Geração de organoides alveolares 3D embutidos em colágeno A549/MRC-5 usando um Biorreator Mecânico de Estiramento Celular

Resumo

Este protocolo descreve a geração de organoides a partir de células epiteliais alveolares A549 e fibroblastos pulmonares MRC-5 em um andaime de hidrogel de matriz extracelular, seguida pela incorporação em géis de colágeno 3D e exposição a tensão mecânica usando um biorreator de estiramento celular para investigar a mecanobiologia alveolar.

Resumo

Embora a dinâmica respiratória e a tensão mecânica desempenhem papéis críticos na biologia alveolar, suas contribuições para a patogênese das doenças respiratórias são frequentemente negligenciadas. Para suprir essa lacuna, desenvolvemos um modelo organoide no qual organoides de fibroblastos epiteliais alveolares são submetidos a uma tensão mecânica controlada usando um biorreator de alongamento celular. Esta plataforma replica a organização espacial e a complexidade multicelular do tecido alveolar e possibilita a investigação de como a comunicação célula-célula e a mecanotransdução influenciam a estrutura e a função dos tecidos na saúde e na doença. Neste protocolo, descrevemos métodos para gerar e cultivar organoides epiteliais-fibroblastos usando linhas celulares epiteliais alveolares A549 e fibroblastos pulmonares MRC-5 em um hidrogel extracelular da matriz basal. Os organoides são então isolados de forma não enzimática e incorporados em géis de colágeno 3D em placas especializadas no biorreator. Descrevemos procedimentos para aplicar a tensão equibiaxial para imitar padrões respiratórios patológicos observados em exacerbações respiratórias. Por fim, apresentamos um fluxo padrão de caracterização, incluindo imunocoloração para marcadores específicos de células e imunoensaios para perfilar a liberação do mediador imunológico. Juntas, essas análises apoiam a avaliação da estrutura e função dos organoides. Esse protocolo oferece uma plataforma amigável, reproduzível e adaptável para estudar a biologia alveolar sob estresse mecânico, com parâmetros facilmente modificáveis para atender a diversos objetivos experimentais e avançar na pesquisa sobre mecanismos de doenças pulmonares.

Introdução

Os alvéolos são os sacos terminais do sistema respiratório e servem como o principal local de troca gasosa. Eles são compostos principalmente por células epiteliais alveolares dos tipos I e II, responsáveis pela troca gasosa, funções imunes e manutenção da integridade estrutural, e fibroblastos dentro das paredes, que mantêm a homeostase da matriz^{extracelular 1}. Essas e outras células residentes são continuamente expostas ao estresse cíclico de estiramento e cisalhamento durante a^{respiração 2}. Tais pistas mecânicas são transdutas em sinais bioquímicos que influenciam a estrutura celular, a diferenciação e a comunicação³.

Tensão mecânica patológica é observada em doenças pulmonares, como a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). A DPOC é uma condição progressiva caracterizada por destruição parênquima, inflamação crônica e estreitamento das pequenas vias^aéreas. Nessa doença, a destruição das paredes alveolares, a perda de elastina, a remodelação da matriz extracelular (ECM) levando à fibrose e a inflamação crônica prejudicam coletivamente a capacidade do pulmão de suportar danos^{estruturais 5,6}. Isso resulta em deformação alveolar heterogênea e anormal durante a respiração, que é ainda mais agravada durante as crises da^{doença 7,8}.

Embora várias abordagens in vitro tenham sido usadas para estudar a biologia alveolar, cada uma apresenta limitações notáveis. Sistemas de co-cultura 2D facilitam a investigação das interações célula-célula, mas não capturam a arquitetura do tecido ou a dinâmica da matriz extracelular, reduzindo a relevância fisiológica. Culturas 3D estáticas preservam melhor a organização estrutural e as interações matriciais, mas não incorporam pistas mecânicas dinâmicas presentes in vivo. Plataformas microfluídicas e organ-on-chip podem imitar fluxo de fluidos e deformação mecânica, proporcionando alta fidelidade fisiológica, mas frequentemente são tecnicamente complexas, de baixo rendimento e^{custosas 9}. Em contraste, o modelo organoide 3D mecanicamente tensionado apresentado aqui combina complexidade estrutural, heterogeneidade celular e estimulação mecânica controlada, um aspecto frequentemente negligenciado em modelos existentes, dentro de uma plataforma reprodutível e escalável que oferece equilíbrio entre relevância fisiológica e acessibilidade^{experimental 10,11}.

