Um Fluxo de Trabalho Abrangente para Proteômica de Plasma por Espectrometria de Massa: Uma Estratégia para a Descoberta de Biomarcadores em Doenças Sistêmicas Humanas

Resumo

A proteômica plasmática possibilita a descoberta de biomarcadores para doenças sistêmicas por meio de amostragem minimamente invasiva. Apesar dos desafios analíticos apresentados pela complexidade do plasma, este estudo apresenta um fluxo de trabalho otimizado de cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS/MS) que aprimora a cobertura proteomática, reduz a variabilidade e melhora a reprodutibilidade, permitindo comparações precisas entre amostras de doença e controle.

Resumo

O plasma, o componente livre de células do sangue, oferece uma fonte minimamente invasiva e rica de informações biomoleculares, tornando-o ideal para investigar doenças sistêmicas. O advento de tecnologias proteômicas de alto rendimento revolucionou a análise plasmática ao permitir a identificação e quantificação em larga escala de proteínas circulantes. Esses avanços facilitaram a descoberta de biomarcadores para diagnóstico precoce, prognóstico e direcionamento terapêutico de vários distúrbios, incluindo cânceres e doenças inflamatórias. No entanto, a complexidade inerente do plasma, juntamente com métodos inconsistentes de preparação e análise de amostras, historicamente limitou a cobertura e a reprodutibilidade do proteoma. Abordagens iniciais baseadas em análise de plasma bruta frequentemente sofriam de baixa consistência e efeitos significativos em lotes, dificultando estudos comparativos confiáveis entre coortes clínicas.

Para superar essas limitações, o estudo atual introduz um fluxo de trabalho robusto e escalável de proteômica de plasma. O protocolo integra etapas preparatórias importantes, como imunodepleção, filtração de corte de peso molecular, liofilização, quantificação e normalização de proteínas, digestão enzimática e perfil LC-MS/MS. Essa estratégia otimizada aumenta significativamente a profundidade do proteoma e reduz a variabilidade, permitindo assim uma análise diferencial de expressão proteica mais precisa e reprodutível entre casos de doença e controles saudáveis. O fluxo de trabalho oferece uma plataforma valiosa para pesquisadores que buscam gerar dados proteômicos de alta qualidade a partir do plasma, contribuindo para o avanço dos diagnósticos baseados em biomarcadores e da medicina personalizada.

Introdução

O plasma, o componente livre de células do sangue, está ganhando reconhecimento crescente como um reservatório de informações biológicas relevantes para estudos de doenças. Ele carrega uma infinidade de biomoléculas circulantes diversas, que vão desde proteínas e metabólitos até lipídios e ácidos nucleicos, o que é um espelho do status fisiológico e patológico do organismo. Essa natureza sistêmica do plasma o torna um bioespécime ideal para investigação da fisiopatologia de doenças, que vão desde câncer até distúrbios metabólicos e inflamatórios. Um grande benefício do uso do plasma como amostra está em seu método minimamente invasivo de coleta, permitindo amostras repetidas em ambientes clínicos, o que é importante para a observação da progressão da doença ou resposta terapêutica. No entanto, o plasma apresenta uma matriz proteômica extremamente complexa, na qual proteínas como albuminas e imunoglobulinas abrangem mais de dez ordens de grandeza, mascarando a^{identificação 1}.

Nas últimas duas décadas, a proteômica plasmática possibilitou a identificação de biomarcadores clinicamente relevantes, como a gonadotrofina corionica beta-humana (β-hCG) e a troponina I, impulsionadas pelos avanços em tecnologias de análise proteica^{em grande escala 2}. Essas ferramentas aceitam, como entrada, informações altamente sensíveis e, com sua natureza de alta produtividade, fornecem perfilamento em larga escala das proteínas plasmáticas. Com o advento das plataformas de cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS/MS), agora é possível analisar milhares de espécies de proteínas usando apenas 10-50 μL de plasma de entrada, com uma faixa dinâmica de detecção que abrange várias ordens de magnitude ^3,4. Isso aumentou o uso da proteômica plasmática em pesquisas translacional: detecção precoce da doença, modelos prognósticos aprimorados e descoberta de novos alvos terapêuticos⁵.

