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Artigo de método

Explorando a Aplicação da Biosensição Baseada em Espalhamento Raman Aprimorado em Superfícies de SEVs individuais no diagnóstico e terapêuticas de doenças

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DOI:

10.3791/69258

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13 de março de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, University of California Los Angeles, 2Cornea Division, Stein Eye Institute, University of California Los Angeles

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar pequenas vesículas extracelulares individuais (sEVs) usando espectroscopia Raman aprimorada superficial sem marcação (SERS), possibilitando diagnósticos minimamente invasivos de doenças e avaliação de sEVs como veículos terapêuticos de entrega.

Resumo

Esse protocolo descreve uma plataforma abrangente e livre de rótulos, que integra espectroscopia Raman aprimorada em superfície (SERS) com aprendizado de máquina (ML) para detectar e perfilar molecularmente pequenas vesículas extracelulares individuais (sEVs) para aplicações diagnósticas e terapêuticas. O método começa com o isolamento de sEV usando cromatografia de exclusão de tamanho ou ultracentrifugação. Vesículas isoladas são então analisadas em substratos de nanopirâmide plasmônica de ouro 2D engenheirada capazes de sensibilidade a vesícula única. Ao aproveitar impressões digitais bioquímicas intrínsecas Raman, o protocolo possibilita detecção de alta especificidade sem rótulos externos. Após a aquisição espectral, os dados passam por pré-processamento e são analisados usando algoritmos treinados de aprendizado de máquina (por exemplo, LDA, SVC) para classificar estados doológicos, distinguindo com sucesso o câncer gástrico dos controles saudáveis usando sEVs de tecido, plasma e saliva, com precisões de classificação respectivas de 90,1%, 70,9% e 60,7%. Além disso, sua aplicação terapêutica é demonstrada pela quantificação da carga de doxorrubicina em sEVs individuais, uma medição aprimorada pelo uso de substratos revestidos com grafeno como padrão interno. Essa abordagem permite uma análise de alto rendimento que captura a heterogeneidade populacional essencial para a detecção precoce da doença e para a compreensão da eficiência do carregamento de medicamentos no nível de vesícula única.

Introdução

Pequenas vesículas extracelulares (sEVs), tipicamente com diâmetro entre 30 e 200 nm, são naturalmente secretadas pelas células em fluidos biológicos e transportam proteínas, lipídios e ácidos nucleicos indicativos de sua célula deorigem 1,2,3. Como biomarcadores não invasivos estão presentes na saliva, urina e outros fluidoscorporais 4, eles apresentam potencial para o diagnóstico precoce da doença, prognóstico e monitoramento terapêutico, especialmente emoncologia 5,6,7. No entanto, sua tradução clínica é dificultada por sua alta heterogeneidade e baixa abundância em matrizes biológicascomplexas 8. Para superar tais desafios, esse protocolo utiliza espectroscopia Raman aprimorada em superfície (SERS), um método analítico poderoso capaz de amplificar o espalhamento Raman em até10, 10-10 11 vezes por meio de substratos plasmônicos9, 10, 11. O SERS captura espectros moleculares intrínsecos de "impressões digitais" de sEVs individuais em segundos, permitindo uma análise ultra-sensível de vesícula única enquanto evita longos tempos de ensaio.

