Aqui, apresentamos um protocolo para examinar como o lncPVT1 regula a estabilidade do HIF-1α e a expressão gênica glicolítica em células de câncer de tireoide, permitindo o estudo da regulação metabólica e potenciais alvos terapêuticos.
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Artigo de investigação
Aqui, apresentamos um protocolo para examinar como o lncPVT1 regula a estabilidade do HIF-1α e a expressão gênica glicolítica em células de câncer de tireoide, permitindo o estudo da regulação metabólica e potenciais alvos terapêuticos.
Como o principal câncer do sistema endócrino, o carcinoma da tireoide exibe uma tendência epidemiológica acelerada em todas as populações. Apesar dos avanços nas modalidades de tratamento, a recorrência e a metástase continuam sendo desafios. O RNA longo não codificante PVT1 (lncPVT1) emergiu como um regulador oncogênico conservado em vários tipos de câncer, mas sua função específica no TC requer mais exploração. Nossa pesquisa se concentrou em examinar como o lncPVT1 afeta a glicólise em condições normóxicas e hipóxicas usando as linhas celulares TC TPC-1 e K1. A superexpressão de lncPVT1 aumentou significativamente o consumo de glicose e a produção de lactato sob hipóxia, corroborando sua capacidade de aumentar a glicólise. Além disso, o lncPVT1 regulou positivamente os principais genes glicolíticos , como GLUT1, HK1, HK2 e PGK1, e facilitou a proliferação de células TC. Mecanicamente, o lncPVT1 estabilizou o fator induzível por hipóxia 1α (HIF-1α), impedindo sua degradação e levando ao seu acúmulo. Este HIF-1α acumulado então se liga a sequências regulatórias específicas que controlam a expressão de genes envolvidos na glicólise, ativando esses genes e aumentando a atividade glicolítica. Nossos achados demonstram que o lncPVT1 regula a estabilidade do HIF-1α e a expressão gênica glicolítica, avançando nossa compreensão do metabolismo do TC e potencialmente revelando novos alvos terapêuticos.
O câncer de tireoide (CT), uma neoplasia endócrina altamente prevalente, tem experimentado um rápido aumento nas taxas de incidência1. Apesar dos avanços nas estratégias terapêuticas, incluindo procedimentos cirúrgicos, radioterapia e terapia de supressão hormonal da tireoide, uma proporção substancial de pacientes com CT ainda enfrenta o risco de recorrência tumoral e metástase, enfatizando a necessidade de uma compreensão mais profunda de sua patogênese molecular 2,3. O desenvolvimento de CT está associado a vários fatores de risco estabelecidos, incluindo exposição à radiação ionizante, contato com substâncias cancerígenas químicas, uso de tabaco e obesidade; no entanto, os intrincados mecanismos subjacentes permanecem indescritíveis4. Dada a compreensão limitada dos mecanismos moleculares do TC, tem sido dada atenção crescente aos RNAs não codificantes, especialmente os lncRNAs, por seus papéis regulatórios no câncer.
Evidências emergentes estabelecem lncRNAs como reguladores fundamentais de processos biológicos multifacetados, particularmente no desenvolvimento de tumores, por meio de mecanismos como splicing alternativo, regulação transcricional e esponja de microRNA (miRNA) 5,6,7. A translocação variante do plasmocitoma 1 (PVT1) está localizada a jusante do cromossomo 8q24.21 e do oncogene C-myc8. Entre estes, o lncPVT1, um lncRNA localizado a jusante do oncogene C-myc no cromossomo 8q24.21, atraiu atenção significativa por seus papéis oncogênicos em várias malignidades, incluindo câncer de fígado9 e carcinoma de células renais10. No entanto, as implicações funcionais do lncPVT1 no TC permanecem amplamente inexploradas.
