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Procedimento de Amostragem Baseada em Fio Vermelho de Fenol para Lipidômicos de Fluido Lagrimal Não Alvo na Descoberta de Biomarcadores

DOI:

10.3791/69474

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December 12th, 2025

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1Centre for Myopia Research, School of Optometry, The Hong Kong Polytechnic University, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR), 3Department of Food Science and Nutrition, The Hong Kong Polytechnic University, 4Research Centre for SHARP Vision (RCSV), The Hong Kong Polytechnic University, 5Department of Applied Biology and Chemical Technology, The Hong Kong Polytechnic University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um protocolo clínico único para coleta de amostras de fluido lacrimógeno humano usando fios vermelhos de fenol e fluxo de trabalho baseado em cromatografia líquida-espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS) para descobrir o perfil lipidômico das lágrimas. O método simples de separação bifásica entre metil-tert-butil (MTBE)/metanol permite a extração rápida de lipídios lacrimais com alta recuperação para descoberta de biomarcadores rasgantes.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os lipídios lacrimais são cruciais para a estabilidade do filme lacrimal e para a saúde da superfície ocular. Alterações na composição das lágrimas podem estar associadas a doenças oculares e sistêmicas, como disfunção das glândulas de Meibômio e dislipidemia. O perfil dos lipídios lacrimais pode ajudar na descoberta de biomarcadores para diagnóstico e manejo da doença. No entanto, métodos comuns de amostragem de lágrimas apresentam limitações distintas: as tiras de Schirmer frequentemente causam irritação ocular e desconforto devido à sua grande área de contato com a superfície ocular, enquanto a coleta de tubos microcapilares pode resultar em baixa reprodutibilidade devido à variabilidade do operador, especialmente quando realizada por diferentes pessoas. Essas limitações podem comprometer a precisão e a consistência dos dados lipidômicos. Este estudo apresenta um método de amostragem minimamente invasivo baseado em fio vermelho de fenol (PRT), otimizado para lipidômica de lágrimas. A estrutura fina da PRT minimiza o risco de irritação ocular e permite a coleta rápida e suave das lágrimas. Este método fácil de usar e fácil de usar é adequado para indivíduos com menor volume lacrimal ou menor tolerância à sensação de corpos estranhos, e permite uma coleta de amostras mais reprodutível ao reduzir a variabilidade dependente do operador. Os lipídios lacrimais coletados pela PRT foram extraídos usando um protocolo otimizado de separação de fase metanol/metil tert-butílico (MTBE) e analisados por MS/MS de alta resolução LC-Orbitrap-IQX MS/MS com o software LipidSearch. O fluxo de trabalho identificou mais de 700 espécies únicas de lípidos lacrimais, cada uma caracterizada por íons produto derivados de ácidos graxos específicos. Esses resultados indicam que a amostragem baseada em PRT proporciona uma recuperação robusta de lipídios para análise de lipidômicos rasgais. Essa abordagem minimamente invasiva e reprodutível oferece uma plataforma prática para pesquisas clínicas e experimentais sobre lípidos lacrimais. Em última análise, isso também pode facilitar a descoberta de biomarcadores e o monitoramento de doenças.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O filme lacrimal é a barreira mais externa que protege a superfície ocular contra patógenos e mantém a homeostase ocular 1,2, enquanto a camada lipídica no filme lacrimal é o componente chave para prevenir a evaporação e manter a estabilidade do filmelacrimal 3,4. A desregulação da composição dos lipídios lacrimais tem sido associada a várias doenças oculares, incluindo doença do olho seco (DED), disfunção das glândulas de Meibômio (MGD) e conjuntivite alérgica 5,6,7,8. Como resultado, a caracterização detalhada dos lipidômicos lacrimais tornou-se uma direção crítica e em tendência para uma compreensão mais abrangente das patologias moleculares subjacentes a essas condiçõesoculares.