Um marco importante nessa área foi o estabelecimento do Projeto do Proteoma do Plasma Humano (HUPO-HPPP), que catalogou sistematicamente proteínas plasmáticas e demonstrou a viabilidade da proteômica plasmática como campo^{estabelecido 6}. Posteriormente, o Consórcio de Análise Proteômica Clínica de Tumores (CPTAC) adotou protocolos rigorosamente validados e estudos interlaboratoriais para abordar questões de reprodutibilidade que anteriormente desafiavam a pesquisa proteômica⁷. Essas iniciativas ressaltaram a necessidade de padronização e destacaram procedimentos-chave, incluindo manuseio uniforme do plasma, depleção de proteínas abundantes, digestão enzimática e parâmetros consistentes LC-MS/MS. Estudos recentes de Geyer e colegas mostraram que assinaturas proteômicas plasmáticas podem ser geradas de forma confiável em muitos indivíduos quando metodologias padronizadas são usadas, fornecendo uma base para estudos em nível populacional e processos de validação de^{biomarcadores 8}.

A progressão da proteômica plasmática foi consideravelmente moldada pelo reconhecimento do controle de qualidade (QC) e das métricas de desempenho como componentes críticos do desenho experimental. Convencionalmente, diferenças na eficiência da digestão, taxas de identificação de peptídeos e desempenho do instrumento levaram a inconsistências entre estudos de pesquisa, afetando assim a reprodutibilidade. Muitos estudos foram realizados para abordar essas questões. Gawor et al. delinearam indicadores mensuráveis de qualidade para preparação de amostras e desempenho em espectrometria de massa, fornecendo assim um método sistemático para avaliar a robustez do pipeline de perfilamento^{de proteínas 9}. Tsantilas et al. apresentaram ferramentas de benchmarking computadorizadas que permitem aos pesquisadores comparar conjuntos de dados entre plataformas e laboratórios, aumentando assim a transparência na apresentação dos dados de proteômica¹⁰. Além disso, avanços em metodologia, como imunodrepção, fracionamento por exclusão de tamanho e aquisição independente de dados (DIA), aumentaram a cobertura do proteoma e reduziram o viés^{técnico 11,12}. Tais medidas de garantia de qualidade garantem que os dados proteômicos do plasma sejam reproduzíveis e sirvam como andaime para futuros estudos de tradução clínica.

Apesar desses avanços significativos, a complexidade inerente do plasma continua a apresentar desafios. É comum que a análise direta do plasma bruto produza uma cobertura subótima de proteomas, já que proteínas muito abundantes sobrecarregam os analitos de baixa abundância, muitos dos quais são os candidatos a biomarcadores mais promissores. Além disso, variações técnicas decorrentes da quantificação variável da proteína, digestão incompleta e limpeza inadequada podem contribuir para artefatos em lote e diminuição da comparabilidade de^{coorte 13}. Essas limitações ressaltam a necessidade de fluxos de trabalho altamente otimizados que equilibrem profundidade do proteoma, reprodutibilidade e escalabilidade. Este protocolo de estudo atende a essa necessidade demonstrando um fluxo de trabalho otimizado para proteômica plasmática que combina imunodepleção, filtração de corte em peso molecular, liofilização, normalização e quantificação de proteínas, digestão enzimática e perfil LC-MS/MS. Ao aumentar a cobertura do proteoma e reduzir a variação técnica, o arcabouço metodológico permite uma quantificação relativa consistente entre os grupos afetados pela doença e os grupos controle. Ao introduzir escalabilidade e acomodar análises a jusante, o fluxo de trabalho oferece um método utilizável e reproduzível para extrair informações clinicamente significativas da proteômica plasmática.

Protocolo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho simplificado projetado para aprimorar a proteômica plasmática para a descoberta de biomarcadores em doenças inflamatórias^{sistêmicas 14,15}. O estudo foi realizado de acordo com o Comitê de Ética Institucional e a Declaração de Helsinque de 1975, revisada em 2000. Foi obtido consentimento informado dos participantes. Inicialmente, as amostras de plasma passam por imunodepleção para remover proteínas de alta abundância, seguidas por filtração baseada em peso molecular para reduzir a complexidade da amostra. As amostras são então liofilizadas e quantificadas para garantir que a concentração de proteína seja adequada para o processamento posterior. Após a normalização, proteínas são submetidas à digestão tripptica para gerar peptídeos adequados à análise. Por fim, a espectrometria de massa é empregada para detectar e quantificar proteínas de baixa abundância, facilitando comparações confiáveis entre condições saudáveis e de doenças (a Figura 1) mostra o pipeline de proteômica sanguínea.

