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Artigo de método

Terapia de Eletroacupuntura para Prejuízo Cognitivo após Lesão da Medula Espinhal

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DOI:

10.3791/69346

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21 de novembro de 2025

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1School of Acupuncture, Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Rehabilitation, The Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, 3Department of Rehabilitation, Jiangsu Changshu Second People's Hospital, 4Traditional Chinese Medicine Department, Shenzhen Third People's Hospital, Southern University of Science and Technology

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo estabeleceu um procedimento padronizado de eletroacupuntura voltado para tratar défices cognitivos após lesão medular. Além disso, o protocolo para realizar o labirinto Y e experimentos inovadores de reconhecimento de objetos para avaliar a eficácia da eletroacupuntura na redução de déficits cognitivos foi descrito em detalhes.

Resumo

A lesão medular (LME) é uma doença altamente incapacitante e destrutiva do sistema nervoso central (SNC), que não apenas leva à disfunção motora e sensorial dos membros, mas também prejudica a estrutura e a função do hipocampo e do córtex, levando a comprometimento cognitivo, que afeta seriamente a qualidade de vida dos pacientes. Portanto, é fundamental explorar abordagens de tratamento eficazes e métodos de avaliação. A eletroacupuntura (EA) é uma terapia inovadora que integra a acupuntura tradicional com a tecnologia contemporânea de eletroterapia, que possui vantagens de alta segurança e poucos efeitos colaterais, e tem sido amplamente utilizada no manejo das LME. De acordo com a teoria da medicina tradicional chinesa (MTC), o Vaso Governador conecta o cérebro à medula espinhal. Portanto, a AA nos pontos de acucidade localizados no Vaso Governador pode restaurar efetivamente as funções do cérebro e da medula espinhal. Neste protocolo, empregamos o método de Allen para construir o modelo SCI. Introduzimos um procedimento de EA voltado para tratar défices cognitivos em ratos com LME. Além disso, descrevemos em detalhes o processo operacional do labirinto Y e do experimento de reconhecimento de objetos novos (NOR) para avaliar a eficácia da EA na amenização de déficits cognitivos em ratos. Esta pesquisa não apenas fornece um protocolo de tratamento que serve como referência para o comprometimento cognitivo após LME, mas também oferece suporte experimental preliminar para a validação de estratégias terapêuticas para essa condição e subsequente exploração de pesquisas.

Introdução

A lesão medular (LME) é um distúrbio comum do sistema nervoso central (SNC), tipicamente resultante de danos à medula espinhal ou às suas estruturas ao redor devido a forças externas. Essa condição pode levar a disfunção sensorial, motora e nervosa autonômica abaixo do nível1 da lesão. Mais criticamente, a LME também pode induzir complicações secundárias como ansiedade, depressão e comprometimentocognitivo 2,3, que são prejudiciais à reabilitação dos pacientes e diminuem significativamente sua qualidade de vida. Diversos estudos epidemiológicos descobriram que o risco de doença de Alzheimer (DA) em pacientes com LM é consideravelmente maior do que na populaçãogeral 4,5,6. Outro estudo confirmou que a incidência de comprometimento cognitivo em pacientes com LM pode chegar a 60%5,7. A LME não apenas leva à atrofia do córtex motor, mas também reduz a atividade neural nas regiões cerebrais associadas à funçãocognitiva 8. O aumento da inflamação no hipocampo, tálamo e córtex após a LME é considerado um contribuinte significativo para o comprometimentocognitivo 9,10,11. Melhorar complicações relacionadas à LME, como o comprometimento cognitivo, é fundamental para aprimorar a reabilitação dos pacientes e facilitar sua reintegração à sociedade.

A acupuntura é um componente significativo da medicina tradicional chinesa (MTC), reconhecida por sua notável eficácia clínica. A eletroacupuntura (EA) representa uma terapia inovadora que integra a acupuntura tradicional com técnicas contemporâneas de eletroterapia12. Estimula nervos e músculos aplicando corrente de baixa voltagem a pontos específicos de acupunctura, oferecendo benefícios terapêuticos para a recuperação funcional após dor crônica e lesões do sistemanervoso 13,14,15. Diversos estudos demonstraram que a EA pode promover a recuperação funcional neurológica após LME e mitigar complicações como dor neuropática, bexiga neurogênica e espasticidade 16,17,18,19. De acordo com a teoria da MTC, o Vaso Governador está conectado ao cérebro e à medula espinhal, influenciando suasfunções 20. Descobrimos que a EA aplicada nos pontos de acupuntura Dazhui (GV14) e Mingmen (GV4) no Vaso Governador pode aliviar a neuroinflamação e inibir a formação de cicatrizes gliais, facilitando assim a recuperação da função motora após a LM21. Além disso, nossas investigações estabeleceram que a AA nos pontos de acupuntura Baihui (GV20) e Yintang (GV29) no Vaso Governador pode aprimorar as habilidades cognitivas em camundongos modelode Alzheimer 22,23. No entanto, o potencial da EA para tratar o comprometimento cognitivo após LME ainda não foi suficientemente explorado.