As células cancerígenas sofrem reprogramação metabólica, uma característica fundamental da tumorigênese, onde exibem atividade glicolítica aumentada associada à diminuição da fosforilação oxidativa, ou seja, o efeito Warburg11. A hipóxia, característica microambiental comum em tumores sólidos, influencia profundamente o comportamento tumoral, promovendo glicólise e agressividade, e conferindo mau prognóstico12. O fator 1 induzível por hipóxia (HIF-1), um fator-chave que regula a reação da célula a baixos níveis de oxigênio, orquestra uma infinidade de mudanças adaptativas que suportam a sobrevivência e a progressão do tumor13. Estudos anteriores demonstraram que o lncPVT1 modula a glicólise em múltiplas neoplasias malignas, incluindo câncer de mama14, adenocarcinoma ductal pancreático15 e osteossarcoma16. Além disso, o lncPVT1 demonstrou aumentar a proliferação celular ao estabilizar o HIF-1α no carcinoma nasofaríngeo17. No entanto, a correlação entre a expressão de lncPVT1 e parâmetros clínicos não foi relatada no câncer. Além disso, a função e os mecanismos específicos ou as implicações clínicas únicas do lncPVT1 permanecem obscuros no CT. Portanto, o objetivo deste estudo foi explorar como o lncPVT1 influencia o metabolismo da glicose nas linhagens celulares TC TPC-1 e K1 expostas à normóxia e hipóxia. Examinamos o impacto da superexpressão de lncPVT1 no consumo de glicose, produção de lactato e proliferação celular. Além disso, deciframos os mecanismos de estabilização do HIF-1α governados por lncPVT1 e seus efeitos resultantes na programação transcricional relacionada à glicólise. Esta investigação abrangente oferece novas perspectivas sobre como o lncPVT1 contribui para a tumorigênese, particularmente no contexto da reprogramação metabólica e adaptação hipóxica.
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Cultura de células e transfecção
As linhagens celulares de carcinoma de tireoide humano (CT) TPC-1 e K1 foram cultivadas em meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco contendo 4,5 g/L de glicose, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina. As células foram mantidas a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. Para o tratamento da hipóxia, 1 x 105 células foram transferidas para uma câmara hipóxica selada equilibrada com 1% O2, 5% CO2 e 94% N2 a 37 ° C por 24 h, a menos que especificado de outra forma. A superexpressão estável de lncPVT1 (lncPVT1 OE) e o correspondente controle negativo (NC) foram gerados em células TPC-1 e K1 usando um sistema de expressão lentiviral, seguindo as instruções do fabricante.
Avaliação dos níveis de glicose
Para avaliar o consumo de glicose, linhagens celulares de carcinoma de tireoide foram cultivadas em condições normóxicas (21% O2) e hipóxicas (1% O2) por 24 h. As concentrações de glicose no meio de cultura foram medidas usando um kit de ensaio de glicose de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 2 μL de meio condicionado foram misturados com reagente de trabalho de glicose recém-preparado e incubados a 37 ° C por 10 min. A absorbância foi medida a 530 nm usando um leitor de microplacas para quantificar os níveis de glicose.
Avaliação dos níveis de lactato
As linhagens celulares de carcinoma de tireoide TPC-1 e K1 (2 x 104 células/poço) foram cultivadas em condições normóxicas (21% O2, 5% CO2, 37 °C) e hipóxicas (1% O2, 5% CO2, 37 °C) por 24 h. Após a incubação, as placas de cultura foram centrifugadas a 300 x g por 5 min em temperatura ambiente para pellet de células e detritos. Posteriormente, 2 μL do sobrenadante clarificado foram coletados de cada poço e misturados com 200 μL de reagente de ensaio de lactato em uma placa de 96 poços. A mistura de reação foi incubada a 37 ° C por 10 min, após o que uma solução de parada foi adicionada para encerrar a reação. A absorbância foi medida a 530 nm usando um leitor de microplacas. As concentrações de lactato foram determinadas comparando os valores de absorbância com uma curva padrão gerada a partir de padrões de lactato conhecidos (normalmente variando de 0 a 20 nmol). Todas as medidas foram realizadas em triplicata.
Ensaio de proliferação celular
As células do carcinoma de tireoide foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 3 x 103 células por poço em 100 μL de meio de cultura. As células foram então incubadas em condições normóxicas (21% O2, 5% CO2, 37 ° C) ou hipóxicas (1% O2, 5% CO2, 37 ° C) por 0 h, 24 h ou 48 h. Em cada ponto de tempo, 10 μL de reagente de proliferação celular foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços. A placa foi então incubada a 37 °C por 40 min. Após a incubação, a densidade óptica a 450 nm (OD450) foi medida usando um leitor de microplacas para quantificar a proliferação celular. Todas as medidas foram realizadas em pelo menos três repetições técnicas.
