Artigo de método

Microfabricação de substratos com gradientes de rigidez em microescala para guiar a migração de células estromais da medula óssea

DOI:

10.3791/69473

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14 de novembro de 2025

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1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Key Laboratory of Oral Biomedicine Ministry of Education, Hubei Key Laboratory of Stomatology, School & Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2School of Power and Mechanical Engineering, The Institute of Technological Science, Wuhan University, 3Department of Oral Implantology, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo detalha a fabricação de um substrato de polidimetilsiloxano (PDMS) de bicamada por meio de litografia suave. O método utiliza microestruturas geometricamente moduladas em uma camada inferior rígida combinada com uma camada superior plana macia para gerar gradientes de rigidez efetivos em microescala, permitindo estudos de mecanobiologia celular sem interferência topográfica.

Resumo

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Compreender como as células respondem a sinais mecânicos é crucial para elucidar os mecanismos envolvidos no desenvolvimento tecidual e na progressão da doença. No entanto, os substratos de cultura de células in vitro existentes muitas vezes não conseguem replicar os gradientes de rigidez fisiológica na escala celular, ao mesmo tempo em que eliminam pistas topográficas confusas. Neste estudo, apresentamos um modelo de rigidez desacoplado utilizando um substrato de polidimetilsiloxano de bicamada (PDMS). Este substrato consiste em um filme macio e plano suspenso sobre uma camada inferior rígida com microestruturas de crista e ranhura. A camada superior transmite efetivamente as variações de rigidez na estrutura subjacente, mantendo a topografia e a química uniformes na superfície de contato da célula. A modulação da rigidez é obtida variando a largura das cristas e ranhuras alternadas, que são espaçadas igualmente. A microscopia eletrônica de varredura confirmou a morfologia da superfície plana e a topografia de contato consistente. A microscopia de força atômica demonstrou que as variações de rigidez eram dependentes da microestrutura: para padrões de 20 μm, os módulos elásticos eram de aproximadamente 950 kPa para cristas e 850 kPa para ranhuras; para padrões de 50 μm, esses valores foram em torno de 1070 kPa e 950 kPa, respectivamente. As células primárias da medula óssea de camundongos aderiram bem e se espalharam no substrato, mostrando uma preferência pela localização nuclear em direção às regiões mais rígidas da crista no padrão de 50 μm (61,49%, p < 0,05), confirmando assim a percepção celular efetiva do gradiente mecânico. Em resumo, este protocolo oferece um método reprodutível para construir um substrato de cultura celular com gradientes de rigidez em microescala, minimizando a interferência química ou topográfica, permitindo investigações sobre a mecanotransdução celular.

Introdução

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As células têm a capacidade de sentir e responder a estímulos mecânicos dentro de seu microambiente externo 1,2,3, que são cruciais para regular vários processos celulares, incluindo adesão, migração, proliferação e diferenciação4. In vivo, as propriedades mecânicas do microambiente tecidual exibem significativa heterogeneidade espacial, com variações na rigidez da matriz observadas tanto em contextos fisiológicos - como nas junções de osso e músculo - quanto em condições patológicas, como dentro de tumores 5,6,7. Uma investigação abrangente desses fatores mecânicos é essencial para entender os mecanismos regulatórios que governam o comportamento celular. Esses mecanismos são fundamentais em processos como desenvolvimento tecidual, progressão da doença e processo de regeneração e reparo 8,9.

Para simular esse microambiente mecânico complexo in vitro, hidrogéis ou elastômeros são amplamente utilizados para criar substratos com rigidez variável, ajustando o grau de reticulação ou a proporção de componentes 3,10,11,12,13. No entanto, esses métodos geralmente resultam em mudanças discretas de rigidez que não conseguem reproduzir os gradientes de rigidez contínuos em microescala que imitam com precisão as condições fisiológicas 13,14,15,16,17. Estudos recentes exploraram técnicas como reticulação óptica (por exemplo, usando uma fotomáscara para regular a exposição aos raios UV)18, mistura multicanal microfluídica19,20 e meios acionados por difusão21 para construir gradientes de rigidez. Infelizmente, essas abordagens podem ser tecnicamente complexas e introduzir variáveis adicionais, como tamanho damalha22, inchaço23,24 e topografia25. A introdução de fatores de perturbação complica a interpretação das respostas celulares à rigidez. Um sistema PDMS de bicamada, utilizando matrizes de micropilares ou padrões quadriculados como estrutura de suporte, foi adotado para criar substratos de cultura de células com gradientes de rigidez26,27. Essas abordagens dependem de suportes subjacentes discretos sob uma membrana quimicamente homogênea para obter modulação de rigidez isotrópica, fornecendo plataformas valiosas para investigar a adesão e disseminação celular. No entanto, o microambiente celular nativo in vivo é frequentemente altamente anisotrópico em suas propriedades mecânicas28,29. Postula-se que essa sinalização mecânica direcional influencie profundamente os eventos biológicos fundamentais. Portanto, as estratégias atuais de biofabricação são limitadas em sua capacidade de replicar as interações sutis de rigidez celular observadas in vivo, que dependem de imitar com precisão os gradientes de rigidez em microescala e a heterogeneidade espacial dentro de substratos carregados de células.