Neste estudo, descrevemos os métodos operacionais da AA para tratar o comprometimento cognitivo em ratos com LME, abrangendo seleção de pontos de acupuntura, ângulo da acupuntura, duração do tratamento e outros detalhes. Além disso, utilizamos os testes Y-maze e NOR, juntamente com avaliações patológicas, para avaliar a eficácia da EA no tratamento do comprometimento cognitivo. Este estudo tem como objetivo fornecer uma referência para o tratamento clínico dessa condição.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram realizados em estrita conformidade com as Diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (ID de aprovação: BUCM-2024042505-2065).

1. Preparação animal

  1. Selecionem ratos machos adultos Sprague Dawley (SD) pesando 220,0 g ± 20,0 g para o experimento.
  2. Abrigue os animais no Centro Experimental de Animais da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim a temperatura controlada (24 ± 2 °C) e sob um ciclo de 12 horas de escuro/luz, com água potável estéril e uma dieta padrão de pellets disponível ad libitum.
  3. Aclimate todos os animais ao ambiente por 7 dias antes da experimentação.
  4. Divida aleatoriamente 24 ratos SD em três grupos (n = 8 por grupo): o grupo de simulação de operação (Sham), o grupo do modelo de LM (Modelo) e o grupo da eletroacupuntura (EA). O diagrama do eixo temporal do desenho experimental está ilustrado na Figura 1.

2. Estabelecimento do modelo SCI

NOTA: Os ratos foram privados de água e alimento por 8 horas antes da operação, e os instrumentos cirúrgicos foram esterilizados com vapor de alta temperatura. O modelo SCI foi construído usando uma modificação do método24 de Allen.

  1. Coloque o rato na caixa de indução de anestesia e induza-o com oxigênio contendo 4% de isoflurano (1 L/min) até que ele esteja completamente anestesiado.
  2. Retire o rato da caixa de indução e posicione seu nariz e boca na máscara anestésica. Ajuste a concentração de isoflurano para 1,5%-2% para manter a anestesia.
    NOTA: Durante o processo de anestesia do rato, é fundamental monitorar de perto a condição do rato. Se o rato apresentar respiração superficial e rápida ou queda na temperatura corporal, reduza a concentração de isoflurano para evitar anestesia excessiva.
  3. Raspe o pelo das costas do rato para expor totalmente a área cirúrgica. Esterilize a área de operação com iodóforo e álcool.
  4. Localize a décima vértebra torácica (T10). Crie uma incisão longitudinal mediana de 2,5 cm centrada no T10.
  5. Use lâminas cirúrgicas para separar os músculos das costas, expondo o processo espinhoso e os músculos adjacentes às vértebras torácicas. Remova o processo espinhoso e a lâmina da T10 com pinças hemostáticas, expondo aproximadamente um segmento de 10 mm da medula espinhal.
  6. Impacte a dura-máter exposta (200 quilodina) com precisão usando um dispositivo de Allen modificado para induzir contusão moderada.
    NOTA: O sucesso do modelo LM é marcado pela congestão e edema da dura-máter no local da lesão e pelo balanço do espasmo da cauda. No grupo Sham, os ratos passaram pelo mesmo procedimento cirúrgico, incluindo a remoção da lâmina vertebral, mas a medula espinhal não foi danificada.
  7. Cubra a dura-máter com uma esponja de gelatina e suture a ferida camada por camada.
  8. Coloque o rato em uma almofada térmica de temperatura constante ajustada para 37 °C e monitore-o até que ele recupere a consciência.
  9. Administre injeção de penicilina sódica no músculo do rato uma vez ao dia durante três dias após a cirurgia para prevenir infecção. Além disso, faça massagem na bexiga do rato 2-3 vezes ao dia para facilitar a micção.