Para entender os mecanismos complexos que contribuem para doenças como a DPOC e descobrir alvos terapêuticos, modelos de doenças foram estabelecidos. Apesar de sua importância, a tensão mecânica é frequentemente negligenciada nos modelos alveolares in vitro usados para estudar os mecanismos e a patogênese de doenças pulmonares, como a DPOC. Para suprir essa lacuna, apresentamos um método para cultivar organoides de fibroblastos epiteliais alveolares em uma matriz de embasamento, recuperá-los e incorporá-los em géis de colágeno 3D, aplicar tensão mecânica cíclica usando um biorreator de estiramento celular e avaliar os principais resultados estruturais e funcionais. Esses modelos 3D de organoides mecânicos capturam melhor as interações celulares e o microambiente do nicho alveolar humano, possibilitando o estudo da diafonia^{epitelial-mesenquimal-mesenquimal-12}.

O biorreator aplica deformação equibiaxial com parâmetros configuráveis, permitindo até 30% de elongamento e frequências de até 5 Hz para modelar condições fisiológicas e patológicas. Neste estudo, geramos modelos organoides embutidos em hidrogéis de colágeno-I submetidos a 18% de tensão a 0,4 Hz por 24 horas para simular a respiração patológica. Estabelecemos um fluxo de trabalho padronizado de caracterização que inclui imunocoloração para marcadores específicos de células e imunoensaios para quantificar a liberação de mediadores imunes após a tensão mecânica. O objetivo deste estudo é fornecer uma plataforma fisiologicamente relevante, fácil de usar e adaptável para investigar a biologia alveolar sob estresse mecânico.

Protocolo

Todas as etapas requerem técnica asséptica, materiais estéreis e reagentes, e são realizadas em um gabinete de biossegurança para reduzir a exposição do pessoal a materiais bio-perigosos e a contaminação de culturas. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura celular e estabelecimento de estoques celulares

1. Antes da formação do organoide, cultivou células A549 e MRC-5 em frascos plásticos tratados com cultura de tecido padrão (T75^{cm 2}) até aproximadamente 70%-80% de confluência, utilizando o Meio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina, doravante denominados "DMEM completo".
2. Para A549 e MRC-5, seme em 2 x 10⁴ células/cm², em um volume total de 10 mL de DMEM completo. Cultive células a 37 °C com 5% de_CO2 em um ambiente umidificado até que se atinja aproximadamente 70%-80% de confluência.
3. Substitua o meio de cultivo a cada 48 horas para garantir condições ideais de crescimento.
4. Subcultura aspirando todo o meio do frasco uma vez que 70%-80% confluência, lave uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois adicione 4 mL de tripsina-EDTA.
5. Incube a 37 °C por 5 minutos e visualize os frascos com um microscópio de campo claro para garantir o descolamento completo. Neutralize adicionando 4 mL de DMEM completo.
6. Conte as células usando a técnica de escolha, como a contagem de exclusão do azul de tripano.
7. Centrifuge a suspensão da célula a 200 x g por 5 minutos.
8. Aspire o sobrenadante para deixar um pellet celular no fundo do tubo cônico. Resuspenda o pellet celular em um volume apropriado de DMEM completo triturando suavemente.
9. Para congelamento, resuspenda em meio completo contendo 10% de DMSO para obter um 1 x 10⁶ células/mL. Para a formação do organoide, ressuspenda para obter 1 x 10⁶ células/mL.

