Artigo de método

In vitro Reconstituição da Ubiquitinação Bacteriana e Eliminação Mediada por VCP/p97

DOI:

10.3791/69454

⸱

2 de janeiro de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve um método para ubiquitinar Streptococcus pneumoniae usando lisado celular de mamífero ou complexo enzimático puro de ubiquitina, seguido de tratamento com complexo proteico purificado VCP/p97-UFD1-NPLOC4 para avaliar sua atividade bacteriolítica, possibilitando o estudo de efetores imunes dependentes de ubiquitina.

Resumo

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A ubiquitinação é uma modificação pós-translacional versátil que desempenha um papel crítico na imunidade citosólica. Após a invasão das células hospedeiras, as bactérias patogênicas são inicialmente encerradas dentro de um endossomo, do qual se libertam e escapam para o citosol para evitar a degradação lisossomal. Uma vez dentro do citosol, as bactérias são rapidamente marcadas com cadeias de ubiquitina pelas ligases E3 do hospedeiro, marcando-as para eliminação por meio de múltiplas vias efetoras, incluindo autofagia e proteasomo. Para delimitar a contribuição de vias individuais na eliminação bacteriana, a reconstituição in vitro oferece uma abordagem controlada e inequívoca. Aqui, usando Streptococcus pneumoniae (SPN) como patógeno bacteriano modelo, apresentamos um protocolo detalhado para sua ubiquitinação usando lisados celulares de mamíferos ou complexo enzimático puro de ubiquitina puro, seguido do tratamento com complexo purificado VCP/p97-UFD1-NPLOC4 para avaliar sua atividade bacteriolítica independentemente de outros fatores celulares. No geral, esse procedimento tem o potencial de iluminar a função das ligases e efetores de ubiquitina ligados à imunidade em um contexto sem células, onde dissecar tais mecanismos pode ser desafiador em células intactas.

Introdução

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Ubiquitina (Ub) é uma pequena proteína de 8,6 kDa que modifica substratos-alvo ao se ligar covalentemente a eles em sua glicina C-terminal, criando uma ligação isopeptídica com o grupo ε-amino dos resíduos de lisina em um processo chamadoubiquitinação 1. Esse fenômeno é regido por uma série de etapas orquestradas envolvendo uma enzima ativadora de ubiquitina E1, uma enzima conjugante de ubiquitina E2 e uma ligase ubiquitinaE3 1,2,3. O Ub pode ser fixado como monômero ou como cadeias de diferentes comprimentos por meio de seus sete resíduos de lisina (Linear/M1, K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63)4. Essas cadeias Ub únicas atuam como marcadores moleculares para várias funções celulares, como degradação proteassômica, tráfico celular, reparo de DNA e autofagiaseletiva 3.

Embora o papel canônico da ubiquitinação esteja há muito associado à manutenção da homeostase celular, como degradar proteínas mal dobradas por meio de proteassomos ou direcionar cargas específicas para a autofagiaseletiva 5,6, agora é evidente que a ubiquitina também funciona como um mecanismo crucial de detecção do sistema imunológico citosólico contra infecções bacterianas. Bactérias intracelulares frequentemente infiltram as células hospedeiras para evitar a detecção pela resposta imune extracelular e se reproduzem em um ambienteprotegido 7,8. Muitos patógenos utilizam sistemas secretores e toxinas para danificar irreparavelmente as vacúolas que os transportam, permitindo a fuga para dentro do citosol para obternutrientes 9,10. Uma vez dentro do citosol, essas bactérias são decoradas com cadeias de poliubiquitina por ligases específicas E3, atuando como uma "etiqueta de morte" molecular, que as direciona para a eliminação seletiva. Por exemplo, a ligase E3 SMURF1 engaja Mycobacterium tuberculosis ao iniciar a poliubiquitinação ligada a K48 diretamente em sua superfície, o que leva à sua degradação por meio do proteassomo11. A parkin se acumula em vacúolos contendo bactérias e forma cadeias de ubiquitinaligadas a K63 12, enquanto ARIH1 e LRSAM1 modificam as superfícies das bactérias com cadeias K48 e K6, respectivamente, inibindo assim o crescimentobacteriano 13,14. Embora a maioria das ligases E3 tenha como alvo principal substratos de proteínas hospedeiras, algumas ligases apresentam especificidade notável para componentes microbianos. RNF213 identifica e ubiquitina lipopolissacarídeos (LPS) encontrados em Salmonella enterica serovarTyphimurium 15, e o complexoSCF FBXO2 reconhece glicanos bacterianos presentes no Streptococcus do Grupo A como substrato para a ubiquitinação16, facilitando a xenofagia. O complexoSCF FBXW7, por outro lado, reconhece motivos degron dentro das proteínas de superfície de Streptococcus pneumoniae (SPN). Estes incluem β-galactosidase A (BgaA) e proteína de superfície pneumocócica A (PspA), que, após marcação com cadeias de poliubiquitina ligadas a K48, foram confirmadas usando anticorpos específicos de Ub ligados a K48, presumivelmente atraem o sistema proteassomo, permitindo a eliminação eficaz debactérias 17.