Nosso método combina sinergicamente SERS baseados em rótulo para alcançar uma caracterização rápida e ultrasensível dos sEVsindividuais 12,13,14,15,16. O SERS sem rótulo captura assinaturas bioquímicas intrínsecas e, quando combinado com modelos de aprendizado de máquina como LDA, SVC, demonstrou discriminar sEVs derivados de células saudáveis versus doentes com altaespecificidade 13. Para aprimorar ainda mais a reprodutibilidade e a capacidade quantitativa da nossa plataforma, nosso método é totalmente compatível com substratos Raman cobertos degrafeno 16. O grafeno de camada única oferece uma superfície quimicamente uniforme que estabiliza pontos quentes plasmônicos e potencializa a adsorçãomolecular 17,18, e, mais importante, o grafeno de camada única serve como o medidor "embutido" dos sinaisSERS 12,19, o que permite a capacidade de quantificar moléculas detectadas. Apesar do diâmetro do feixe de laser Raman (~ 1 μm) ser maior que o típico sEV, nossa plataforma alcança uma resolução eficaz de vesícula única devido à interação única entre mecanismos físicos e estatísticos. O substrato nanopirâmide de ouro quase periódico gera "pontos quentes" plasmônicos altamente localizados, de tamanhos menores que 100 nm, que amplificam sinais Raman de forma superlinear 12. Como resultado, o sinal do sEV estocasticamente mais próximo do ponto quente mais intenso dentro do feixe domina o espectro. Além disso, a imagem SEM confirma que os sEVs estão bem espaçados (> 1 μm de distância), minimizando a sobreposição espectral, enquanto os mapas de intensidade Raman revelam localização de sinal que corresponde ao tamanho das vesículasindividuais 13,14. Juntas, essas características garantem que cada espectro coletado corresponda predominantemente a um único sEV, permitindo uma análise estatisticamente robusta e sem rótulo de uma única vesícula. Comparado a abordagens convencionais, como western blot, espectrometria de massa ou espalhamento Raman regular, que exigem grandes volumes de amostra e não conseguem resolver vesículassimples 20, nossa plataforma SERS de vesícula única oferece sensibilidade, capacidade de transferência e resolução molecular superiores. Esse fluxo de trabalho é adequado para pesquisadores que buscam desenvolver ferramentas diagnósticas minimamente invasivas e de alta resolução ou explorar a heterogeneidade do sEV e a eficiência do carregamento de medicamentos em estudos terapêuticos individualizados. Neste protocolo, demonstramos como nossa plataforma SERS utiliza sEVs individuais para possibilitar a detecção de doenças e aplicações terapêuticas, especialmente em câncer, incluindo todo o fluxo de trabalho de isolamento de vesículas, preparação de substratos plasmônicos, aquisição de Raman e análise de dados com aprendizado de máquina.

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Protocolo

A coleta de espécimes humanos foi realizada de acordo com a Declaração de Helsinque e aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) da UCLA. Todos os doadores forneceram consentimento escrito e informado antes de participarem do estudo.

NOTA: Um total de 4 linhagens celulares, AGS (CRL-1739), A549 (CCL-185), NCI-N87 (CRL-5822), Hs 738.St/Int (CRL-7869), todas adquiridas de um fornecedor comercial, foram usadas neste estudo. Essas linhas celulares foram cultivadas e processadas estritamente de acordo com as instruções e reagentes do fornecedor. Os meios condicionados eram coletados e armazenados a -20 °C antes de serem processados. No Samsung Medical Center, na Coreia, doadores contribuíram voluntariamente com amostras de tecido, plasma e saliva. Tecido de câncer gástrico foi obtido durante a resseção cirúrgica, enquanto biópsias de controles não cancerosos foram coletadas por endoscopia. O plasma foi coletado em tubos EDTA de acordo com protocolos clínicos padrão. Cerca de 5 mL de saliva inteira não estimulada foram coletados de cada sujeito, depois centrifugados a 2.600 × g por 15 minutos a 4 °C. Para preservar o RNA extracelular, o sobrenadante foi suplementado com inibidor SUPERase-In RNase a 20 U/mL. Todos os espécimes foram mantidos a -80 °C até o processamento adicional. As sEVs foram isoladas de meios condicionados e amostras clínicas seguindo protocolosestabelecidos 21.