1. Coleta de amostras:

1. Obtenha 3 mL de sangue dos participantes em tubos de Vacutainer com ácido etilendediaminético tetraacético (EDTA) por venpunção da veia antecubital em condições assépticas. Isso é feito por um flebotomista treinado.
2. Para separar o plasma, centrifuge as amostras (rotor de ângulo fixo com 12 × 15 mL) por 10 minutos a 704 g. Mantenha as amostras de plasma armazenadas a -80 °C até exame subsequente.

2. Imunodepleção

NOTA: A imunodepleção é um método baseado em cromatografia de afinidade usado para remover seletivamente proteínas de alta abundância de fluidos biológicos como soro, plasma e líquido cefalorraquidiano (LCR). Um cartucho de spin contendo anticorpos imobilizados tem como alvo e captura 14 proteínas comuns de alta abundância, incluindo albumina, imunoglobulinas (IgG, IgA, IgM), transferrina e complemento C3. Essas proteínas são retidas no cartucho enquanto proteínas de baixa abundância passam para análises adicionais. A técnica aprimora o perfil proteômico ao reduzir a complexidade da amostra e melhorar a detecção de potenciais biomarcadores. Essa abordagem é amplamente adotada na proteômica de plasma para melhorar a sensibilidade e a reprodutibilidade^16,17.

1. Preparação do cartucho
   1. Retire o cartucho de spin de 0,45 mL da geladeira. Deixe equilibrar com a temperatura ambiente.
   2. Prepare Buffer A Equil/Load/Wash e Buffer B Elution de acordo com o número de amostras processadas. Aplique aproximadamente 5 mL de Buffer A e 2 mL de Buffer B por amostra de plasma de 10 μL. Decantando para tubos de centrífuga estéreis de 50 mL.
   3. Rotule duas seringas estéreis Luer-Lok de 5 mL como A para o Buffer A e B para o Buffer B.
2. Preparação da amostra de plasma
   1. Dilua cada 10 μL de amostra de plasma com 190 μL de Buffer A até um volume final de 200 μL.
      NOTA: Adicione inibidores de protease ao Buffer A para evitar a degradação das proteínas plasmáticas durante o processamento.
   2. Uma amostra de plasma pode conter partículas particuladas. Pode entupir o cartucho. Para evitar entupimento e melhorar a clareza da amostra, centrifuge a amostra diluída através de um filtro de spin de 0,22 μm por 1 minuto a 16.000 ×g a 4 °C.
3. Configuração do cartucho
   1. Remova a tampa do cartucho e a tampa inferior e guarde-as para uso posterior.
   2. Coloque um adaptador Luer-Lok no cartucho de spin.
   3. Retire 4 mL de Buffer A na seringa rotulada como "A" e conecte a seringa ao adaptador Luer-Lok.
   4. Gradualmente flua o Buffer A através do cartucho para permitir que a resina se equilibre e desloque qualquer ar preso.
   5. Aspire o excesso de buffer do topo do cartucho com uma micropipeta estéril.
   6. Remova o adaptador Luer-Lok e deposite o cartucho de spin em um tubo de coleta com tampa de rosca marcado F1.
4. Carregamento de amostras e coleta de frações
   1. Adicione 200 μL de plasma filtrado e diluído diretamente sobre a cama de resina.
   2. Centrifuge o cartucho a 100 × g por 1 minuto a 4 °C. Deixe o cartucho sem tampa ou com tampa frouxa para permitir um fluxo suave.
   3. Colete a fração de fluxo contínuo F1 no tubo de coleta rotulado. Certifique-se de que a cama de resina e a frita permaneçam úmidas após a centrifugação.
   4. Deixe o cartucho descansar em temperatura ambiente por 5 minutos.
5. Lavagem e recuperação de frações de fluxo contínuo
   1. Adicione 400 μL de Buffer A sobre a cama de resina e centrifuge a 100 × g por 2,5 min a 4 °C. Adicione esse eluado ao tubo de coleta F1.
   2. Transfira o cartucho para um novo tubo de coleta rotulado como F2.
   3. Adicione mais 400 μL de Buffer A e centrifuge a 100 × g por 2,5 min a 4 °C. Colete o eluado no tubo F2.
6. Elução de proteínas ligadas
   1. Remova o cartucho do tubo F2 e conecte o adaptador Luer-Lok.
   2. Encha a seringa rotulada como "B" com 2,5 mL de Buffer B e conecte-a ao cartucho.
   3. Empurrar lentamente o Buffer B através do cartucho para eluir as proteínas de alta abundância ligadas em um tubo de coleta fresco.
      NOTA: Salve a fração de ligação se for necessária uma análise adicional; caso contrário, descarte adequadamente.
7. Reequilíbrio de cartuchos
   1. Remova a seringa contendo o Buffer B do cartucho e anexe a seringa rotulada como "A" contendo 5 mL de Buffer A.
   2. Empurra lentamente o Buffer A através da cama de resina para reequilibrar o cartucho a uma vazão de 0,5 mL por minuto.
      NOTA: Não deixe a cama de resina ou frit secarem. Deixe uma pequena quantidade de tampão sobre a frita durante o armazenamento.
   3. Uma vez equilibrado, o cartucho está pronto para a próxima amostra.
8. Uso a jusante
   1. Para máxima recuperação de proteínas de baixa abundância, combine frações de fluxo F1 e F2.
      NOTA: F1 e F2 também podem ser analisados separadamente se for necessária análise diferencial. O buffer adicionado é de 1 mL, então a fração combinada de F1 pode ser de ~850 μL para garantir uma boa recuperação. Analise o plasma bruto, o fluxo contínuo e o eluado por eletroforese em gel de Dodecil Sulfato de Sódio-Poliacrilamida (SDS-PAGE) para confirmar a remoção das 14 principais proteínas de alta abundância do fluxo de passagem. 12,5 μL de fluxo através de F1, plasma bruto e eluato serão usados para carregar em gel, formando um volume de poço de 25 μL (tampão de amostra de Laemmli: razão amostral 2:1)

