380-30-0035
Filtro Millex-GP	MilliporeSigma	SLGPM33RS	0,22 & micro; m
Microscópio NanoSEM 230	FEI	SEM-FEI-014
Nanosight NS300	Malvern Panalytical	https://www.malvernpanalytical .com/en/support/produto-suporte /nanosight-range/nanosight-ns300
Linha celular NCI-N87	ATCC	CRL-5822
Optima TLX Ultracentrífuga	Beckman Coulter	8043-30-1197
Oxford Plasmalab 80 Plus	Oxford Plasmalab	https://plasma.oxinst.com/ Produtos/RIE/Plasmapro-800-RIE
Esferas de poliestireno	Alfa Aesar	AA42711AB	500 milhas náuticas
qEVoriginal/35 nm	Izon	ICO-35
Grafeno de camada única	MSE Supplies	ME0408
Frasco T-75	VWR	156800
TF20 EM de alta resolução	FEI	https://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
Solução de acetato de uranila	Ciências da Microscopia Eletrônica	22400-1