3. Tratamento de EA

  1. Realize a intervenção de EA 24 horas após estabelecer com sucesso o modelo de LME.
  2. Prepare agulhas descartáveis estéreis para acupuntura (diâmetro: 0,30 mm; comprimento: 25 mm).
  3. De acordo com a teoria da MTC e a experiência clínica, selecione-se os pontos de acupuntura Baihui (GV20), Dazhui (GV14) e Mingmen (GV4) para tratamento do EA.
  4. Prepare meias de seda preta. Guie o rato para furar as meias pretas. Amarre e fixar o rato em uma tábua usando uma amarração.
    NOTA: A corda deve ser apertada moderadamente para evitar asfixia do rato devido a amarração excessivamente apertada ou fuga devido a amarração excessivamente solta.
  5. Localize o ponto de acupuntura GV20 no centro do osso parietal, na interseção da linha média da testa e o ponto médio da linha que conecta as duas pontas das orelhas. Localize a GV14 entre a sétima vértebra cervical (C7) e a primeira vértebra torácica (T1), na linha mediana das costas. Localize GV4 na depressão sob o processo espinhoso da segunda vértebra lombar (L2), na linha mediana das costas (Figura 2).
  6. Desinfete os pontos de acucidade com iodóforo medicinal e álcool medicinal 75%.
  7. Insira as agulhas obliquamente para baixo em um ângulo de 15° a uma profundidade de 2-3 mm no GV20. Insira as agulhas nos pontos GV14 e GV4 em um ângulo de 45°, com profundidade de 5-7 mm (Figura 3A).
  8. Conecte as agulhas ao aparelho terapêutico de EA em frequência de 2 Hz e intensidade de 1 mA. Selecione a forma de onda como uma onda contínua (Figuras 3B, C).
    NOTA: Esta intervenção de EA foi realizada diariamente por 28 dias, com cada sessão durando 20 minutos. Ratos dos grupos Sham e Model não receberam tratamento, mas ficaram imobilizados por 20 minutos por dia da mesma forma que os do grupo EA.

4. Avaliação da função motora (Figura 4)

NOTA: Nos1º,7º, 14º, 21º e28º dias após a operação, a função motora dos ratos de cada grupo foi avaliada pelo escore de Basso, Beattie e Bresnahan (BBB).

  1. Coloque o rato em um local aberto e silencioso para permitir a livre circulação.
  2. Observe os movimentos dos membros posteriores do rato e os avalie de acordo com a escalaestabelecida 25.
    NOTA: Dois pesquisadores, que não perceberam o agrupamento dos ratos, atribuíram escores de forma independente, e a pontuação final para cada rato foi calculada como a média de suas avaliações.

5. Realização do experimento do labirinto em Y (Figura 5)

NOTA: No primeiro dia após a intervenção do EA (29º dia do experimento), foi realizado o experimento do Labirinto em Y, incluindo um teste de alternância espontânea e um novo teste de exploração do braço. O procedimento experimental do labirinto em Y é mostrado na Figura 5A.

  1. Coloque as gaiolas experimentais no ambiente experimental antes do teste e se aclimate por 30 minutos.
  2. Limpe o dispositivo do labirinto em Y com álcool e configure aleatoriamente os três braços do labirinto em Y como braço inicial, o braço romance e o outro braço.
  3. Durante a fase de teste de alternância espontânea, cubra o novo braço com um defletores.
  4. Coloque o rato suavemente na ponta do braço inicial e deixe que ele explore livremente em ambos os braços por 10 minutos. Registre os tempos, a distância e o tempo de residência do rato entrando no braço inicial e no outro braço.
  5. Remova quaisquer excrementos na câmara após cada rato concluir o teste. Limpe o interior da câmara com álcool medicinal 75% e seque com gaze limpa para evitar interferências de odores deixados por sujeitos anteriores. Mantenha o ambiente interno silencioso durante todo o experimento.
  6. Remova o defletor e realize o novo experimento de exploração do braço 4 horas após o experimento de alternância espontânea.
  7. Coloque o rato suavemente na ponta do braço inicial e deixe-o explorar livremente nos três braços por 5 minutos.
  8. Registre a sequência, número de entradas, distância e tempo de residência do rato entrando em cada braço em até 5 minutos.