Pesquisas anteriores demonstraram que as células podem perceber a rigidez efetiva de objetos rígidos mesmo quando não estão em contato celular direto30. Com base neste estudo, introduzimos um novo substrato de cultura de células de polidimetilsiloxano (PDMS) de bicamada que gera gradientes de rigidez controlados em escalas espaciais que variam de 5 a 50 μm, alinhando-se com a faixa de tamanho relevante para mecanosense subcelular e de célula única. O substrato consiste em duas camadas distintas: uma camada inferior rígida de PDMS com microestruturas geométricas ajustáveis e uma camada de sobrecamada de PDMS uniforme e plana que serve como superfície de contato com a célula. Este projeto permite a modulação mecânica apenas por meio de variações na geometria da subestrutura, mantendo a química e a topografia de superfície consistentes. Consequentemente, ele efetivamente desacopla o sinal de rigidez de outras pistas físicas e químicas, oferecendo um sistema mais biologicamente relevante para a modulação da rigidez.

Em contraste com os substratos tradicionais à base de hidrogel, nossa abordagem permite estudos mecânicos de variável única sem interferência de inchaço, tamanho da malha ou topologia da superfície. O substrato é fácil de fabricar usando litografia macia padrão e é altamente reprodutível31. Também é compatível com microscopia de alta resolução, o que o torna particularmente adequado para imagens em tempo real e estudos quantitativos de respostas celulares a sinais de rigidez em microescala. Este manuscrito apresenta o protocolo de fabricação completo, detalha a estratégia de controle de parâmetros e demonstra a utilidade do substrato com experimentos representativos de cultura de células. Em última análise, essa abordagem fornece uma ferramenta in vitro robusta e acessível para explorar as respostas celulares a um gradiente de rigidez em microescala.

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Protocolo

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Células estromais primárias da medula óssea de camundongos (mBMSCs) foram isoladas da tíbia e fêmur de camundongos (No. WP20230204, aprovado pelo Comitê de Ética do Centro de Experimentação Animal da Universidade de Wuhan).

1. Preparação do molde mestre

NOTA: Nossos protocolos são específicos para fotorresistentes negativos à base de epóxi usados durante esta pesquisa.