3. Concentração de proteína usando um concentrador de spin de 5 kDa

NOTA: Concentrar uma amostra usando um concentrador de spin de 5 kDa baseia-se no princípio da exclusão de tamanho e filtração molecular para alcançar concentração rápida e alta recuperação das biomoléculas-alvo em um único tubo. Isso permite a concentração de proteínas por meio da remoção da troca de solvente e tampão ou dessalinização da solução proteica.

1. Encha o concentrador de spin com até 4 mL da amostra de proteína.
2. Coloque o concentrador de spin em uma centrífuga refrigerada.
3. Centrifuge a 5.000 × g a 10 °C por 30 minutos, ou até que a redução de volume desejada (por exemplo, 30× concentração) seja alcançada.
4. Remova o concentrador de spin da centrífuga e recupere a amostra concentrada do fundo da câmara de retentado usando uma micropipeta. Para garantir uma boa recuperação, espere ~150 μL de concentrado recuperado de um total de amostra de proteína de 850 μL.
   NOTA: Certifique-se de que a membrana não resseca durante a centrifugação para manter a integridade da proteína e a eficiência da recuperação.

4. Dessalinização e troca de tampão

1. Descarte o filtrado da câmara inferior do concentrador.
2. Reabasteça o tubo da centrífuga com um volume igual de 50 mM de tampão de bicarbonato de amônio (pH 7,2-7,4). (Por exemplo, se o retentado for 150 μL, adicione 150 μL de buffer)
3. Centrifuge novamente a 5.000 × g a 10 °C até atingir a concentração original.
4. Repita esse processo de troca de tampão três vezes para remover aproximadamente 99% dos contaminantes de pequenas moléculas, como sais ou ureia.
5. Concentre as amostras de proteína liofilizando-as usando um liofilizador a vácuo rápido.
   NOTA: Ajuste o número de ciclos com base no grau de dessalinização necessário para aplicações a jusante.

5. Quantificação de proteínas usando ensaio de ácido bicinquinínico (BCA)

NOTA: A concentração de proteína das amostras foi determinada usando o ensaio de proteína BCA, com albumina sérica bovina (BSA) como padrão. O ensaio BCA é um método colorimétrico compatível com detergente, baseado em ácido bicincônico, para detectar e quantificar proteínas totais. Baseia-se na redução de²⁺ em⁺ por proteínas em ambiente alcalino (a reação de Biuret), seguida da detecção colorimétrica altamente sensível e seletiva do íon cuproso (⁺) usando um reagente contendo ácido bicincônico. O ensaio produz um complexo de cor roxa formado pela quelação de um íon cuproso com duas moléculas de BCA. O ensaio BCA produz uma resposta consistente e linear com BSA, garantindo uma referência padrão confiável para a curva. Embora se saiba que diferentes proteínas produzem respostas distintas no ensaio de BCA, o uso de BSA fornece quantificação relativa reprodutível entre amostras diversas. Como nosso objetivo era a normalização para carga igual de proteínas, em vez da quantificação absoluta de todas as espécies, a calibração baseada em BSA ofereceu a abordagem mais robusta e reprodutível.