6. Conduzir o novo experimento de reconhecimento de objetos (NOR) (Figura 6)

NOTA: No segundo dia após a intervenção do EA (o30º dia do experimento), o experimento NOR foi realizado. O procedimento experimental de NOR é mostrado na Figura 6A.

  1. Prepare um setup experimental consistindo em uma caixa medindo 70 cm × 60 cm × 30 cm, objetos cúbicos azuis e objetos cilíndricos vermelhos.
  2. Introduza o rato na caixa experimental e deixe que ele explore livremente o ambiente por 10 minutos.
  3. Após o experimento acima ser concluído por 1 hora, posicione-se dois objetos cúbicos idênticos simetricamente em dois cantos da caixa experimental, posicionados aproximadamente 10 cm das paredes.
  4. Introduza o rato na caixa experimental com a cabeça orientada para longe do bloco do objeto. Permita que o rato explore livremente o ambiente por 10 minutos para se familiarizar com o bloco de objetos.
  5. Após a conclusão do teste de cada rato, limpe cuidadosamente a caixa experimental com álcool para minimizar o impacto dos odores residuais no comportamento dos ratos subsequentes. Quando a caixa estiver seca, coloque o próximo rato dentro.
  6. Após o experimento acima ser concluído por 4 horas, substitua o bloco de objeto direito por um objeto cilíndrico.
  7. Reintroduza o rato na caixa experimental com a cabeça voltada para longe da parede do bloco do objeto. Deixe o rato explorar livremente por 5 minutos na caixa.
  8. Registre o tempo gasto explorando os objetos cilíndricos e cúbicos e a distância e tempo totales. Calcule o índice de preferência usando a fórmula: (Tempo de Exploração de Novos Objetos - Tempo de Exploração de Objetos Antigos)/(Tempo de Exploração de Novos Objetos + Tempo de Exploração de Objetos Antigos) × 100%.

7. Realização do teste de preferência de sacarose

NOTA: A habitação de gaiola única é utilizada para evitar a competição social por água, o que pode confundir o comportamento de bebida.

  1. Prepare uma garrafa com solução de sacarose a 1% e outra com água da torneira.
  2. Coloque a solução de açúcar e as garrafas de água da torneira dentro da gaiola, garantindo que as posições estejam trocadas a cada 12 horas.
  3. Deixe o rato se adaptar à água açucarada e à água da torneira por um período de 48 horas. Subsequentemente, prive o rato de água potável por 24 horas sem jejuar.
  4. Coloque uma garrafa de água com açúcar e outra de água da torneira de volta na gaiola. Mude as posições das garrafas após 2 horas e registre o consumo de cada líquido em um período de 4 horas. Calcule a porcentagem de preferência de sacarose usando a fórmula: (ingestão de solução de sacarose/(ingestão de solução + ingestão de água) × 100%.

8. Coloração HE do hipocampo

  1. Após o teste comportamental, anestesie o rato com 3% de fenobarbital sódico (2,0 mL/kg). Realize perfusão cardíaca usando paraformaldeído. Pegue o tecido cerebral e o coloque em parafina. Prepare fatias com espessura de 5 μm.
    ATENÇÃO: O paraformaldeído é um irritante e deve ser manuseado em um ambiente bem ventilado.
  2. Desparafinize as fatias com xileno (I) e xileno (II) por 10 minutos sucessivamente. Deixe as fatias de molho em álcool gradiente para desidratação, com cada gradiente durando 3 minutos. Por fim, mergulhe as fatias em água destilada por 2 minutos.
  3. Tinga as fatias com solução de hematoxilina por 10 minutos. Enxágue o excesso de solução com água por 1 a 3 minutos. Imerga rapidamente as lâminas em etanol de ácido muriático por 5 a 10 segundos. Enxágue o escorregador com água novamente.
  4. Transfira as fatias para uma solução aquosa alcalina fraca para retorno azul. Enxágue as fatias com água por 1 a 3 minutos. Mergulhe as fatias em etanol 85% por 3 a 5 minutos.
  5. Tinga as fatias com solução de eosina por 3-5 minutos, desidrate com álcool gradiente após lavar. Coloque as fatias em xileno por 5 a 10 minutos. Por fim, use resina neutra para selar as fatias.
  6. Examine as lâminas tingidas sob um microscópio óptico com ampliação de 400×.