1. isolamento e caracterização de sEVs

  1. Preparar amostras de sEVs
    1. Descongele completamente o sobrenadante de cultura celular descongelada em temperatura ambiente.
    2. Passe o sobrenadante por um filtro de seringa estéril de 0,22 μm para remover detritos e contaminantes maiores.
    3. Equilibre uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) de 35 nm com solução de PBS de 1×.
    4. Aplique 500 μL da amostra filtrada na coluna.
    5. Elude a amostra com 1x PBS conforme as instruções do fabricante.
    6. Colete as frações enriquecidas com EV e armazene-as em frascos limpos a −20 °C.
  2. Determinar a concentração e o tamanho das partículas
    1. Dilua amostras de sEVs em DPBS estéril até uma concentração final de partículas de 107-10 9 partículas/mL.
    2. Usando um instrumento de rastreamento de nanopartículas, grave cinco vídeos de 60 s por amostra. Use um nível de câmera de 14 e uma vazão constante de 25.
    3. Analise os vídeos com o software do instrumento, aplicando o fator de diluição para determinar a concentração final de partículas (partículas/mL) e o diâmetro médio (nm).
  3. Caracterizar a expressão da tetraspanina
    1. Chips de tetraspanina humana pré-varredura (1 cm × 1 cm, pré-revestidos com anti-CD9, anti-CD63 e anti-CD81) para estabelecer um sinal de referência.
    2. Carregue amostras diluídas de sEV nos chips em uma placa selada de 24 poços e incube durante a noite em temperatura ambiente.
    3. Adicione 35 μL de anticorpos de detecção (anti-CD9 CF488, anti-CD63 CF647, anti-CD81 CF555) e incube por 1 hora em temperatura ambiente.
    4. Lave os chips conforme o protocolo do fabricante.
    5. Meça a expressão vesicular da tetraspanina usando um leitor de caracterização de biomarcadores e seu software de varredura associado.
  4. Confirme a morfologia do sEV com TEM
    1. Fixe ~100 μL sEVs com ~100 μL de paraformaldeído a 4% por 30 min.
    2. Carregue aproximadamente 100 μL de sEVs fixos em grades de cobre de 300 malhas e incube por 5 minutos.
    3. Enxágue as grades com água desionizada.
    4. Tinga as grades com uma solução de 1% de acetato de uranila (~ 20 μL) em água destilada.
    5. Faça um enxágue final com água e deixe as grades secarem completamente ao ar.
    6. Imageie as amostras por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para confirmar o tamanho e a morfologia do sEV.

2. Fabricação de substratos plasmônicos SERS 12,18,19

  1. Criar uma monocamada de nanosfera
    1. Espalhe esferas de poliestireno com 500 nm de diâmetro sobre uma superfície de água dentro de uma calha Langmuir-Blodgett.
    2. Comprima suavemente as esferas para formar uma monocamada hexagonal compacta.
    3. Transfira a monocamada de esfera para uma pastilha de Si de 4 polegadas (com ~50 nm de SiOtérmico 2) mergulhando a pastilha no canal e puxando-a lentamente para cima.
  2. Arranjo de nanosferas de gravação
    1. Reduza o diâmetro da esfera de 500 nm para ~250 nm usando um sistema de gravação por íons reativos com plasma de oxigênio (fluxo de gásO2 a 100 sccm, 50 s, 200 W de potência). Para mais detalhes sobre o processo de fabricação, consulte a publicação do nosso trabalhoanterior 12, 18, 19.
    2. Deposite uma camada de 50 nm de Cr sobre o arranjo de esferas encolhidas por evaporação por feixe de elétrons a 1,5 Å por s.
    3. Levante as esferas de poliestireno usando acetona para deixar uma máscara de Cr perfurada na superfície deSiO 2 .
    4. Grave a camada exposta deSiO 2 nas aberturas de Cr usando uma mistura de 25 sccm Ar, 25 sccm CHF3, com potência RIE a 200W por 2 minutos.
  3. Fabricar pirâmides invertidas
    1. Imerga a pastilha em KOH de 60% em peso a 60 °C por 2 minutos para gravar cavidades piramidais invertidas no silício.
    2. Remova a máscara de Cr usando um Cr entant por 5 minutos.
    3. Remova a camada deSiO 2 com um gravador de óxido tamponado 6:1 até que esteja totalmente limpo.
    4. Deposite um filme Au de 200 nm de forma conforme sobre as pirâmides invertidas usando evaporação por feixe de elétrons.
  4. Finalizar substrato plasmônico
    1. Aplique epóxi de cura rápida (~1 mL) em um substrato separado deSiO 2/Si. Pressione a pastilha revestida de ouro sobre o epóxi para formar uma estrutura sanduíche com a camada de ouro no centro.
    2. Descole o epóxi do molde de silício para formar um substrato Au plasmônico independente após a cura completa do epóxi.