  1. Colocar duas placas de silício limpas (50,8 ± 0,2 mm, <100> orientadas, 525 ± 25 μm) na placa de aquecimento durante alguns minutos para desidratar.
  2. Pegue um wafer de silício da placa de aquecimento e resfrie-o até a temperatura ambiente antes de prosseguir com o revestimento de centrifugação. Aplique 3-5 mL de fotorresistente no centro do wafer.
  3. Para obter uma altura de característica de 20 μm, aplique o seguinte protocolo de rotação: rotação por 10 s a 7,1 × g, seguida de rotação a 410 × g por 30 s. Para obter uma altura de característica de 30 μm, aplique o seguinte protocolo de rotação: rotação por 10 s a 7,1 × g, seguida de rotação a 170 × g por 30 s. Use um bisturi com cuidado para remover qualquer cordão de borda que possa se formar durante o revestimento giratório.
  4. Asse suavemente da seguinte maneira: coloque a placa de aquecimento em 95 °C, deixe o wafer descansar na placa quente por 13 min. Retire o wafer da placa de aquecimento e deixe-o arrefecer naturalmente até à temperatura ambiente, evitando uma queda brusca de temperatura.
  5. Alinhe a fotomáscara no wafer revestido com fotorresistência e exponha à luz ultravioleta com uma dose total de 120 mJ/cm2.
  6. Cozer a pós-exposição da seguinte forma: utilizando duas placas de aquecimento (65 °C e 95 °C), deixar a bolacha revestida com fotorresistência assentar na placa de aquecimento a 65 °C durante 1 minuto antes de a transferir para a placa de aquecimento a 95 °C e deixá-la aí durante 5 minutos. Mova o wafer para uma pilha de tecidos de microfibra e deixe-o esfriar até a temperatura ambiente.
  7. Desenvolva o wafer transferindo-o para uma placa de Petri cheia de PGMEA e mergulhe todo o wafer no revelador. Acelere o desenvolvimento por agitação manual.
    NOTA: O PGMEA é inflamável e irritante para os olhos e o trato respiratório. Descarte-o como "lixo orgânico inflamável" em recipientes dedicados.
  8. Após o desenvolvimento, retire o wafer do revelador e lave-o em isopropanol. Se um fluxo branco leitoso se formar no isopropanol próximo à superfície da amostra (o desenvolvimento não está completo), mergulhe a amostra de volta no revelador novamente para concluir o processo de desenvolvimento. Lave a amostra revelada em isopropanol até que nenhum fluxo branco leitoso se forme perto da superfície da amostra. Depois de totalmente desenvolvido, coze o fotorresistente colocando o wafer numa placa de aquecimento a 150 °C durante 15 min.
  9. Flúor o wafer para os seguintes processos de litografia suave: exponha o wafer ao plasma de oxigênio sob vácuo por 30 s (100 W) para ativar a superfície e, em seguida, coloque-o em um dessecador a vácuo. Coloque 30 μL de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-tridecafluoro-n-octil) silano em uma lâmina de vidro colocada dentro do dessecador a vácuo. Evacue o dessecador por 2 min e mantenha a condição de vácuo por 30 min. Asse o wafer a 90 °C por 1 h para completar o processo de silanização.
    NOTA: Controle rigorosamente a umidade relativa do ambiente abaixo de 60% durante todo o processo. A umidade excessiva pode induzir a hidrólise rápida do silano, o que gera precipitados brancos não voláteis de polissiloxano. Os precipitados prejudicarão a uniformidade da distribuição do vapor de silano, resultando em uma falha na silanização. Realize o tratamento em uma coifa, pois o tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-tridecafluoro-n-octil) silano reage violentamente com a água, liberando vapores tóxicos de HCl. Neutralizar com álcali diluído antes de descartá-lo como resíduo orgânico fluorado/clorado. O processo de silanização atinge uma taxa de sucesso de 90%.

2. Fabricação

NOTA: O processo de litografia suave usado para fabricar o substrato de polidimetilsiloxano bicamada (PDMS) pode ser dividido em duas etapas distintas: 1) A preparação da camada inferior estruturada e da camada superior, 2) a ligação das duas camadas de PDMS. O rendimento geral da fabricação é superior a 80%.

