Amyloide e a Arquitetura Cross-Beta

Resumo

As fibrilas amiloides são formadas por diversas proteínas, e as fibrilas resultantes compartilham uma estrutura de "β cruzados". Aqui descrevemos como amostras de fibrila amiloide podem ser preparadas para a difração de fibras de raios X e como os padrões podem ser analisados.

Resumo

As fibrilas amiloides são compostas por uma proteína mal dobrada e auto-montada, organizada em uma estrutura bem definida e repetitiva. Eles são bem conhecidos por seu papel importante em doenças de dobramento inadequado de proteínas, incluindo a doença de Alzheimer e o diabetes tipo 2, nos quais fibrilas amiloides insolúveis são depositadas nos tecidos. Além disso, foi constatado que desempenham um papel funcional importante em muitos organismos, proporcionando força, andaimes e proteção. Os primeiros modelos estruturais do amiloide foram informados pela coleta de dados de difração de fibras de raios X a partir de feixes de fibrilas amiloides alinhadas. Isso resultou em modelos iniciais da estrutura genérica de β cruzada, que foi substituída por análises de difração mais detalhadas de amostras altamente orientadas e semicristalinas, resultando em detalhes da organização dos peptídeos em uma arquitetura repetitiva. Aqui, focamos em descrever métodos para determinar a arquitetura subjacente dessas fibrilas, e descrevemos as características comuns das fibrilas amiloides provenientes de diversas fontes patogênicas, funcionais e sintéticas. Descrevemos a preparação das amostras, a coleta de dados e a subsequente análise dos dados para produzir uma estrutura de modelo que possa ser comparada com os dados experimentais.

Introdução

Fibrilas amiloides foram identificadas pela primeira vez dentro de um grupo de doenças conhecidas como amiloidoses, nas quais fibrilas proteicas se acumulam nos espaços extracelulares dos^{tecidos 1}. Cada doença é caracterizada por uma proteína precursora particular que sofre uma alteração conformacional para formar fibrilas proteicas altamente ordenadas^{e estáveis 2,3}. A definição mais recente de fibrillas amiloides agora incorpora fibrilas que se acumulam no ambiente celular. Mais recentemente, vários sistemas funcionais foram identificados que utilizam a estrutura amiloide para fornecer estabilidade, adesão ou até armazenamento de informações. Apesar da grande variedade de estruturas proteicas que podem se auto-montar para formar fibrilas amiloides, todas compartilham uma estrutura β^{cruzada 4}. Esse arranjo de β cruzado foi descrito pela primeira vez por Astbury para clara de ovo de galinha⁵ e posteriormente explicado por Geddes para β cruzado de^{seda 6}. Nessa arquitetura proteica, as fibrilas são compostas por β-fias que correm perpendicularmente ao eixo da fibrila, que são então organizadas em β-folhas que se associam pelas cadeias laterais para formar o que mais tarde foi chamado de zíperes^{estéricos 7}. Isso cria uma organização altamente estável mantida unida por ligações de hidrogênio que correm paralelas à fibra, junto com interações hidrofóbicas, eletrostáticas e polares por meio das cadeias^{laterais 8}.

Estudos estruturais iniciais usaram difração de fibras de raios X para investigar a estrutura das fibrilas amiloides, onde as fibrilas foram alinhadas e orientadas para formar um feixe de fibrilas amiloides que podiam ser colocadas no feixe de raios X de um difrattômetro ^9,10. Uma estrutura genérica de fibrilas amiloides foi gerada para se adequar aos padrões de difração de várias fibrilas amiloides extraídas de tecidos humanos de doenças ou cultivadas in^{vitro 4,} e isso forneceu base para descrições estruturais^{adicionais 11}. Nos últimos anos, avanços na ressonância magnética nuclear em estado sólido (ssNMR), cristalografia de raios X em microcristais e microscopia eletrônica criogênica (CryoEM) forneceram detalhes atômicos para a estrutura de β^{cruzada 11}. No entanto, o método de difração de fibras de raios X continua sendo importante e útil, e fornece informações sobre a organização repetitiva das proteínas. Além disso, em alguns casos, informações relacionadas a uma ordem de longo prazo podem ser acessíveis. Fundamentalmente, a difração de fibras de raios X é frequentemente usada para confirmar a presença de fibrilas amiloides formadas a partir de diferentes proteínas, e o padrão de β cruzada é um dos principais requisitos para que uma montagem fibrosa seja classificada como^{amiloide 12}.