3. Transferência de grafeno para substrato plasmônico

  1. Prepare filme de grafeno
    1. Prepare uma solução deFeCl 3 de 1 M (uma solução de 1 M de cloreto férrico anidro foi preparada dissolvendo 81 g deFeCl 3 em água desionizada e diluindo até um volume final de 500 mL) para gravar o substrato de cobre a partir de uma folha de grafeno monocamada revestida com PMMA.
    2. Coloque a chapa de cobre revestida com grafeno virada para baixo sobre a superfície da solução de FeCl3 até que o cobre esteja completamente dissolvido.
  2. Enxague filme de grafeno
    1. Usando uma lâmina de vidro limpa, transfira cuidadosamente o filme flutuante de grafeno para um banho-maria desionizado para enxaguar os resíduos de gravação.
    2. Repita essa etapa de enxágue três vezes.
  3. Transferir grafeno para o substrato
    1. Flutuar o substrato plasmônico SERS sob o filme de grafeno no banho-maria final de DI.
    2. Levante suavemente o substrato para assentar o grafeno uniformemente em sua superfície.
    3. Seque ao ar o substrato revestido de grafeno em temperatura ambiente por 1 h.
    4. Transfira para uma câmara a vácuo e seque sob pressão reduzida a 180 °C por 1 hora.
  4. Limpar o substrato final
    1. Mergulhe o substrato seco em um banho de acetona a 50 °C por 1 hora para dissolver o PMMA.
    2. Enxágue o substrato três vezes com álcool isopropílico.
    3. Seque o substrato plasmônico limpo e transferido com grafeno em um dessecador antes do uso.

4. Preparação de amostras de SERS e aquisição de espectros

  1. Preparar a amostra no substrato
    1. Pipete aproximadamente 5 μL da amostra de sEV sobre o substrato plasmônico apropriado.
      NOTA: Para quantificar sEVs carregados em medicamentos, aplique vesículas ao substrato de ouro e grafeno. Para todos os outros experimentos, use um substrato plasmônico dourado simples.
    2. Coloque o substrato em um dessecador e deixe a gota secar completamente (~15 min).
  2. Sistema Raman de calibração
    1. Transfira o substrato para um microscópio Raman confocal.
    2. Inicie a coleta de dados usando o software do instrumento (WiRE versão 4.4).
    3. Ajuste o laser de excitação para 785 nm em 5 mW.
    4. Calibre o sistema alinhando o pico de referência de silício a 520 cm-1.
  3. Adquirir espectros a partir de substrato de ouro (diagnóstico)
    1. Realize uma varredura de reconhecimento em uma área de 300 μm × 300 μm para localizar vesículas individuais usando o modo estático com as seguintes configurações: 50% de potência, exposição de 0,1 s, tamanho de passo de 10 μm.
    2. Após localizar os sEVs, realize mapeamento de alta resolução em modo estático dentro de uma grade de 5 × 5 usando as seguintes configurações: passo de 1 μm, 50% de potência, 0,2 s de exposição por ponto.
  4. Adquirir espectros a partir de substrato de grafeno (terapêuticos)
    1. Realize uma varredura de reconhecimento em uma área de 300 μm × 300 μm para localizar vesículas individuais usando modo estático com as seguintes configurações: 50% de potência do laser, exposição de 0,1 s, tamanho de passo de 10 μm.
    2. Realize mapeamento de alta resolução em modo estendido com uma grade de 2 × 2 usando as seguintes configurações: passo de 1 μm, potência de laser de 1%, exposição de 10 s.