  1. Preparação do PDMS
    1. Para a camada inferior estruturada, preparar o precursor PDMS misturando o pré-polímero e o agente de cura numa proporção de 10:1 em peso, seguido de desgaseificação sob vácuo. Despeje 1,5 mL do precursor PDMS (10:1) no molde mestre SU8, cobrindo toda a superfície, seguido de desgaseificação sob vácuo e repouso por 30 min. Leve-o cuidadosamente ao forno e catalise a 90 °C durante 1 h. Desenforme a camada inferior estruturada do PDMS do molde mestre.
    2. Para a camada superior, preparar o precursor PDMS misturando o pré-polímero e o agente de cura numa proporção de 30:1 em peso e desgaseificação sob vácuo. Despeje o precursor PDMS em um wafer de silício fluorado. Para obter uma espessura de 9 μm, aplique o seguinte protocolo de revestimento por centrifugação: centrifugação a 7,1 × g por 10 s, seguida de centrifugação a 2.300 × g por 60 s.
    3. Após o revestimento giratório, inspecione visualmente o filme PDMS sob luz ambiente para verificar a uniformidade - examinando especificamente se há defeitos visíveis, como listras, bolhas ou acúmulo irregular de bordas. Se o filme parecer uniformemente transparente com refletividade consistente em toda a superfície do wafer, prossiga para a próxima etapa; Caso contrário, repita o processo de revestimento giratório com um novo wafer. Coloque o wafer revestido em uma superfície nivelada para garantir uma espessura de filme PDMS homogênea. Leve-o cuidadosamente ao forno e catalise a 90 °C durante 3 h.
      NOTA: Foram obtidos filmes com espessura de 9,11 ± 0,34 μm.
  2. Ligação
    1. Coloque a camada inferior do PDMS estruturada (10:1) com o lado padronizado voltado para baixo no filme da camada superior do PDMS, garantindo um bom contato entre as duas camadas sem bolhas na interface.
    2. Mover o conjunto para a estufa e catalisar a 90 °C durante 3 h.
    3. Deixe o conjunto esfriar até a temperatura ambiente em uma pilha de tecidos de microfibra. Separe a estrutura final de camada dupla do wafer e armazene em uma placa de Petri para uso posterior.
      NOTA: Se bolhas se formarem entre a camada superior e a camada inferior durante o descascamento, isso normalmente indica adesão incompleta entre as duas camadas. Garanta a desgaseificação completa do precursor PDMS antes do revestimento por centrifugação e verifique se a superfície do filme está livre de poeira ou contaminantes antes da aplicação da camada inferior do PDMS para contato total. Certifique-se de que o wafer de silício esteja nivelado durante o revestimento por centrifugação, montagem e cura. O rasgo do filme pode ocorrer devido à silanização irregular do wafer ou espessura não uniforme do PDMS. Para resolver o problema, controle rigorosamente a umidade ambiental durante a silanização sob 60% de umidade relativa. O processo de silanização atinge uma taxa de sucesso de 90%.

3. Caracterização

  1. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
    1. Corte a amostra com uma lâmina afiada para obter bordas limpas.
    2. Monte as amostras em estágios SEM de 90° e 0° usando fita de carbono condutora para permitir a caracterização transversal e de superfície, respectivamente.
    3. Cubra as amostras com ouro por 120 s para melhorar a qualidade da imagem SEM e coletar imagens SEM das amostras.
  2. Microscopia atômica da força (AFM)
    NOTA: Selecione a sonda ScanAsyst-Air para mapeamento nanomecânico quantitativo do módulo.
    1. Posicione a ponta do modilhão AFM no centro do campo de visão. Posicione o ponto de laser na extremidade do cantilever alinhando o sistema de alavanca óptica.
    2. Antes das medições de Mapeamento Nanomecânico Quantitativo PeakForce (PeakForce QNM), calibre o cantilever AFM para determinar os seguintes parâmetros essenciais: Constante da mola do modilhão: 0,40135 N/m; Sensibilidade de deflexão: 28,993 nm/V (determinada pela execução de uma curva de força em uma amostra de referência rígida); Raio da ponta: ~ 21 nm (calibrado usando o método relativo em relação a uma amostra de referência com módulo conhecido).
    3. No painel Digitalizar da Lista de Parâmetros de Digitalização, defina as seguintes configurações de digitalização inicial: Defina o Tamanho da Digitalização como 70 μm para amostras com listras periódicas com espaçamento de 50 μm. Defina o Tamanho da varredura para 50 μm para amostras com listras periódicas com espaçamento de 20 μm. Defina Amostras/Linha e Linhas como 256 (resultando em uma imagem de 256 x 256 pixels).
    4. Abra as configurações de engate no microscópio e defina o ponto de ajuste de engate de força de pico padrão do instrumento em Parâmetros de engate.
    5. Clique no ícone Engage na barra de ferramentas do fluxo de trabalho e continue monitorando os sinais em tempo real durante a abordagem automatizada.
    6. Certifique-se de que o ScanAsyst Auto Control esteja definido para o modo Individual. Ajuste o ponto de ajuste PeakForce para um valor apropriado para atingir a faixa de deformação desejada: para a camada superior, o ponto de ajuste PeakForce é 0.020 nN; para a camada inferior estruturada, o ponto de ajuste PeakForce é de 5 nN.
    7. Inicie a verificação clicando nos botões de cima para baixo ou de baixo para cima .
    8. Monitoramento e correção da curva de força: se as curvas de força parecerem distorcidas ou forem observados problemas de sincronização (por exemplo, formas irregulares, linhas de base inconsistentes), clique com o botão direito do mouse na janela Monitor de força e selecione Configuração automática para corrigir automaticamente o alinhamento e a sensibilidade da curva de força.
    9. Nas configurações do canal de cálculo do módulo , selecione o modelo DMT para ajustar a parte de retração da curva de força para o cálculo do módulo de elasticidade.
    10. Clique no botão de captura para adquirir e salvar a topografia de alta resolução e o mapa de propriedades nanomecânicas.
    11. Realize análises pós-aquisição usando o software de processamento e análise de imagens AFM. Abra os arquivos de dados salvos do AFM e extraia valores do módulo selecionando regiões através da superfície da amostra; Calcule o módulo médio, o desvio padrão e os perfis de distribuição para a camada superior e inferior usando as ferramentas de análise estatística integradas do software. Exporte mapas de módulos processados e dados quantitativos.
    12. Número de varreduras do AFM pela amostra: Execute três varreduras independentes da completo-área para cada amostra. Certifique-se de que cada varredura cubra uma região correspondente ao tamanho do recurso estrutural da amostra, 70 μm × 70 μm para amostras com listras periódicas espaçadas de 50 μm e 50 μm × 50 μm para aquelas com listras espaçadas de 20 μm. Para medições de módulo da estrutura subjacente (10:1 PDMS) e do filme da camada superior (30:1 PDMS), implemente a seguinte estratégia de amostragem para garantir a confiabilidade dos dados.
      1. Filme da camada superior (30:1 PDMS): meça o módulo 2x independentemente com cada medição consistindo em duas varreduras não sobrepostas de 5 μm × 5 μm.
      2. Estrutura subjacente (10:1 PDMS): Dadas suas duas configurações distintas de faixas periódicas (espaçamento de 20 μm e 50 μm), meça o módulo 2x independentemente para cada configuração.