Embora o processo de marcação desses invasores citosólicos com ubiquitina seja bem compreendido, o mecanismo subsequente pelo qual o sistema proteassomal remove tais grandes entidades microbianas permanece duvidoso. Pesquisas recentes revelaram que a ATPase AAA+ hospedeira, VCP/p97 (proteína contendo Valosina), desempenha um papel crucial nesse processo. Em colaboração com cofatores como UFD1 e NPLOC4, o VCP pode identificar bactérias marcadas com poliubiquitina e extrai fisicamente proteínas ubiquitinadas da membrana bacteriana, rompendo-as e auxiliando na sua eliminação do meio citosólico sem depender da maquinaria proteassômica18.

O citossol hospedeiro contém uma rede complexa de vias imunes que funcionam em paralelo e de forma segura para garantir a remoção de patógenos. Essa redundância é crucial para uma defesa forte, mas complica os esforços para identificar e examinar o papel dos fatores imunesindividuais 19. Nesse sentido, os sistemas de reconstituição in vitro oferecem uma plataforma útil para analisar vias específicas sob condições controladas. Aqui, apresentamos um sistema livre de células que recapitula o processo de ubiquitinação e perda de viabilidade do SPN usando lisados celulares de mamíferos ou enzimas E1-E2-E3-Ub junto com complexos efetores purificados do hospedeiro. Neste protocolo em duas etapas, primeiro facilitamos a conjugação das cadeias de poliubiquitina nas bactérias, seguido pela avaliação de sua eliminação por VCP/p97 em associação com UFD1 e NPLOC4. Ao reconstituir essa via in vitro, contornamos as complexidades celulares e investigamos especificamente a capacidade do VCP de neutralizar o patógeno. Essa configuração precisa permite uma exploração detalhada do reconhecimento do substrato, especificidade de cadeia, modo de ação do efetor e os componentes essenciais necessários para iniciar uma resposta eficaz.

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Protocolo

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1. Preparação de cultura celular e lisado

  1. Descongele as células A549 e as cultive em um frasco de T25 usando DMEM completo com soro fetal bovino (FBS) a 10%. Incubar a 37 °C em ambiente umidificado com 5% deCO2. Passe as células por três passagens para manutenção, depois transfira 2 × 106 células para um frasco T75. Continue a cultura até que a densidade celular atinja 8-10 ×10,6 células.
  2. Raspe as células do frasco T75 a 4 °C usando um tampão de reação que contenha 200 mM de HEPES, 100 mM deMgCl 2, 1 M de KCl e 5% de glicerol a pH 7,4. Centrifuge as células raspadas a 120 × g por 10 minutos para granulá-las, depois ressuspenda-as no tampão de reação para alcançar um volume final de aproximadamente 0,6 mL em um tubo centrífuga de 1,5 mL.
    NOTA: Toda a amostra deve ser processada em gelo.
  3. Sonice a suspensão da célula usando uma sonda estreita (ponta de diâmetro, 2 mm) com amplitude de 40 μm com 2 segundos de pulsos liga/desligados por uma duração de 2 a 2,5 minutos, mantendo a mistura no gelo. Centrifuge as amostras sonicadas a 21.000 × g por 45 minutos, colete o sobrenadante resultante e adicione 2-3x do coquetel inibidor de protease 50x.
    NOTA: Use o lisato imediatamente para a reação de ubiquitinação no mesmo dia ou congele rapidamente usando nitrogênio líquido e armazene a -80 °C; No entanto, certifique-se de usá-lo em no máximo 3 dias para uma ubiquitinação eficaz. Concentração de lisato, variando de 2 a 4 mg/mL, é adequada para ubiquitinação.