1. Procedimento
   1. Adicione 25 μL de cada padrão BSA (faixa de trabalho 20-2000 μg/mL) e a amostra de proteína desconhecida em poços designados de uma placa de 96 poços.
   2. Adicione 200 μL de reagente BCA funcional a cada poço.
   3. Misture bem usando um shaker de microplaca por 30 segundos.
   4. Cubra o prato e incube a 37 °C por 30 minutos.
   5. Leve o prato até a temperatura ambiente.
   6. Meça a absorção a 562 nm usando um leitor de microplaca.
2. Análise de dados
   1. Subtraia a absorvância média do blank (proteína zero) de todos os valores de absorção da amostra e padrão.
   2. Plote uma curva padrão de absorção vs. concentração de BSA (micrograma/microlitro).
   3. Use a equação de regressão da curva para calcular as concentrações de proteínas em amostras desconhecidas.

6. Normalização da concentração de proteínas

1. Procedimento
   1. Meça a concentração de proteína de cada amostra plasmática usando um método de quantificação apropriado.
   2. Registre a concentração e o volume total de cada amostra.
   3. Prepare um tampão de bicarbonato de amônio de 50 mM (pH 7,8) como diluente.
   4. Calcule a diluição necessária usando a fórmula C₁V₁ = C₂V₂.
   5. Para uma amostra com concentração de 1,3 mg/mL e volume de 100 μL, calcule o volume final necessário para atingir 1 mg/mL:[V₂ = \frac{1,3 \vezes 100}{1} = 130\ \mu L]
   6. Calcule o volume do buffer a somar subtraindo o volume inicial do volume final: Volume do buffer = 130 μL − 100 μL = 30 μL.
   7. Adicione 30 μL de 50 mM de bicarbonato de amônio (pH 7,8) à amostra de plasma de 100 μL.
   8. Misture a amostra suavemente por pipete ou vórtice breve.
   9. Confirme que o volume final é de 130 μL em concentração normalizada de 1 mg/mL.
   10. Prossiga com a preparação da amostra proteômica a jusante.
       NOTA: Garanta ajuste preciso da concentração calculando o fator de diluição necessário com base nos resultados do ensaio BCA. Cada etapa é validada, e os dados são fornecidos como dados suplementares (Tabela Suplementar 1).