2. Estabelecer e caracterizar a maturação de um modelo organoide de fibroblastos epiteliares alveolares 3D

NOTA: A matriz do porão deve ser descongelada no gelo durante a noite e mantida no gelo durante essas etapas. Temperaturas mais altas podem causar solidificação da matriz.

1. Prepare uma mistura 2:3 de matriz de porão e DMEM avançado. Adicione 300 μL dessa solução a cada poço de uma placa de 24 poços, garantindo que o fundo de cada poço seja revestido uniformemente. Incube a placa a 37 °C em uma incubadora umidificada por 1 hora para permitir que a matriz solidifique.
2. Prepare uma solução matricial de basamento a 5% em DMEM completo, que será o meio de cultivo para os organoides. Para cada poço, produza 1,2 mL dessa solução diluindo 60 μL da matriz basal em 1.140 μL de DMEM completo.
3. Durante o tempo em que a mistura da matriz basal estiver solidificando, misture 300.000 células A549 com 30.000 células MRC-5 em 200 μL da solução da matriz basal de 5% produzida em DMEM completo descrito no Passo 2.2.
4. Uma vez que a mistura basal 2:3 tenha solidificado, pipeteie 200 μL da mistura A549/MRC-5 sobre a matriz gelificada, depois retorne a placa de 24 poços para incubar a 37 °C, 5% de CO₂ por 21 dias para permitir o crescimento e diferenciação dos organoides alveolares.
5. Visualize as culturas sob um microscópio óptico pelas próximas 48 horas. As células devem estar se agregando dentro desse período.
6. Substitua a matriz de embasamento/solução DMEM a cada 48 horas por 200 μL de meio fresco a 5%. Para evitar perturbar os organoides embutidos no hidrogel, incline suavemente a placa para que a solução antiga se acumule ao longo da parede do poço antes da aspiração.
7. Nos dias 3, 9 e 21 de maturação, fotografe os organoides com ampliação objetiva de 10x e tire quatro imagens representativas ou campos de visão de cada poço. Imagens representativas da morfologia dos primeiros organoides nos dias 3, 9 e 21 são mostradas na Figura 1.
8. Para cada campo de visão, conte todos os organoides maiores que 50 μm de diâmetro. Usando a área conhecida do campo de visão, extrapola o número total médio de organoides por poço a partir da contagem média por campo, assumindo uma área de superfície de placas de 24 poços de 1,9 cm².
   NOTA: Essas análises podem ser feitas usando softwares de análise de imagem como o Fiji¹³.
9. O diâmetro médio e a área dos organoides também podem ser medidos para obter informações quantitativas sobre as características de crescimento dos organoides em cultura.

3. Colheita de organoides epiteliais fibroblastos epiteliares 3D

NOTA: Todas as etapas para colher os organoides devem ser realizadas no gelo.

1. Após 21 dias de maturação, aspire o sobrenadante e lave suavemente com aproximadamente 1-2 mL de PBS gelado.
2. Adicione 1-2 mL de solução fria de organoide e incube a placa a 2-8 °C por 30-90 minutos com agitação moderada.
   NOTA: Pare a incubação quando os organoides forem vistos flutuando no fundo do poço.
3. Monitore a dissociação usando microscopia de campo claro. A dissociação é considerada completa assim que a matriz do embasamento no fundo do poço não é mais visível e os organoides estão em suspensão. Um raspador de células pode ser usado para desalojar suavemente o hidrogel da matriz organoide-basal e acelerar o processo.
4. Agrupe o conteúdo de todos os poços em um tubo cônico de 50 mL sobre gelo.
5. Centrifuge a 500 × g por 5 minutos a 2-8 °C. Aspire o sobrenadante, lave o pellet organoide com 1-2 mL de PBS gelado e depois centrifuge novamente para obter um pellet. Aspire o PBS.

4. Estabelecimento de organoides alveolar-fibroblastos embutidos em colágeno 3D e aplicação de tensão mecânica

NOTA: Use placas circulares de cultura de espuma com âncoras de espuma compatíveis com um biorreator de alongamento celular. A placa de cultura usada neste protocolo tem área de crescimento de ~6,6^{cm 2}.