Aqui, descrevemos a metodologia usada para preparar fibrilas amiloides e as alinhamos para a coleta de dados de difração de fibras de raios X. Além disso, fornecemos detalhes de como os dados de difração podem ser analisados para gerar uma estrutura de modelo, seu padrão de difração previsto e comparados com dados de difração de fibrilas derivadas ex vivo.

Protocolo

1. Preparação de amostras fibrilares para difração de fibras de raios X

1. Dissolva proteína ou peptídeo de interesse em condições ideais para a formação de fibrilas do peptídeo amiloidogênico selecionado e avalie a formação de fibrilas usando microscopia eletrônica ou microscopia de força atômica. Detalhes sobre como preparar amostras e realizar imagens estão disponíveis em outro^{lugar 13}. Certifique-se de que as fibrilas sejam longas, retas e sem ramificação, como mostrado na Figura 1. Por exemplo, as fibrilas mostradas na Figura 1 foram fotografadas usando microscopia eletrônica de transmissão (MET). Coloque uma gota contendo fibrilas em uma grade de microscópio eletrônico e depois faça uma coloração negativa usando acetato de^{uranila 14}.
   NOTA: Uma cobertura e distribuição uniformes das fibrilas na grade é desejável.
2. Alinhe-se para produzir um feixe de fibrilas cujos eixos fibrados são idealmente todos paralelos (Figura 2A).
   1. Derreta a cera de vela até que fique líquida usando uma placa quente. Usando um cortador de vidro, como uma caneta de diamante, corte capilares de vidro de borosilicato de 1 mm com cerca de 2-3 cm de comprimento e mergulhe-os brevemente na cera líquida. Puxe a cera de vela para cima por ação capilar (aproximadamente 1-2 mm de comprimento dentro do capilar). Certifique-se de que a superfície de cera esteja plana para que a suspensão da fibrila possa descansar de forma uniforme.
   2. Use plasticina para fixar os capilares selados horizontalmente em uma placa de Petri com um espaço de 0,5 mm a 2 mm entre as extremidades preenchidas com cera (Figura 2A).
   3. Usando uma pipeta, suspenda cuidadosamente uma gota de solução de 10 μL entre as extremidades preenchidas com cera dos dois capilares. Certifique-se de que a solução entre as extremidades da cera, mas não se estenda até o vidro.
   4. Proteja a amostra da poeira cobrindo a placa de Petri. Deixe a amostra evaporar durante a noite, resultando no alinhamento das fibrilas (veja a Figura 2A).
      NOTA: Pode levar vários dias para a amostra secar completamente, e isso dependerá da temperatura e umidade ambiente, além da viscosidade da amostra.
   5. Vedar a placa; Incube em temperaturas mais baixas em uma geladeira ou incube usando umidade em uma caixa lacrada para retardar a secagem, o que pode resultar em melhor alinhamento da amostra.
3. Alinhe fibrilas amiloides em um capilar de vidro (Figura 2B).
   1. Fixe uma seringa de 1 mL equipada com um pequeno pedaço de tubo de borracha na extremidade larga, com um capilar de vidro siliconado de 0,7 mm de diâmetro, e aspire 2-3 cm de suspensão de fibrila.
   2. Sele uma extremidade do capilar usando cera derretida e deixe a outra extremidade aberta para permitir a evaporação. Organize o capilar verticalmente e deixe secar por vários dias ou semanas até formar um disco seco no tubo capilar (Figura 2B).
4. Alinhe as fibrilas como um "tapete" ou filme fino (Figura 2C).
   1. Coloque uma amostra de alta concentração (por exemplo, >10 mg/mL) de fibrila sobre uma lâmina de vidro, parafilme ou pedaço de Teflon, cubra e deixe secar ao ar por pelo menos 24 horas. Isso deve secar para formar uma película fina e plana na superfície. Levante cuidadosamente isso usando um bisturi e depois prenda-o a um tubo capilar de vidro usando cola ou plasticina.
   2. O tapete terá uma disposição aleatória de fibrilas (veja a Figura 2C). Monte cuidadosamente a amostra em uma cabeça goniômica para que o feixe de raios X passe pela borda da amostra e paralelo ao plano do filme (Figura 2C).
      NOTA: A difração através da face do filme resultará em anéis de difração devido ao alinhamento aleatório (veja a Figura 2C).
5. Examine a amostra.
   1. Investigue o quão bem a amostra está alinhada examinando-a através de um polarizador cruzado sob um microscópio óptico. Se a birrefringência estiver presente, pode sugerir que há um bom alinhamento no feixe de fibrilas.
   2. Fixe a amostra de fibra capilar em uma cabeça goniômica usando plasticina. Considere se a amostra é um feixe de fibras, tapete ou disco ao colocá-la no feixe de raios X.
      1. Note que o eixo de rotação da amostra estará em torno do eixo da fibra para um fibrado (Figura 2A), enquanto nos discos as fibras tendem a se alinhar ao longo do diâmetro do tubo (Figura 2B). Um tapete terá duas direções distintas (paralelas ao plano do filme e perpendiculares a ele) (Figura 2C).
   3. Colete um padrão de difração (como mostrado na Figura 3A) usando equipamentos de raios X internos (CuKα para cristalografia de proteínas) ou radiação sincrotron. Os tempos de exposição variam dependendo da intensidade do feixe de raios X; Ajuste isso dependendo dos tempos recomendados de coleta para a fonte de difração.