4. Experiência de cultura de células in vitro

NOTA: O PDMS é um material hidrofóbico que precisa ser revestido para promover a adesão celular antes da cultura celular, e o método de revestimento apropriado deve ser selecionado de acordo com o tipo de célula. A aprovação ética deve ser obtida se as células primárias forem usadas para o experimento celular.

  1. Revestimento de poli-D-lisina (PDL)
    1. Esterilizar o substrato por imersão em álcool por 10 min; em seguida, lave por 3 x 5 min com PBS.
    2. Dissolva o PDL (peso molecular de 150.000 a 300.000 Da) usando PBS na concentração de 0,1 mg / mL. Para o substrato de tamanho de placa de 24 poços, adicione 1 mL de solução de trabalho PDL e coloque-a em uma incubadora a 37 °C por 4 h para revestir totalmente a superfície do substrato.
    3. Após a conclusão do revestimento, remova a solução de trabalho PDL e remova qualquer PDL residual lavando 3x com PBS. Use o substrato para experimentos celulares subsequentes. Se o revestimento não for usado imediatamente, seque-o e armazene-o a 4 °C.
      NOTA: Um revestimento bem-sucedido apresentou uma superfície homogênea e sem características sob microscopia de contraste de fase, sem precipitados cristalinos visíveis ou artefatos de secagem. Substratos com quaisquer sinais de cristalização ou revestimento não uniforme foram descartados.
  2. Isolamento e cultura de células primárias do estroma da medula óssea de camundongos (mBMSCs)
    1. Isole as células estromais primárias da medula óssea de camundongos (mBMSCs) da tíbia e do fêmur de camundongos.
    2. Cultive as células em um meio de crescimento composto por α-MEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% antibiótico-antimicótico e 1% de piruvato de sódio.
    3. Células-semente na passagem 3 para os substratos obtidos na etapa 4.1.3 a uma densidade de 5.000 células/cm2 para minimizar potenciais efeitos de confusão do contato célula-célula.
  3. Coloração e imagem por imunofluorescência
    1. Após 16 h de cultura (37 °C, 5% CO2), fixe as células com paraformaldeído a 4% por 10 min em temperatura ambiente e lave 3x com PBS. Em seguida, permeabilize as células com 0,1% de Triton X-100 por 15 min em temperatura ambiente e lave 3x com PBS.
    2. Para visualização do citoesqueleto, core a F-actina usando faloidina (diluição 1:500) por 20 min em temperatura ambiente e lave 3x com PBS amplo para remover qualquer corante residual.
    3. Monte o substrato com coloração simultânea dos núcleos celulares. Aplique uma gota de glicerina com DAPI para cobrir as células. Em seguida, coloque cuidadosamente uma lamínula em cima do substrato e sele as margens com esmalte. Evite bolhas o máximo possível.
    4. Adquira imagens de fluorescência capturando a morfologia celular e o posicionamento nuclear usando um microscópio de fluorescência invertida.