1. Prepare uma solução funcional de gel de colágeno I de 2 mg/mL. A solução deve conter 1× PBS, 11,4 mM de NaOH e 2 mg/mL de colágeno I, com o volume final ajustado usando água estéril. Prepare 2 mL dessa solução de colágeno I por poço da placa circular de espuma de 6 poços.
2. Adicione 1 mL da solução de colágeno I de 2 mg/mL nas âncoras de espuma na periferia da placa, garantindo a saturação completa.
   NOTA: As âncoras de espuma devem estar completamente saturadas com solução de colágeno I para garantir a adesão adequada. A saturação incompleta pode resultar no descolamento do gel de colágeno durante a aplicação da tensão mecânica, levando a uma redução da tensão efetiva em relação ao alvo pretendido.
3. Ressuspenda o pellet organoide em 6 mL de 2 mg/mL de colágeno rabo de rato e pipete 1 mL da suspensão no centro de uma placa circular de espuma de 6 poços, garantindo que a mistura de colágeno infundida com organoides se misture com o colágeno inicial livre de organoides adicionado às âncoras circulares de espuma.
   NOTA: Evite gerar bolhas ao adicionar a suspensão organoide em cada poço.
4. Polimerize o colágeno-I por 1 hora deixando as placas em uma incubadora (37 °C, 5% CO_2). Após a polimerização, o gel deve parecer turvo.
5. Adicione 2 mL de DMEM completo sobre organoides A549/MRC5 embutidos em colágeno 3D e retorne a placa à incubadora por 24 horas.
6. Substitua o meio de cultura por DMEM + 1% FBS e incube durante a noite antes da exposição à tensão mecânica.

5. Montagem do biorreator de estiramento celular e exposição à tensão mecânica

1. Insira estações de carregamento em cada poço da base. Estes contêm seis postes de carga de 25 mm de diâmetro, que permitem que a membrana flexível das placas do Tecido se deforme ao redor deles e exponha a cultura 3D à tensão equibiaxial.
2. Aplique uma camada fina de graxa de silicone no topo dos postes de carga.
3. Coloque juntas vermelhas na parte inferior de cada placa de 6 poços.
4. Insira as placas preparadas na base sobre os postes de carga.
5. Mova este aparelho para uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de_CO2 e conecte as conexões de desconexão rápida à base. Repita os passos 5.1 a 5.6, mas omitindo as conexões para criar um controle sem esforço.
   NOTA: Opcionalmente, pode-se aplicar um tampão de vedação de tubo, que impede a aplicação de pressão de vácuo no fundo de um único poço BioFlex, permitindo a geração de uma cultura de controle não tensionada na mesma placa.
6. Cubra com uma folha de Plexiglas e adicione ~5-10 lbs de peso para garantir uma vedação hermética.
7. Ligue o compressor de ar e abra a válvula de saída do compressor de ar.
8. Ligue a bomba de pressão de vácuo e abra a válvula do reservatório de pressão conectada à saída do tanque de vácuo. Certifique-se de que a pressão de vácuo esteja em torno de 90 kPa.
9. Abra a válvula de entrada do compressor de ar localizado próximo ao controlador do biorreator. Ajuste a pressão para que não ultrapasse 15 PSI na saída de ventilação.
10. Inicie o software embarcado e configure os parâmetros de deformação mecânica cíclica desejados. Para este estudo, foi utilizado um regime de amplitude de tensão de 18% a 0,4 Hz por 24 horas. Para configurar isso, crie um novo regime, defina o alongamento mínimo para 0%, o máximo para 18% e inicie o protocolo.
11. Observe a placa e a membrana para garantir que o movimento seja visível durante toda a sessão de esforço. A membrana deve estar se deformando ao redor dos postes de carga.
12. Verifique periodicamente a sifã de água para umidade e observe a tela do computador para ver quanto tempo de funcionamento, progresso e morfologia adequada do regime de deformação.
13. Desconecte o conjunto da placa base após a conclusão do regime de deformação e retorne as culturas estriadas para incubar por 24 horas antes das análises de caracterização a jusante.
14. Desligue e desmonte o sistema na ordem inversa da ligação: feche ou desligue a válvula de entrada do compressor de ar, depois a válvula do reservatório de pressão, a bomba de pressão a vácuo, a válvula de saída do compressor de ar e, finalmente, o compressor de ar, nessa ordem.
15. Colete o sobrenadante após 24 horas de incubação, após exposição à tensão mecânica. Armazene a -80 °C até o uso.