7. Preparação da amostra e digestão tríptica

1. Redução de proteínas
   1. Adicione um agente redutor apropriado (por exemplo, 1,4-ditiotreitol [DTT]) à solução proteica em tampão de bicarbonato de amônio até uma concentração final de 100 mM.
   2. Incube a mistura a 60 °C por 30 minutos em um termomisturador ou bloco de aquecimento.
      ATENÇÃO: DTT é um irritante e deve ser manuseado com luvas dentro de uma exaustão.
      NOTA: Informações adicionais sobre a tripsina usada para digestão foram fornecidas na Tabela de Materiais. Brevemente, foi usada tripsina tratada com tosil fenilalanil clorometil cetona (TPCK) de grau sequenciante (para eliminar a atividade quimotráptica) para garantir alta especificidade para clivagem nos resíduos de lisina e arginina. A atividade enzimática foi verificada com base nas especificações do fabricante, correspondendo a uma atividade de N-Benzoíla-L-Arginina Éster Etílico (BAEE) de aproximadamente 1 unidade por mg de proteína. Sobre as concentrações de DTT e acetamida de iodo (IAA), confirmamos que 100 mM de DTT e 200 mM de IAA referem-se a soluções padrão, e não às concentrações finais usadas na reação. As concentrações finais de trabalho durante a redução e alquilação estavam dentro da faixa padrão (tipicamente 5-10 mM de DTT e 10-20 mM de IAA, respectivamente).
2. Alquilação de resíduos de cisteína
   1. Deixe a amostra esfriar em temperatura ambiente por 5 minutos após a redução.
   2. Centrifuge brevemente para coletar condensado no fundo do tubo.
   3. Adicione 200 mM de IAA preparado em um tampão de 50 mM de Bicarbonato de Amônio (ABC) para alquilar os resíduos reduzidos de cisteína.
   4. Incube a amostra no escuro, em temperatura ambiente, por 30 minutos para evitar a degradação do IAA.
      NOTA: A iodoacetamida é sensível à luz e potencialmente tóxica; Evite exposição e manuseie em luz baixa.
3. Digestão enzimática
   1. Prepare a tripsina modificada de grau sequenciante em buffer ABC de 50 mM imediatamente antes do uso.
   2. Adicione tripsina a cada amostra com uma proporção tripsina-proteína de 1:25 (v/w).
   3. Incube a reação a 37 °C por 17 horas para permitir a digestão enzimática completa.
      NOTA: Tempos de digestão prolongados podem levar à excesso de digestão; Garanta estabilidade térmica durante toda a incubação.
4. Extinguendo a reação
   1. Interrompa a reação enzimática adicionando ácido fórmico a cada amostra para alcançar uma concentração final de 1,0% (v/v).
   2. Incube a 37 °C por 20 minutos para desnaturar a tripsina residual e estabilizar a mistura de peptídeos.
      ATENÇÃO: Ácido fórmico é corrosivo; Use equipamentos de proteção individual (EPI) adequados e trabalhe em uma exaustão química.
5. Recuperação de peptídeos
   1. Centrifuge a mistura de peptídeos digeridos a 3500 g por 12 minutos em temperatura ambiente para remover material insolúvel.
   2. Transfira cuidadosamente o supernadante transparente contendo peptídeos digeridos para frascos de autoamostragem sem perturbar o pellet.
   3. Armazene as soluções peptídicas a -20 °C até uma análise adicional de LC-MS/MS.
6. Preparação para a análise LC-MS
   1. Carregue as amostras peptídicas diretamente no sistema LC-MS equipado com mobilidade iônica para separação e análise peptídica.
   2. Certifique-se de que todos os frascos estejam devidamente selados para evitar evaporação e contaminação.