2. Cultura bacteriana

  1. Cultive a bactéria Streptococcus pneumoniae (SPN) cepa R6 (Sorotipo II) durante a noite a 37 °C com 5% de CO2 em um meio THY composto por pó de caldo Todd Hewitt (3,7 g/100 mL) e pó de extrato de levedura (1,5 g/100 mL).
    NOTA: Evite inocular as bactérias se o meio tiver mudado para uma cor marrom escura. Streptococcus pneumoniae é classificado como patógeno de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2); tomar precauções e seguir os protocolos corretos de contenção BSL-2, incluindo o uso de um gabinete de biossegurança certificado.
  2. No dia seguinte, inocule da cultura durante a noite para um meio THY fresco (1:10) a 37 °C com 5% deCO2 e cultive o SPN até que a Densidade Óptica a 600 nm (OD600 nm) atinja 0,4. Prepare um estoque de glicerol de SPN (900 μL de cultura de SPN e 600 μL de glicerol (50%) e armazene-o em -80 °C.
  3. No dia do experimento de ubiquitinação, descongele um novo estoque de SPN de -80 °C e inocule-o completamente em um meio THY de 5 mL e permita que cresça até que OD600 nm atinja 0,4.
    NOTA: A cultura bacteriana foi cultivada até um ODde 600 nm de 0,4, o que corresponde a aproximadamente 108 células SPN por mL. Essa correlação foi estabelecida por meio da enumeração de unidades formadoras de colônias (CFUs), determinadas pela diluição serial da cultura em 1x PBS para diminuir a concentração das células bacterianas, permitindo que colônias contáveis possam ser obtidas e por spotting nas placas de ágar BHI, um meio mais enriquecido que o THY.

3. Ensaio de ubiquitinação in vitro a partir de lisado de mamífero

  1. Retire aproximadamente 10células de 7 SPN e lave cuidadosamente pelo menos três vezes com o tampão de reação (200 mM HEPES, 100 mM MgCl2, 1 M KCl e glicerol 5% a pH 7,4) ressuspendendo as bactérias no tampão seguinte, seguido pela centrifugação a 21.000 × g por 5 minutos, e finalmente por pelletagem por centrifugação a 21.000 × g por 5 minutos em temperatura ambiente.
  2. Ressuspenda o pelotão de SPN com lisado de células de mamífero A549 junto com ubiquitina purificada (350 μM) e 1 mM de ATP e incube por 1-2 horas a 27 °C.
    NOTA: Evite congelar e descongelar o lisado celular dos mamíferos. É melhor se o lisado for preparado no mesmo dia do ensaio de ubiquitinação.
  3. Após a incubação, lave as bactérias com um tampão de reação contendo 1 M de ureia uma vez, seguido de duas lavagens apenas com tampão de reação, e fixação com paraformaldeído (PFA) a 1%. Após a fixação, incube as células com PBS contendo glicina (1 mg/mL) por 15 minutos, seguido de duas lavagens de PBS 1x.
    NOTA: Um lavado de ureia de 1 M é usado para interromper levemente as interações não covalentes, garantindo que apenas bactérias covalentes ubiquitinadas permaneçam. Depois, é importante lavar cuidadosamente com tampão de reação para remover a ureia residual, pois sua presença pode interferir no ensaio de morte in vitro .
    Como controle negativo, prepare toda a mistura de reação e incube-a com bactérias sobre gelo para inibir a atividade enzimática. Logo após a incubação, enxágue a amostra e depois fixe usando 1% de PFA para manter a condição da reação.