Análise de qRT-PCR
O RNA total foi extraído de 1 x 106 células de carcinoma de tireoide em condições normóxicas (21% O2, 5% CO2, 37 ° C) e hipóxicas (1% O2, 5% CO2, 37 ° C) usando um reagente de extração de tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio de acordo com o protocolo do fabricante. A pureza e a concentração do RNA foram avaliadas espectrofotometricamente medindo as razões de absorbância a 260/280 nm. Para a síntese de DNA complementar (cDNA), 500 ng de RNA total foram transcritos reversamente em um volume de reação de 20 μL contendo transcriptase reversa, primers hexâmeros aleatórios, dNTPs, inibidor de RNase e tampão de reação. A transcrição reversa foi realizada a 25 °C por 10 min, seguida de 42 °C por 50 min, e terminada por aquecimento a 70 °C por 15 min.
A PCR quantitativa foi realizada usando um sistema de detecção baseado em SYBR Green em um volume total de reação de 20 μL contendo molde de cDNA (diluição de 1:5 a 1:20 da síntese original de cDNA), master mix de PCR SYBR Green, primers diretos e reversos (cada um a 0,2 μM) e água livre de nuclease. A amplificação por PCR foi realizada em um termociclador com as seguintes condições de ciclagem: desnaturação inicial a 95 °C por 3 min; 40 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 15 s, recozimento a 60 °C durante 30 s e extensão a 72 °C durante 30 s; seguida de uma análise da curva de fusão para verificar a especificidade da amplificação.
As sequências de primers para GLUT1, HK1, HK2, PGK1 e GAPDH (Tabela 1) foram projetadas com base nas sequências publicadas18 e sintetizadas comercialmente. Os níveis de expressão dos genes-alvo foram normalizados para GAPDH e calculados usando o método 2-ΔΔCt 19.
Western blot
Após o tratamento, as células do carcinoma de tireoide foram lavadas 2x com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) e lisadas usando tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) suplementado com um coquetel de inibidores de protease. Os lisados celulares foram incubados em gelo por 30 min com mistura intermitente e depois centrifugados a 12.000 x g por 15 min a 4 °C para remover detritos insolúveis. A concentração de proteína do sobrenadante foi determinada usando um ensaio de ácido bicinconínico (BCA) de acordo com as instruções do fabricante. Quantidades iguais de proteína (30 μg por amostra) foram misturadas com tampão de carga 5x, fervidas a 95 ° C por 5 min e carregadas em géis de poliacrilamida SDS a 10% para separação eletroforética. As proteínas foram separadas por eletroforese a 120 V por aproximadamente 90 min e depois transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) usando um sistema de transferência úmida a 100 V por 90 min a 4 ° C. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween-20 (TBST) por 1 h em temperatura ambiente para evitar ligação inespecífica. Posteriormente, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários diluídos em tampão de bloqueio: anticorpo anti-HIF-1α (1:3.000) e anticorpo anti-beta-actina (1:8.000). Após lavagem 3x com TBST (cada uma por 10 min), as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano apropriados diluídos 1:5.000 em tampão de bloqueio por 1 h à temperatura ambiente. Após três lavagens adicionais de TBST, as bandas de proteína foram visualizadas usando um sistema de detecção de quimioluminescência aprimorada (ECL) e imagens com um sistema de documentação de gel.
Ensaio de luciferase dupla
Para investigar a regulação transcricional de genes relacionados à glicólise por lncPVT1, as células TPC-1 foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 1 x10,5 células por poço e cultivadas em DMEM contendo 4,5 g/L de glicose, suplementadas com 10% de soro fetal bovino e 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina durante a noite. As células foram cotransfectadas com 500 ng de um plasmídeo repórter de luciferase de vaga-lume acionado por elemento de resposta à hipóxia (HRE) e 50 ng de plasmídeo de controle de luciferase Renilla usando um reagente de transfecção à base de lipídios a uma concentração final de 2 μL por poço, de acordo com as instruções do fabricante. A eficiência da transfecção foi confirmada pela inclusão de uma transfecção paralela com um plasmídeo que expressa GFP e pela avaliação da expressão de GFP em um microscópio de fluorescência 24 h após a transfecção. Após 24 h de incubação em condições normóxicas (21% O2) ou hipóxicas (1% O2), as atividades da luciferase foram medidas usando um sistema de ensaio repórter de luciferase dupla. A atividade da luciferase do vaga-lume foi normalizada para a atividade da luciferase de Renilla, e a razão foi usada para análise comparativa entre as amostras.