8. Análise MS-MS de LC

1. Carregamento peptídico e dessalinização
   1. Carregue 1 μg da amostra peptídica em um laço de amostra em modo de injeção parcial de laço.
   2. Dessal peptídeos usando uma coluna de trampa de C18 lavando com solvente aquoso contendo 0,1% de ácido fórmico a uma vazão de 15 μL/min por 1 minuto.
      NOTA: Use água com 0,1% de ácido fórmico como Solvente A e acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico como Solvente B durante toda a produção.
2. Separação peptídica
   1. Conecte a coluna de sifão em linha com uma coluna C18 analítica de fase reversa.
   2. Peptídeos elutais usando um gradiente linear de 3% a 40% de Solvente B ao longo de 55 minutos a uma vazão de 300 nL/min.
   3. Enxágue a coluna com Solvente B 80% por 7,5 minutos para remover os componentes retidos.
   4. Reequilibre a coluna com 3% de Solvente B antes da próxima injeção.
   5. Mantenha o forno de coluna a 35 °C e o autoamostrador a 4 °C durante a execução.
      NOTA: Inclua injeções em branco entre as amostras para minimizar a transferência de dados.
3. Configurações de aquisição por espectrometria de massa
   1. Análise espectral de massa de peptídeos eluídos
      1. Configure o sistema UPLC e acople-o diretamente ao MS de Alta Definição.
      2. Controle o sistema usando o software da Microsoft.
      3. Certifique-se de que o espectrômetro de massa esteja configurado como um instrumento híbrido de íons quadrupolos, mobilidade-aceleração ortogonal e tempo de voo (OA-TOF).
      4. Verifique se todas as conexões de nitrogênio e gás de bloqueio estão seguras e sem vazamentos antes de iniciar a operação.
         ATENÇÃO: Manuseie conexões de alta voltagem e gases pressurizados em conformidade com as normas de segurança laboratoriais.
   2. Configuração de ionização
      1. Opere o espectrômetro de massa em modo ionização positiva por eletrospray (ESI) usando uma fonte dupla de íons por eletrospray.
      2. Ajuste a tensão capilar nano-ESI para 3,4 kV.
      3. Ajuste a tensão do cone da amostra para 40 V e a tensão do cone de extração para 4 V.
      4. Ajuste o fluxo de gás nitrogênio da espectrometria de mobilidade iônica (IMS) para 90 mL/min.
      5. Inspecione a estabilidade do spray e certifique-se de uma corrente iônica consistente antes de prosseguir.
   3. Separação da mobilidade iônica
      1. Ajuste a altura do pulso do guia de íons IMS para 40 V durante a transmissão de íons.
      2. Ajuste a velocidade do guia de íons IMS para 800 m/s.
      3. Aumente a altura da onda de viagem linearmente de 8 V para 20 V durante todo o ciclo IMS para alcançar a separação ótima dos íons pela mobilidade.
         ATENÇÃO: Garantir fluxo estável de gás IMS; Flutuações podem afetar a separação de íons e a reprodutibilidade do tempo de deriva.
   4. Calibração de massa por trava
      1. Calibre o analisador de tempo de voo (TOF) usando uma solução de iodeto de sódio (NaI) de 2 μg/μL.
      2. Configure a faixa de calibração para detectar íons entre 50 m/z e 2000 m/z.
      3. Adquira espectros de referência de massa de bloqueio a cada 45 s usando o canal duplo de origem de íons eletrospray para correção de massa em tempo real.
      4. Verifique se a curva de calibração atinge precisão de massa dentro de ±5 ppm antes de prosseguir para a aquisição dos dados.
4. Aquisição de dados
   1. Adquira dados em modo contínuo, alternando entre duas funções:
      1. Função 1 (EM de Baixa Energia): Registrar espectros iônicos precursores de baixa energia.
      2. Função 2 (HDMSE de Alta Energia): Registrar espectros de íons fragmentados com energia de colisão elevada com separação de mobilidade iônica.
   2. Na Função 2, ajuste a energia de colisão na região Trap para 4 eV.
   3. Aumente a energia de colisão na região de transferência de 20 eV para 45 eV para alcançar fragmentação controlada do peptídeo.
   4. Defina o tempo de aquisição espectral por função para 0,9 s e o atraso entre varredura para 0,024 s.
   5. Monitore o cromatograma iônico total (TIC) para confirmar a resposta consistente do instrumento durante toda a execução.
   6. Importar dados brutos para softwares de análise proteômica (por exemplo, Progenesis QI ou equivalente).
   7. Alinhe cromatogramas entre as sequências usando a referência padrão de alinhamento ou uma sequência de referência selecionada manualmente.
   8. Identifique peptídeos e proteínas usando um banco de dados selecionado (por exemplo, UniProt Human - apenas entradas revisadas).
   9. Defina os seguintes parâmetros de busca:
      Enzima: Tripsina
      Modificação fixa: Carbamidilação (C)
      Modificação variável: Oxidação (M)
      Tolerância a peptídeos: De acordo com a resolução do instrumento
      Decotes errados: 1
      Taxa de Falsas Descobertas (FDR): ≤ 1%
   10. Realize a normalização usando o método de normalizar para todas as proteínas .
   11. Aplicar limiares de filtragem: ≥2 peptídeos por proteína, ≥1 peptídeo único, variação de dobra ≥1,5 e valor p ajustado <0,05.
       NOTA: Esta é uma orientação geral de segurança laboratorial — sempre siga os regulamentos EHS (Saúde e Segurança Ambiental) da instituição e os requisitos legais locais.
5. Controle de qualidade
   1. Realize verificações de calibração pré e pós-execução usando o padrão NaI para confirmar a precisão da massa.
   2. Garanta que a referência de massa da trava permaneça estável durante toda a análise.
   3. Avaliar as injeções de replicação para confirmar a reprodutibilidade no tempo de retenção, tempo de deriva e intensidade espectral.
      ATENÇÃO: Iodeto de sódio é um irritante. Durante o manuseio, use luvas e evite inalar ou contato com a pele.
      NOTA: Consulte o Arquivo Suplementar 1 para orientações sobre descarte de resíduos. Sempre trabalhe em ambiente frio ou com gelo ao manusear amostras de plasma para evitar a degradação das proteínas. Use luvas Nitryl, jaleco e proteção ocular ao manusear amostras biológicas e tampões. Realize os passos de centrifugação usando uma centrífuga refrigerada pré-resfriada a 4 °C. Certifique-se de que todos os tubos e seringas das centrífugas usados sejam estéreis e devidamente rotulados para evitar contaminação cruzada. Sempre use água de grau proteômico para preparar os tampões.