4. Ensaio de ubiquitinação in vitro a partir do complexo enzimático E1-E2-E3

  1. Prepare primeiro uma mistura de reação composta por ubiquitina (350 μM), UBE1 (400-800 nM), UbE2C (3-5 μM), complexo Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (500 nM) e 2 mM de ATP em tampão de reação (200 mM HEPES, 100 mMMgCl2, 1 M KCl e 5% glicerol a pH 7,4), para obter o volume total de reação de 100-150 μL.
    NOTA: Armazene todas as enzimas a -80 °C. Para evitar perder atividade em múltiplos ciclos de congelamento-descongelamento, crie pequenas aliquotas e utilize novas para cada reação de ubiquitinação.
  2. Ressuspenda as bactérias (10,7 UFC) nessa mistura de reação contendo ubiquitina e incube por 2 horas a 27 °C. Em seguida, lave as bactérias com tampão de reação contendo 1 M de ureia por pelo menos 3 vezes, seguido de fixação com paraformaldeído (PFA) a 1%. Após a fixação, incube as células com PBS contendo glicina (1 mg/mL) por 15 minutos, seguido de duas lavagens de PBS 1x.
    NOTA: Se houver perda excessiva de células, pode-se reduzir o número de lavagens.

5. Visualização de bactérias ubiquitinadas

  1. Após fixar a amostra com 1% de PFA, incube-a em 3% de BSA por 1 hora a 27 °C, depois realize duas lavagens com 1x PBS.
  2. Ressuspenda as bactérias ubiquitinadas usando um anticorpo primário em concentrações maiores do que aquelas normalmente utilizadas em ensaios de imunofluorescência. Use um anticorpo específico para bactérias junto com um anticorpo antiubiquitina (1:100), diluído em PBS contendo 1% de BSA, para coloração a 27 °C por 1 hora.
    NOTA: Para uma coloração de anticorpos ideal, use um tubo centrífugo de baixa ligação a proteínas para minimizar a perda de anticorpos ou uma concentração de anticorpos mais alta para obter os melhores resultados.
  3. Em seguida, lave as bactérias duas vezes com 1x PBS e depois resuspenda-as com o anticorpo secundário correspondente conjugado com Alexa Fluor 488 e 555, respectivamente, por 1 hora a 27 °C.
  4. Aplique cerca de 10-20 μL da amostra bacteriana marcada por drop casting e misture 5-10 μL de meio de montagem com ou sem DAPI, depois coloque uma capa sobre e use papel de seda para absorver o excesso de líquido. Por fim, observe a amostra sob um microscópio confocal no mesmo dia.