Análise de dados
Todos os dados foram apresentados como média ± DP. As avaliações estatísticas foram executadas em software de análise estatística. As comparações entre os grupos foram realizadas por meio de testes t independentes, e a significância estatística foi determinada com base em um limiar de valor de p menor que 0,05.
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Glicólise aprimorada em linhagens celulares TC mediada por lncPVT1
Inicialmente, estabelecemos lncPVT1 OE e NC em células TPC-1 e K1 usando um sistema de expressão lentiviral. A superexpressão bem-sucedida de lncPVT1 foi confirmada por qRT-PCR (Figura 1A-B). Para avaliar o impacto na glicólise, as células foram cultivadas sob normóxia e hipóxia por 24 h. Nossos acha...
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Como a malignidade endócrina mais comum, a CT apresenta desafios significativos em termos de sua recorrência e metástase22. O cenário mecanicista da carcinogênese tireoidiana permanece incompletamente definido, especialmente em relação à regulação mediada por lncRNA da reprogramação metabólica oncogênica e comportamentos celulares fundamentais23 . Neste estudo, focamos no oncogênico lncPVT1 e sua influência na glicólise e na estabilidade do...
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Os autores afirmam não haver conflitos de interesse, sejam financeiros ou não financeiros.
O financiamento da pesquisa foi fornecido por meio do Projeto do Plano de Ciência e Tecnologia de Fujian (2022J01784).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de ensaio de proteína BCA | meilunbio | MA0082-2 | Ensaio de quantificação de proteína WB |
| Gabinete de Biossegurança | Lishen | HFsafe-1200LC | Passagem e expansão celular |
| Centrifuga | Baiyang | B320A | Células de centrífuga |
| Sistema de imagem por quimioluminescência | BIO-RAD (EUA) | Toque ChemiDoc | Desenvolvimento WB |
| Incubadora de CO2 | Thermo (EUA) | 311 | Cultura de células |
| Kit de detecção de quimioluminescência ECL | meilunbio | MA0186-1 | Desenvolvimento WB |
| Citômetro de fluxo | BD | FACSCalbur | Ensaio de apoptose por citometria de fluxo |
| Microscópio invertido de fluorescência | NIKON(Japão) | Ts2-FL | Observação de células |
| Instrumento de PCR quantitativo de fluorescência | ABI (EUA) | 7300 | Experiência de PCR |
| GAPDH | ProteinTech | 60004-1-IG | Anticorpo de referência interno WB |
| Kit de Ensaio de Glicose | Jiancheng | A154-1-1 | Ensaio Bioquímico |
| HIF1A | BOSTER | A00013 | WB Anticorpo |
| IgG anti-rato de cabra affinipure conjugada com HRP (H + L) | ProteinTech | SA00001-1 | Experimento de imuno-histoquímica (IHQ) |
| IgG anti-coelho de cabra affinipura conjugada com HRP (H + L) | ProteinTech | SA00001-2 | Experimento de imuno-histoquímica (IHQ) |
| Linha celular K1 | Banco de Células da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China) | NA | Linha celular de carcinoma papilífero de tireoide humano |
| Kit de Ensaio de Ácido Láctico | Jiancheng | A019-2-1 | Ensaio Bioquímico |
| Leitor de microplacas | Thermo (EUA) | K3 | Detecção ELISA |
| Kit de preparação ultrarrápida PAGE Gel (15%) | meilunbio | MA0384 | Eletroforese WB |
| Instrumento de PCR | BIO-RAD (EUA) | PTC100 | Experiência de PCR |
| Marcador de proteína arco-íris pré-corado | meilunbio | MA0342 | Eletroforese WB |
| Sistema de eletroforese vertical de proteínas | BIO-RAD (EUA) | PODER PAC 200 | Eletroforese WB |
| Tampão de carregamento de proteína SDS-PAGE (5X) | Beyotime | Pág. 0015L | Eletroforese WB |
| Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) | sigma | 151-21-3 | Eletroforese WB |
| Linha celular TPC-1 | Banco de Células da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China) | NA | Linha celular de carcinoma de tireoide humano |
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