9. Análise ELISA

  1. Após o teste comportamental, eutanasia o rato com injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (200 mg/kg). Colhe os tecidos do hipocampo.
  2. Pese o tecido do hipocampo e transfira-o para um tubo de homogeneização pré-resfriado.
  3. Homogeneize os tecidos no gelo usando um homogeneizador de tecidos.
  4. Centrifuge o homogeneado a 5000 × g por 10 minutos a 4 °C. Colete o sobrenadante e determine a concentração total de proteína.
  5. Determine a concentração de IL-1β e IL-6 no hipocampo usando kits ELISA.

10. Análise estatística

  1. Use um software de análise estatística adequado para análise estatística. Expresse os dados como média ± desvio padrão.
  2. Realize análise bidirecional da variância (ANOVA) com medidas repetidas e teste de diferença mínima significativa (LSD) para dissecar diferenças entre grupos nos dados de escores do BBB.
  3. Realize ANOVA unidirecional com o método LSD para comparar a variabilidade entre grupos em outros ensaios quando os dados estavam normalmente distribuídos ou apresentavam variância homogênea. Caso contrário, realize o teste não paramétrico.
  4. Se os dados estiverem de acordo com uma distribuição normal, realize uma análise de correlação de Pearson. Caso contrário, realize uma análise de correlação de Spearman.
  5. Considere diferenças estatisticamente significativas quando P < 0,05.

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Resultados

A EA melhora a função motora dos ratos SCI
No1º dia após a operação do SCI, as pontuações BBB do grupo Modelo foram registradas em 0, indicando o estabelecimento bem-sucedido do modelo SCI. Durante os dias1º,7º,14º,21º e 28º dias após a operação, as pontuações BBB do grupo Modelo foram significativamente menores do que as do grupo Sham (P < 0,01). Notavelmente, nos7º,14º e...

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Discussão

A LME é um evento estressante que causa traumas severos à fisiologia e psicologia dos pacientes, levando não apenas a disfunções motoras e sensoriais, mas também ao comprometimentocognitivo 3. Conformerelatado 4, o risco de declínio cognitivo após LME é 13 vezes maior do que em indivíduos saudáveis. Pacientes de meia-idade e idosos com LM apresentam maior suscetibilidade à DA em comparação com seus pares que não apresentaram LM

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Divulgações

Todos os autores declararam que não há conflitos potenciais de interesse.

Agradecimentos

Essa pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 82374593, 82305381), pelo Fundo de Construção de Hospitais de Alto Nível de Shenzhen (nº 24275G1001), pelo Projeto Apoiado do Plano de Ciência e Tecnologia Médica e da Saúde de Changshu (Nº CSWSQ202302), e o Projeto Independente de Pesquisa de Pós-Graduandos na Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (nº ZJKT2025016).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,9% de soro fisiológicoBeijing suolaibao technology Co., Ltd.IN9000, P1022-10
4% de paraformaldeídoBeyotimeP0099
75% álcool medicinal, iodóforoBeijing oubei biology science and technology Co., LtdOB40126-1, HX0098AUsado para desinfecção
Agulhas de acupunturaZhongyan Taihe Co., LtdZY500
Máquina anestésica para pequenos animaisShanghai Yuyan Instruments Co., LtdABM
Sistema de análise do comportamento animalBeijing zhong Shi di Chuang technology Co., LtdZS-XWT-II
Máquina centrífugaEppendorf, Alemanha5811FR080384
Dispositivo de eletroacupunturaShantou Medical Instrument Factory Co., Ltd6805-DUsados  para tratamento com eletroacupuntura
Kits ELISAJianglai Biology Science and Technology Co., LtdJL18365, JL20896Usado para detectar níveis de IL-1 e IL-6
Esponja de gelatinaJiangxi Xiang'en Medical Technology Development Co., Ltd24092901
Solução de hematoxilina, solução de eosinaSigma-Aldrich03971Usado para coloração HE
Impactador de Horizonte InfinitoLexington, KY, Estados UnidosIH-0400Usado para construir um modelo de lesão da medula espinhal
IsofluranoShenzhen Ruiwode Life Science and Technology Co., LtdR510-22-10
MicroscópioOLIMPO
Penicilina sódicaCoolaberCP8271-5g
Fenobarbital SódicoSigma-AldrichP3761
Ratos SDSibeifu (Pequim) Biology Technology Co., LtdSCXK2019-0010
SPSSIBMVersão 26.0Software estatístico
SacaroseBeijing Solarbio Technology Co., LtdS8271
XilenoShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdX112050

Referências

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