6. Caracterização morfológica de organoides via imunofluorescência

1. Lave o modelo de gel organoide-colágeno três vezes com PBS, adicionando suavemente 1 mL de PBS, incubando por 5 minutos em temperatura ambiente.
2. Aspire cuidadosamente o PBS e repita o processo de lavagem um total de três vezes.
3. Fixe o modelo incubando 2 mL de paraformaldeído a 4% por 1 hora a 4 °C.
4. Lave os modelos três vezes com PBS conforme descrito acima.
5. Use um bisturi para cortar delicadamente as âncoras circulares de espuma nos poços flexíveis com o gel de colágeno preso e coloque em uma placa de Petri.
6. Permeabiliza os organoides incubando com 2 mL de 0,1% de Triton X-100 em PBS por 5 minutos em temperatura ambiente.
7. Lave os modelos três vezes com PBS.
8. Bloqueie a ligação inespecífica incubando os modelos com 3 mL de albumina sérica bovina (BSA) a 5% em PBS por 1 h em temperatura ambiente. Remova a solução bloqueante e prossiga para o próximo passo.
9. Incube os modelos durante a noite a 4 °C com um coquetel de coloração contendo occludens-1 anti-humano zonula (ZO-1) conjugado com Alexa Fluor 594 na diluição 1:100, faloidina conjugada com Alexa Fluor 488 na diluição 1:1000 para avaliação da F-actina, e a coloração nuclear, DAPI, na diluição 1:4000. O diluente é 1 mL de 1% de BSA no PBS. Prenda as bordas da placa antes da incubação a 4 °C.
10. Aspire a solução de coquetel de mancha no dia seguinte e lave os modelos três vezes com PBS.
11. Imagine usando um microscópio confocal e tire pilhas Z a 5 μm fatias de organoides representativos com ampliação objetiva de 40x.
12. Analise a intensidade de fluorescência usando software de análise de imagens de Fiji. Normalize a intensidade média de fluorescência com a área do organoide para garantir uma comparação precisa entre diferentes condições ambientais.

7. Caracterização funcional de organoides por meio do ensaio de citotoxicidade ELISA e lactato desidrogenase (LDH)

1. Descongelar supernadantes no gelo e avaliar a secreção de interleucina-6 (IL-6) e interleucina-8 (IL-8) usando kits ELISA comercialmente disponíveis, de acordo com o protocolo do fabricante.
2. Avalie a liberação de LDH, um marcador de citotoxicidade, usando um ensaio comercialmente disponível de absorção de LDH.
3. Gerar uma curva padrão usando proteína LDH recombinante em concentrações de meio logaritarim de 0,5 μg a 0,5 ng. Interpole as concentrações de LDH de cada amostra usando a curva padrão.

8. Opcional: Isolamento de amostras para análises de RNA ou proteínas

1. Em vez de adicionar 4% de paraformaldeído para coloração por imunofluorescência, adicione tampão RLT preparado contendo β-mercaptoetanol a 10 μL por 1 mL de RLT.
2. Use 300 μL por modelo e faça uma pipete para cima e para baixo para descolar e lisar completamente as células.
3. Transfira o lisado para um tubo de microcentrífuga livre de RNase e coloque os tubos sobre gelo seco para congelar rapidamente. Transferir para -80 °C para armazenamento a longo prazo.
   NOTA: Alternativamente, pode-se usar o tampão RIPA para extração de proteínas preparando: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4-7,5; 150 mM NaCl; 1% NP-40 ou Triton X-100; 0,5% de desoxicolato de sódio; 0,1% SDS em água desionizada. O buffer RIPA pré-fabricado também está disponível comercialmente.
4. Adicione 200 μL por modelo, coloque pedra no gelo por 5 minutos, depois colete o lisado.
5. Centrifuge a 15.000 x g por 10 minutos a 4 °C para pelletar detritos de células e transfira para -80 °C para armazenamento a longo prazo.