Resultados

Amostras de plasma foram processadas usando um cartucho de spin para remover seletivamente 14 proteínas de alta abundância, a saber: albumina, IgG, IgA, transferrina, haptoglobina, antitripsina, fibrinogênio, alfa2-macroglobulina, glicoproteína alfa1-ácida, IgM, apolipoproteína AI, apolipoproteína AI, complemento C3 e transtiretina. Essa etapa de depleção foi fundamental para aprimorar a detecção de biomarcadores de baixa abundância na análise proteômica a jusante. Cada amostra de plasma...

Discussão

A complexidade intrínseca do plasma como matriz biológica apresenta um grande desafio para a análise proteômica. A enorme faixa dinâmica das concentrações de proteínas, juntamente com a predominância de algumas espécies de alta abundância, pode mascarar a detecção de proteínas clinicamente relevantes e de menor abundância. Para este estudo atual, mitigamos essas desvantagens utilizando um pipeline padronizado de múltiplas etapas para a preparação da amostra, projetado para enriquecer sel...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Concentrador de Spin de Corte de Peso Molecular de 5 kDa	Tecnologias Agilent	5185 e menos; 5991	Usado para troca de tampão e remoção de sal; retém proteínas acima de 5 kDa
Bicarbonato de Amônio (ABC)	Sigma Aldrich	Número de cat: T6567	Usado para digestão tripptica
Buffer A Equil/Load/Wash & nbsp;	Tecnologias Agilent	5185-5987
Elução do Buffer B	Tecnologias Agilent	5185-5988
Centrífuga fria	Centrífuga refrigerada CPR-30 Plus	N/A	Usado para centrifugação de amostras de proteína em baixa temperatura
DTT	Sigma Aldrich	CASNo: 3483-12-3	Usado para digestão tripptica
Aparelho eletroforético	BIO RAD	1658004	Usado para SDS PAGE
IAA	Sigma Aldrich	CAS No: 144-48-9	Usado para digestão tripptica
IMS T-Wave & nbsp;	Águas	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/library/white-papers/2012/water-whitepapers-Triwav eMaisCaracterizaçãoCompletaDeMi xturesandMolecules-720004176.pdf	Separação da mobilidade iônica (IMS)
Leitor multimodo Infinite M Plex	TECAN		Leitor multiplate
Sistema LC-MS	Águas	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/liquid-chromatography-ms-systems.html
Software MassLynx 4.1 SCN781	Águas	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/informatics-and-software/mass-spectrometry-software/masslynx-mass-spectrometry-software.html	Software de espectrometria de massa
Cartucho de Spin de Remoção de Afinidade Múltipla Humano 14 (MARS Hu-14)	Tecnologias Agilent	5188 e menos; 6560	Usado para esgotar 14 proteínas plasmáticas de alta abundância, incluindo albumina, IgG, IgA, transferrina, etc.
Sistema UPLC nanoACQUITY	Águas	https://www.waters.com/nextgen/en/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-m-class-system.html
NanoLockSpray	Águas	https://www.waters.com/nextgen/us/en/services/instrument-services/instrument-upgrades/mass-spectrometry-ms-upgrades/nanolockspray-exact-mass-ionization-source-upgrade.html
Operon FDU-7003	Operon	http://www.operon.co.kr/en/pro2-FDU.html	Liofilizador de vácuo rápido
Kit de ensaio de proteína Pierce BCA	Termo Científica	23225	Usado para quantificar a concentração de proteínas usando ensaio colorimétrico
Progenesis QI para Proteomics	Águas	V4.2
Centrífuga R-8C BL Laboratory, rotor de ângulo fixo com 12 e horas de variação; 15 mL	REMI		Centrífuga
SYNAPT G2 MS de alta definição	Sistema HDMSE, Waters Corporation	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/app-notes/2009/720003057/720003057-en.pdf	Espectrômetro de massa de aceleração ortogonal (oa-Tof) híbrido do IMS
Frasco de recuperação total	Águas	https://www.waters.com/nextgen/us/en/shop/vials-containers--collection-plates/186004631-clear-glass-12-x-32-mm-screw-neck-total-recovery-vial-preassembl.html
Tripsina	Sigma Aldrich	Número de cat: T6567	Usado para digestão tripptica