6. Expressão e purificação de proteínas

  1. Para a expressão do tipo selvagem VCP/p97, transforme o plasmídeo pET28a contendo VCP na cepa BL21-DE3 de E. coli via um protocolo padrão de transformação de E. coli 20. Colônias incubadas se formaram após a transformação durante a noite no caldo Luria (LB) a 37 °C. No dia seguinte, inocule a cultura 1:50 em um frasco bem aerado contendo LB e deixe que cresça até que OD600 nm atinja 0,7-0,8. Adicione 200 μM de IPTG à cultura e incube por 5 horas a 37 °C com agitação a 180 rpm; confirmar a expressão proteica usando uma SDS-PAGE.
    NOTA: Durante toda a etapa de crescimento e expressão bacteriana, a Canamicina (50 μg/mL) foi usada como pressão de seleção.
  2. Para a expressão do UFD1 selvagem, transforme o plasmídeo pET41b contendo UFD1 na cepa BL21-Rosetta de E. coli via protocolo padrão de transformação de E. coli 20. Colônias incubadas se formaram após a transformação durante a noite no caldo Luria (LB) a 37 °C. No dia seguinte, inocule a cultura 1:50 em um frasco bem aerado contendo LB e deixe que cresça até que OD600 nm atinja 0,7-0,8. Adicione 1 mM de IPTG à cultura e incube por 5 horas a 37 °C com agitação a 180 rpm; confirmar a expressão proteica usando uma SDS-PAGE.
  3. Para expressar NPLOC4 do tipo selvagem, introduza o plasmídeo pET41b contendo NPLOC4 na cepa BL21-Rosetta de E. coli usando o método padrão de transformação de E. coli 20. Incube as colônias que surgem da transformação no caldo Luria (LB) durante a noite a 37 °C. No dia seguinte, transfira uma diluição 1:50 da cultura para um frasco bem aerado cheio de LB, e deixe-o crescer até que a densidade óptica em OD600 nm atinja 0,7-0,8. Depois disso, adicione 1 mM de IPTG à cultura e continue a incubação por 16 horas a 18 °C enquanto agita a 180 rpm; verificar a expressão proteica realizando uma análise SDS-PAGE.
    NOTA: Durante toda a etapa de crescimento e expressão bacteriana realizada na cepa E. coli BL21-Rosetta, Kanamicina (50 μg/mL) e Cloranfenicol (20 μg/mL) foram usadas como pressão de seleção. Sequências de pET28a-p97 e pET41b-NPLOC4 são fornecidas no Arquivo Suplementar 1.
  4. Após a expressão proteica, centrifuge as células bacterianas a 21.000 × g por 10 minutos e ressuspenda o pellet em tampão de lise contendo 50 mM de Tris-Cl, 300 mM de NaCl, 5 mM β-mercaptoetanol, 1 mM de PMSF, 5% de glicerol e pH 8.
  5. Sonice as células por 1 h usando uma sonda estreita (diâmetro de ponta, 6 mm) com amplitude de 50 μm, e com um pulso de 20 segundos ligar/desligar a 4 °C. Faça pellets nos detritos usando 15.000 × g por 1 hora e colete o sobrenadante.
    NOTA: A sonicação total foi realizada por 1 h (30 min ON e 30 min OFF como pulsos de 20 s), e o processo continuou até que a suspensão da célula turva se tornasse translúcida para transparente. Centrifugação em alta velocidade é necessária para garantir que os detritos celulares permaneçam em pellets e não se soltem durante a carga do lisado na coluna de purificação de proteínas.
  6. Passe o sobrenadante por um filtro de 0,4 μm e carregue-o na coluna recheada com esferas de Ni-NTA para purificação de afinidade, pré-equilibrado com tampão de purificação (50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoetanol, 5% glicerol, pH 8).
  7. Enxágue a coluna rica em proteínas usando tampão de lavagem que contenha 50 mM de Tris-Cl, 300 mM de NaCl, 5 mM de β-mercaptoetanol, 5% de glicerol, pH 8 e 30-60 mM de imidazol de aproximadamente 400 mL, e então elue a proteína com um tampão de elução que inclui 50 mM de Tris-Cl, 300 mM de NaCl, 5 mM β-mercaptoetanol, 5% de glicerol, pH 8 e 250 mM de imidazol.
    NOTA: A concentração de imidazol e o volume de lavagem podem variar de acordo com a proteína específica analisada. Para avaliar a pureza, deve ser realizado o SDS-PAGE. É essencial lavar a coluna cuidadosamente até que o eluente apresente uma reação negativa com o reagente de Bradford. A fração eluída apresenta uma faixa proeminente e concentrada da proteína alvo, que deve representar predominantemente a amostra, com apenas pequenos traços, se é que houver, de outras proteínas.
  8. Reúna várias frações, analise-as com SDS PAGE para identificar quais frações contêm as proteínas puras e, em seguida, realize uma troca de tampão para o tampão de reação (200 mM HEPES, 100 mM MgCl2, 1 M KCl e 5% glicerol a pH 7,4) utilizando uma coluna PD-10.
    NOTA: Meça a concentração de proteína usando o Reagente Bradford (Coomassie Brilliant Blue G-250). Todas as proteínas devem ser congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C.