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Resultados

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A fotolitografia foi usada para fabricar moldes mestres de silício reutilizáveis com microestruturas paralelas de cumeeira e ranhura. Dois projetos foram criados, com largura de ranhura (a largura da crista é idêntica à largura da ranhura) de 20 e 50 μm, respectivamente. Cada área padronizada media 7 mm × 7 mm. A precisão e a reutilização dos moldes de silicone simplificaram significativamente o processo de fabricação repetida de substratos. O molde mestre foi então usado para replicar as microestruturas no PDMS. Uma for...

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Discussão

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Este estudo apresenta uma nova abordagem para projetar um substrato baseado em PDMS de bicamada projetado para introduzir variações de rigidez localizadas, mantendo uma superfície topograficamente uniforme e sem características. Essa abordagem permite a modulação mecânica apenas por meio de variações na geometria da subestrutura, mantendo a química e a topografia de superfície consistentes. Consequentemente, ele efetivamente desacopla o sinal de rigidez de outras pistas físicas e química...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este estudo foi apoiado financeiramente pelos Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais da China (nº 2042024YXB018 para W. Ji).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
  4% de paraformaldeídoTecnologia ServicebioG1101
AcetonaShanghai Aladdin10000418
Anti-AntiGibco15240-062Antibiótico-Antimicoótico
Meio de Montagem Antifade com DAPIBeyotime BiotecnologiaP0131glicerina com DAPI 
Placa de Cultura CelularNINHO70200124 poços
AaronSichuan Shubo (Group) Co., Ltd913354-30SNDiâmetro interno=180mm
Soro Fetal BovinoHyCloneSV30208.02
Microscópio de fluorescência invertidaOlimpoDP74
IsopropanolShanghai Aladdin80109218GC≥ 99.7%
Alinhador de máscaraSichuan Nanguang Vacuum Technology Co., LtdH94-37
Modificação do MEM AlphaHyCloneSH30265.01
Análise por NanoscópioBrukerVersão 3.0Software de processamento e análise de imagens AFM.
Sistema de Imagem de Alto Conteúdo Opera Phenix PlusPerkin Elmer2400L23248 Equipado com objetivo aéreo 10x
PGMEASuzhou NanoMicro Technology Co., Ltd171011-1Revelador Fotorresiste Negativo; ESPECIFICAÇÃO: UL; Percentual: min99,7%
FaloidinaUelandy YP0052L594-Faloidina
Solução salina tamponada com fosfatoHyCloneSH30256.01
Purificador de plasmaTecnologia de plasma (Alemanha)Flecto 10 
Poli-D-lisinaBeyotime BiotecnologiaST508Número CAS 27964-99-4
Microscópio de Sonda de VarreduraBrukerÍcone de DimensãoUtiliza software de controle de nanoscópio, incluindo os espaços de trabalho experimentais PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM) e Point-and-Shoot Ramping.
Ponta de Silício na Alavanca de NitruetoBrukerSCANASYST-AIRA sonda possui um único baldeador em forma de V, revestido ao reflexo de Al; k= 0,4 N/m (nominal), f0 = 70 kHz.
Pastilhas de silícioShenzhen Rigorous Technology Co., Ltd-50,8 e mais; 0,3mm de diâmetro, (100) orientado, 525± 25 & mu; M espessura
Piruvato de SódioGibco11360-070
Revestimento de fiaçãoInstituto de Microeletrônica da Academia Chinesa de CiênciasKW-4A
SU-8 3025Suzhou NanoMicro Technology Co., Ltd-Fotorresiste Negativo; 72,3% de sólidos; Viscosidade 4400; Densidade 1,143g/ml
SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitA Dow Chemical Company01673921
Tricloro(1H,1H,2H,2H-tridecafluoro-n-octil)silanoShanghai Aladdin78560-45-9
Triton X-100BioFroxx1139ML1000,1% Triton X-100 para permeabilização
Tripsina-EDTAGibco25200-0720,25% Tripsina-EDTA (1x)
Forno a vácuoMemmert (Alemanha) VO 200 

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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