2. Análise de dados

1. Uso do CLEARER para análise^{de dados 15}.
   NOTA: O programa de análise de padrões de difração de fibras de raios X está disponível gratuitamente para usuários acadêmicos pelo autor correspondente. Outros métodos para análise de difração estão disponíveis ^16,17 (www.esrf.fr/computing/expg/subgroups/data_analysis/FIT2D)¹⁸. Itálico entre parênteses indica comandos de menu.
   1. Converta o padrão de difração para um arquivo .tiff e faça o upload do arquivo para CLEARER (Figura 4).
   2. Insira as configurações de difração (Padrão de Difração: configurações de difração), incluindo o tamanho do pixel na imagem TIFF, a fonte de raios X e a distância da amostra ao detector.
   3. Certifique-se de que o padrão de difração esteja orientado de modo que o meridiano fique vertical (Processamento de Imagem: Rotação). Use o módulo de Centralização (Padrão de Difração: Imagem Central) para centralizar a imagem. Defina os dois eixos principais (meridiano e equador): Este módulo compara a intensidade ao longo desses dois eixos do padrão. Após o centralizamento, salve a imagem e garanta que ela seja usada nas etapas seguintes.
   4. Especifique um ângulo adequado (definido ao longo dos dois eixos principais [meridiano e equador]) e produza um gráfico mostrando a posição do sinal de difração em relação à intensidade usando o módulo de Média Radial (Padrão de Difração: Média Radial) (Figura 4A).
   5. Meça e produza automaticamente as posições do sinal de difração usando o módulo Peak Find (Padrão de Difração: Média Radial: Peak Find) (Figura 4B). Certifique-se de que todos os sinais de difração estejam sendo detectados com precisão, ajustando a largura de busca de pico enquanto garante que o ruído não esteja sendo detectado.
   6. Verifique as posições de sinal emitidas pelo Peak Find usando o módulo Zoom & Measure (Padrão de Difração: Zoom & Measure). Verifique se todas as posições dos sinais estão listadas e atribuídas ao eixo correto.
   7. Explore as dimensões da célula unitária (b e c) que gerarão os sinais de difração observados usando o módulo de Otimização da Célula Unideira (Padrão de Difração: Otimização da Célula Unideira) (Figura 5A). Examine os sinais fortes encontrados no equador para gerar uma estimativa inicial a ser inserida na tabela de entrada da célula unitária e especifique os índices mínimo e máximo [hkl] sobre os quais o CLEARER busca células potenciais (uma dimensão é meridional e padrão é 4,76 Å).
   8. Calcule as dimensões potenciais da célula unitária e compare as posições previstas dos sinais de difração com as reflexões observadas. As células unitárias são pontuadas dependendo do grau de concordância entre os sinais previstos e experimentais. As vinte melhores lutas são então exibidas. Considere o comprimento do precursor peptídico e outras informações da microscopia eletrônica, AFM ou ressonância magnética nuclear de estado sólido (ssNMR) para ajudar a selecionar as melhores células unitárias possíveis para se adequar aos dados e à amostra.