7. Ensaio in vitro para matar bactérias

  1. Combine 6 μM de VCP/p97 com 1 μM de NPLOC4 e UFD1, depois preencha o volume com buffer de reação para aproximadamente 90 μL. Permita que essa mistura de reação incube no gelo por 2 horas.
  2. Adicione 1-2 mM de ATP à mistura da reação que inclui p97-UFD1-NPLOC4, e então combine com o SPN ubiquitinizado (107 células) por uma duração de 2 horas a 37 °C.
  3. Para avaliar a viabilidade bacteriana, imediatamente após o tratamento, retire uma alíquota de 1 μl da mistura da reação, realize uma diluição serial (1:1, 1:10, 1:100 e 1:1000) e coloque 10-2 μL de cada diluição nas placas de ágar de Infusão Cérebro-Coração (BHI). Repita esse procedimento usando uma alíquota de 1 μL da reação após 2 horas de incubação.
    NOTA: Identifique todas as diluições para melhores resultados.
  4. Avalie as unidades formadoras de colônias (CFUs) entre os pontos de 0 h e 2 h. Calcule a viabilidade bacteriana (%) dividindo a contagem de UFC em 2 h pela contagem de UFC em 0 h, depois multiplicando o resultado por 100.
    NOTA: Para obter resultados mais confiáveis, utilize VCP/p97 desnaturado por calor, VCP/p97 sem o complexo de cofator UFD1-NPLOC4, ou uma variante deficiente em ATPase do VCP/p97 para comparação como controle negativo.

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Resultados

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Nosso protocolo detalha a utilização de células A549 de mamíferos para produzir um lisado celular rico nos componentes necessários para iniciar um processo de ubiquitinação (Figura 1A). Esse lisado, seja em estado concentrado ou substituído por componentes purificados como UBE1 (a enzima ativadora da ubiquitina E1), UbE2C (uma enzima conjugante da ubiquitina) e o complexo Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (a ligase E3 da ubiquitina), é misturado com ubiquitina purificada ...

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Discussão

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Embora o sistema de reconstituição in vitro detalhado aqui ofereça uma estrutura robusta para explorar as complexidades moleculares da ubiquitinação e eliminação bacteriana, várias limitações significativas devem ser consideradas. A dependência de concentrações suprafisiológicas de proteínas purificadas, que compreendem a maquinaria de ubiquitinação (ligases E1, E2, E3, ubiquitina) e o complexo efetor-hospedeiro (VCP/p97, UFD1, NPLOC4), oferece insights mecanicistas chave sobre ...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

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Expressamos nossa gratidão à Instalação de Bio-Segurança Nível 2 e à Instalação de Microscopia Confocal do IIT Bombay. Sourav Ghosh. (17/06/2018(i) EU-V), Sumit Rakshit (221610197857) e Udit Kumar Das (24D0061) receberam bolsas do CSIR, UGC, Governo da Índia e IIT Bombaim, respectivamente. Anirban Banerjee recebeu financiamento para pesquisa do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia, Governo da Índia (Subvenção Número SPR/2019/000808) e da Ignite Life Science Foundation (Bolsa Número IGNITE/FG-OC/2021/004). Os órgãos financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cocktail inibidor de protease 50XPromega G6521
6x-His-UbiquitinUBPBioE1100
Linha celular A549  ATCCATCC CCL-185
Alexa Fluor 488InvitrogenA21202 
Alexa Fluor 555InvitrogenA-31572   
Anticorpo anti-ubiquitinaEnzoBML-PW8810-0100
Anti-Ubiquitina K48-específico, anticorpo clone Apu2Sigma AldrichZRB2150
ATPSigma AldrichA6419
BHIHiMedia M210
DMEM (glicose alta)HiMedia AL251
FBSGibco (origem nos EUA)38220090
GlicerolPureSynth PSR37325
HEPESSigma AldrichH4034-100G
KClSigma AldrichP3911
MgCl2Sigma AldrichTC006
Paraformaldeído Sigma AldrichE6148
Plasmídeo pET28a-p97Nosso laboratórioPlasmídeo disponível mediante solicitação
Plasmídeo pET41b-NPLOC4Nosso laboratórioPlasmídeo disponível mediante solicitação
Plasmídeo pET41b-UFD1AddgenePlasmídeo #117107
Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 Sigma Aldrich23-030
Cepa R6 de Streptococcus pneumoniaeATCCATCC BAA-255Patógeno do Grupo de Risco -2, a ser tratado na instalação BSL-2
Pó de caldo Todd HewittHiMedia M313
UBE1UBPBioB1100
UbE2CUBPBioC1300
UreiaHiMedia MB032
Pó de extrato de levedura  HiMedia RM027

Referências

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