Resultados

Organoides alveolares de fibroblastos epiteliais, derivados de linhagens celulares, foram estabelecidos e cultivados por mais de 21 dias. Mudanças morfológicas foram observadas durante esse período, com número, área e diâmetro dos organoides avaliados nos dias 3, 9 e 21 para monitorar o crescimento e o desenvolvimento. O número médio de organoides por poço diminuiu significativamente nos dias 9 e 21 em comparação com o dia 3 (Figura 2A). Em contraste, a área...

Discussão

Organoides alveolares epiteliar-fibroblastos tridimensionais (3D) representam uma plataforma altamente relevante fisiologicamente para modelar a estrutura e função pulmonar sob tensão mecânica. Ao contrário dos sistemas de co-cultura 2D ou até 3D, os organoides preservam características críticas do microambiente pulmonar in vivo, incluindo organização espacial, diafonia epitelial-mesenquimatosa e interações com matriz extracelular^{(ECM) 14}. A tensão mecâni...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo microcentrífuga de 1,5 mL	Eppendorf	0030 125.215
Tubo cônico de 15 mL	Fisher Scientific	14-959-53A
16% paraformaldeído	Thermo Fisher Scientific	28908
2-mercaptoetanol	Millipore Sigma	M3148
Tubo cônico de 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Placa circular de espuma Tissue Train de 6 poços (membrana flexível)	Flexcell International	TTCF-5001
Células A549	Coleção de Cultura do Tipo Americano (ATCC)	CCL-171
Compressor de ar	Ferramentas Pneumáticas da Califórnia	10020DSPCAD
Albumina sérica bovina	Millipore Sigma	A9418
Buffer RLT	Qiagen	79216
Incubadora CO2	PHCBI	MCO-170AICUVL-PA
Solução de colheita de organoides Cultrex	Bio-Techne	3700-100-01
Kit de ensaio de citotoxicidade CyQUANT LDH	Thermo Fisher Scientific	C20300
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dimetil sulfóxido	Sigma Aldrich	D2650-100ML
Dulbecco' s modificado Eagle' s medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11965092
Microscópio EVOS XL Core	Thermo Fisher Scientific	AMEX1200
Soro fetal bovino (FBS)	Thermo Fisher Scientific	A5209501
Software de análise de imagens em Fiji	Institutos Nacionais de Saúde
Sistema de Tensão e Tecido Flexcell FX-6000 (inclui controlador de tensão Flexlink FX-6000, reservatório de pressão, base, janela de acrílico, estações cilíndricas de carga de 25 mm de diâmetro, sifão de água, software FlexSoft FX-6000 V1.0 e vários tubos)	Flexcell International	FX6000T
Interleucina-6 Duoset Humano ELISA	Bio-Techne	DY206
Interleucina-8 Duoset Humano ELISA	Bio-Techne	DY208
Microscópio confocal Leica DMi8	Leica Microsystems	11889122
Matriz de Membrana Baseal Matrigel	Corning	356237
Células MRC-5	ATCC	CCL-185
Parafilm	Millipore Sigma	P7793
Penicilina/estreptomicina (Pen/Streptocócico)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Sondas de marcação de faloida, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A12379
Soro salino tamponado com fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144
Colágeno rato I	Sigma-Aldrich	C3867
Proteína desidrogenase de lactato humano recombinante (ativa)	Abcam	Ab93699
Buffer de lise RIPA	Thermo Fisher Scientific	89901
Tubos microfuge sem RNase	Thermo Fisher Scientific	AM12400
Frasco de cultura T75 cm2	Greiner	658175
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-5ML
Anticorpo monoclonal ZO-1 (ZO1-1A12), Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	339194