5. Pré-processamento de dados

  1. Realizar controle espectral de qualidade
    1. Filtre os espectros brutos iniciais para excluir sinais altamente ruidosos ou espectros com formas anormais.
    2. Remova picos isolados de raios cósmicos usando detecção baseada em limiar ou filtragem por desvio local.
  2. Filtrar e normalizar espectros
    1. Aplique um filtro Savitzky-Golay a cada espectro para reduzir o fundo de fluorescência e suavizar os dados.
    2. Calcule a relação sinal-ruído (SNR) de cada espectro, normalmente usando o método de razão pico-linha de base ou desvio padrão. Para explicar melhor, normalmente o SNR para cada espectro era calculado como a razão entre a intensidade máxima (após a subtração da linha de base) em uma banda Raman representativa e o desvio padrão do ruído. O ruído foi estimado a partir do espectro residual obtido ao subtrair uma versão suavizada por Savitzky-Golay do espectro (tamanho da janela = 11, ordem polinomial = 3) do espectro original, isolando assim as flutuações de alta frequência. Para determinar empiricamente um limiar apropriado para SNR, todos os espectros foram classificados em ordem crescente de SNR, e a persistência de picos bioquímicos característicos – especificamente a banda da fenilalanina (~1002 cm-1 , aminoácido), a banda amida I (~1650 cm-1 , proteína) e a banda de deformaçãoCH-2 (~1440 cm-1 , lipídio) foi avaliada em todos os espectros classificados. O limiar foi estabelecido no ponto em que qualquer um desses picos diagnósticos desapareceu consistentemente no ruído de base. Para nosso substrato SERS de nanopirâmide de ouro e parâmetros de aquisição (excitação de 785 nm, potência de laser de 5 mW, integração de 0,2 s), isso correspondia empiricamente a um limiar de SNR de 28.
    3. Exclua quaisquer espectros que estejam abaixo do limiar SNR, conforme decidido de acordo com 5.2.2 acima. No nosso fluxo de trabalho, espectros com SNR abaixo de 28 foram excluídos do conjunto de dados de treinamento, já que definir o limiar nesse nível garante que apenas espectros de alta qualidade sejam mantidos para análise a jusante e melhoria da robustez do modelo.
    4. Normalize cada espectro para a intensidade máxima ou a área total sob a curva.

6. Análise espectral com aprendizado de máquina

  1. Treine o Modelo
    1. Atribua um rótulo a cada medição espectral correspondente à sua origem (por exemplo, paciente com câncer gástrico vs. controle saudável).
    2. Insira os dados espectrais em um Classificador de Vetores de Suporte (SVC) com um núcleo linear.
    3. Use um embaralhamento estratificado para validação cruzada de 5 vezes.
    4. Faça a média das métricas de precisão de cada dobra para avaliar o desempenho do modelo.
  2. Reduzir a dimensionalidade e classificar
    1. Use a Análise Discriminante Linear (LDA) para visualizar dados SERS de alta dimensão em dimensões reduzidas.
    2. Use o modelo LDA para classificação direta entre grupos de amostra.
  3. Avalie o Modelo
    1. Avalie os modelos treinados em um conjunto de amostras cegas de pacientes para simular um cenário diagnóstico do mundo real. Para mais informações, consulte estas publicações do nosso grupo13, 15 e 22.
      NOTA: Realize todos os passos com ferramentas limpas em um ambiente sem poeira. O grafeno monocamada foi cultivado ou extraído sobre um substrato de cobre e revestido com uma camada de PMMA para protegê-lo durante a transferência.

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Resultados

A implementação bem-sucedida do protocolo SERS de vesícula única gera espectros Raman distintos de cada sEVs, permitindo classificação diagnóstica posterior e monitoramento da carga terapêutica de medicamentos. A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho do estudo diagnóstico para câncer gástrico e da aplicação de monitoramento de sEVs carregada com medicamentos, usando nosso protocolo relatado aqui, respectivamente.