3. Modelagem estrutural e teste do modelo usando CLEARER

1. Construir modelos moleculares (formato PDB).
   NOTA: Utilize programas de modelagem de proteínas como Pymol (DeLano)¹⁹ ou Insight II (Accelerys) e outros, para gerar coordenadas PDB do peptídeo precursor em conformação de β fita e em arranjo de β folhas. Esta seção descreve um processo simples usado para uma célula unitária ortorrómbica (todos os ângulos de 90°). Organizações não ortogonais são possíveis quando é necessário um conhecimento mais especializado sobre difração. Essas podem ser exploradas em CLEARER para células unitárias mais complexas.
   1. Construa arranjos tridimensionais dos peptídeos em uma disposição de β folhas para caber na(s) célula(s) unitária(s) determinada(s). Certifique-se de que este modelo contenha todos os objetos relacionados à simetria dentro da célula.
   2. Carregue o modelo PDB no módulo Gerador de Cadeia de Estruturas (Simulação de Difração: Estruturas: Gerador de Cadeia de Estruturas) para verificar as coordenadas estruturais construídas. Certifique-se de que o eixo da fibra e do eixo da viga estejam corretamente atribuídos. Insira as dimensões determinadas da célula unitária. Verifique se ocorre conflito nas dimensões selecionadas da célula (Figura 5B).
   3. Envie as coordenadas do modelo PDB para o módulo de Simulação de Difração de Fibra (Simulação de Difração: Simulação de Difração de Fibra).
      1. Insira a direção do eixo da fibra, orientação do feixe, dimensões da célula unitária selecionadas na etapa 3.1.2, configurações da fonte de raios X e do detector, e clique em simular. Para uma simulação de célula unitária ortorrómbica, o eixo da fibra é definido pelo eixo cartesiano relacionado à orientação do eixo da fibra no modelo utilizado.
      2. Certifique-se de que os eixos da viga estejam perpendiculares ao eixo da fibra, ou seja, em um dos outros dois eixos possíveis. Salve as configurações de simulação como .html arquivos (Arquivo: Salvar Como). Esses podem ser enviados e editados posteriormente para explorar iterativamente a estrutura ideal do modelo.
      3. Salve o padrão simulado resultante em formato bruto, que pode ser enviado posteriormente para análise posterior, ou como um .tiff (este formato tem informações adicionais de contraste descartadas) (Simulação: Salvar a Imagem Visualizável como TIFF). Depois, compare esses com o padrão experimental.
2. Compare padrões simulados de difração com padrões experimentais para apresentação.
   1. Use os passos 2.1.5-2.1.6 para medir sinais simulados de difração e comparar com aqueles medidos a partir de padrões experimentais (Figura 6). Registre isso em uma tabela.
   2. Use um módulo chamado Camadas (Padrão de Difração: Camadas) para sobrepor padrões simulados e experimentais para comparar posições de sinal ( Figura 6C).
   3. Compare as posições do sinal e as intensidades relativas entre os padrões experimental e simulado, organizando um quadrante do padrão simulado ao lado do padrão experimental (como mostrado na Figura 6B)^8,20,21.
   4. Avalie a validade de uma célula unitária e modelo sugeridos, e então altere iterativamente o modelo e a célula para melhorar a similaridade entre o padrão simulado e o padrão experimental de difração.
   5. Compare extensivamente os resultados de diferentes modelos e células usando o procedimento descrito no passo 3.1 para testar várias alternativas. Certifique-se de que as informações coletadas de outras técnicas, como TEM, AFM e RMN, sejam consideradas como restringendo a modelagem e para chegar à melhor representação estrutural possível que se encaixe nos^dados 8,21,22,23.

Resultados

Exemplo²⁴ do CcbMet: A Figura 1 mostra micrografias eletrônicas mostrando alta densidade de fibrilas amiloides em uma grade adequada para preparação de uma amostra de fibra de raios X. A Figura 2 descreve as diferentes texturas que podem ser geradas a partir do fibrado de amostras fibrosas (Figura 2A), disco (Figura 2B

Discussão

A difração de fibras de raios X pode ser usada para avaliar se uma amostra está formando uma estrutura amiloide e para obter uma compreensão mais profunda da organização molecular da proteína precursora ou peptídeo dentro das fibras. Aqui, descrevemos os métodos pelos quais amostras fibrosas podem ser preparadas para difração de fibras de raios X, os dados podem ser obtidos e depois analisados. De forma crítica, a qualidade dos dados obtidos dependerá tanto da ordem dentro das fibras ind...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,7 mm de diâmetro raio-X  capilares de quartzo de vidro	GLAS, W. Muller, D-13503, Berlin, Alemanha	Q-07-001-80
Capilares de vidro 1,5 mm de borsilicato	Harvard appatus Ltd, (Edenbridge, Kent, Reino Unido)	BS4 30-0074	exemplo, disponível em outros fabricantes
Difratômetro de raios X para cristalografia de proteínas	Vários		Vários fabricantes