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Discussão

Um aspecto fundamental deste protocolo é a preparação do substrato e a purificação do sEV. O desempenho do SERS sem marcação depende fortemente da produção de substratos plasmônicos uniformes e de alta conformidade, com forte "ponto quente" de realço. Da mesma forma, o isolamento de sEV de alta pureza por meio de cromatografia de exclusão de tamanho é essencial para fornecer espectros SERS confiáveis e reprodutíveis. Impurezas como agregados proteicos ou lipoproteínas não apenas...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse relacionados a esta obra.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional para o Avanço das Ciências Translacionais dos Institutos Nacionais de Saúde sob os números de concessão 4UH3TR002978-03 e 1U18TR003778-01, e por uma bolsa do Instituto da Califórnia para Medicina Regenerativa (CIRM) (Número da Bolsa TRAN1-14649).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1x PBSThermo Fisher ScientificJ61196. AP
Grade de cobre de 300 malhasCiências da Microscopia EletrônicaEMS200-
Solução de paraformaldeído a 4%Sigma Aldrich1004960700
4″ Si wafers MSE SuppliesWA0810(100) orientado 
Linha celular A549ATCCCCL-185 
Linha celular de AGSATCCCRL-1739
Rotor da centrífuga F-35-6-30, 5430Eppendorf22654306
CHA Mark 40CHA Mark 40https://chaindustries.com/mark-40-system/Evaporação por feixe de e-feixe
Solução de cr etchantSigma Aldrich651826-500ML
Doxorubicina  D-4000Laboratórios LCD-4000_3g
Sistema ExoView R100 e ExoView Human Tetraspanin KitNanoView Bioscienceshttps://www.nowmedicalstudios.
com/portfolio/nanoview-
biosciences-3d-product-illustrations
Solução FeCl3Sigma Aldrich451649
Solução HFSigma Aldrich695068-500ML
Hs 738.St/Int linha celularATCCCRL-7869
Em Microscópio Raman confocal viaRenishawhttps://www.renishaw.com/en/
invia-confocal-raman-microscope
--6260?srsltid=AfmBOoqbZlyW
qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0
GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
Solução KOHSigma Aldrich417661
Shakers de bancada MaxQ 4000 para incubação/refrigeraçãoTermo CientíficaSHKA4000 (4320)
Incubadora MCO-19AICSANYO8380-30-0035
Filtro Millex-GPMilliporeSigmaSLGPM33RS  0,22 & micro; m
Microscópio NanoSEM 230FEISEM-FEI-014 
Nanosight NS300Malvern Panalyticalhttps://www.malvernpanalytical
.com/en/support/produto-suporte
/nanosight-range/nanosight-ns300
Linha celular NCI-N87ATCCCRL-5822
Optima TLX UltracentrífugaBeckman Coulter8043-30-1197
Oxford Plasmalab 80 PlusOxford Plasmalabhttps://plasma.oxinst.com/
Produtos/RIE/Plasmapro-800-RIE
Esferas de poliestirenoAlfa AesarAA42711AB500 milhas náuticas
qEVoriginal/35 nmIzonICO-35
Grafeno de camada únicaMSE SuppliesME0408
Frasco T-75VWR156800
TF20 EM de alta resoluçãoFEIhttps://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
Solução de acetato de uranilaCiências da Microscopia Eletrônica22400-1

Referências

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  10. Jeon, T. Y., Kim, D. J., Park, S. G., Kim, S. H., Kim, D. H. Nanostructured plasmonic substrates for use as SERS sensors. Nano Converg. 3, 1-10 (2016).
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Reimpressões e permissões

Etiquetas

Espectroscopia RamanPequenas Vesículas ExtracelularesIsolamento de sEVClassificação por Aprendizado de MáquinaSubstrato PlasmônicoMatriz de Nanopirâmides de OuroSubstrato de GrafenoCarregamento de Doxorrubicina
Explorando a Aplicação da Biosensição Baseada em Espalhamento Raman Aprimorado em Superfícies de SEVs individuais no diagnóstico e terapêuticas de doenças
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