Embora a abordagem lipidômica de lágrimas tenha grande importância clínica, um desafio crítico na lipidômica lacrimal é estabelecer um fluxo de trabalho padronizado e reprodutível de coleta e análise. Os métodos atuais de amostragem de lágrimas, as tiras de Schirmer e o tubo microcapilar, apresentam limitações distintas. As tiras de Schirmer têm uma grande área de contato com a superfície ocular, o que frequentemente causa irritação ocular e rasgamentoreflexo 9,10. Em comparação, a coleta de tubos microcapilares depende fortemente da técnica do operador e pode gerar resultados inconsistentes quando realizada por diferentes profissionais11. Além disso, o uso inadequado dessas ferramentas de amostragem também pode trazer risco de lesão na superfície ocular. Essas limitações podem comprometer a precisão e a reprodutibilidade dos dados a jusante12,13. Além disso, métodos de coleta de lágrimas que exigem procedimentos complexos de manuseio podem limitar sua acessibilidade e padronização em diferentes laboratórios e ambientes clínicos. Portanto, há uma necessidade urgente de estabelecer um fluxo de trabalho de coleta e processamento de lágrimas não invasivo, robusto e reproduzível que possa preservar o perfil nativo de lípidos lacrimais.

Estudos recentes destacaram a utilidade do fio vermelho de fenol (PRT) para análises de fluxos de trabalho LC-MS/MS a jusante em aplicações proteômicas emetabolômicas 14,15. O PRT oferece vantagens inerentes como ferramenta de coleta de lágrimas. Sua estrutura fina, natureza minimamente invasiva e procedimento simples de amostragem podem minimizar a complexidade técnica e reduzir a variabilidade dependente do operador, sendo bem tolerados pela maioria dossujeitos 14,16. No entanto, ainda não foi estabelecido um fluxo de trabalho padronizado especificamente para análise lipidômica de lágrimas baseada em PRT.

Esse protocolo introduz um fluxo de trabalho integrado para lipidômica de lágrimas reproduzíveis: um método de coleta de lágrimas baseado em PRT amigável para o usuário, adaptado para análise de lipídios, um protocolo otimizado de extração de metil-tert-butil éter (MTBE)/metanol lipídico com razões solvente-amostra definidas e controlesde armazenamento 17,18, e um método modificado de identificação lipídica usando LC-MS/MS de alta resolução. Essa abordagem padronizada permite um perfil lipidômico rasgante consistente para a descoberta de biomarcadores a jusante e caracterização da doença. Além disso, é especialmente adequado para indivíduos com baixo volume lacrimal ou tolerância reduzida à sensação de corpos estranhos (Figura 1).

figure-introduction-1
Figura 1: Visão geral esquemática do fluxo de trabalho baseado em Phenol Red Thread (PRT) para lipidômica de lágrimas humanas. O fluido lacrimal é coletado de participantes utilizando a abordagem PRT, que permite a obtenção consistente de amostras com desconforto mínimo. O processamento da amostra envolve extração bifásica sequencial de MTBE/metanol, concentração mediada por SpeedVac e reconstituição de extratos de lipídios lacrimais para cromatografia líquida-espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS). Perfis lipidômicos são posteriormente adquiridos via LC-MS/MS e submetidos a anotação e identificação usando o software LipidSearch. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade Politécnica de Hong Kong. Os participantes forneceram consentimento informado por escrito antes de participar do estudo. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Coleta de fluido lacrimógeno humano à base de Fio Vermelho de Fenol (PRT)

  1. Use luvas e desinfete a estação de trabalho para evitar contaminação da amostra.
  2. Certifique-se de que o pacote do PRT está lacrado e não vencido antes de abri-lo.
  3. Segure a rosca pela ponta oposta ao gancho dobrado. Sempre evite tocar na metade do gancho dobrado do PRT.
  4. Peça ao sujeito para olhar na direção nasal superior.
  5. Puxe suavemente a pálpebra inferior do sujeito para baixo e insira a PRT com o gancho dobrado posicionado na conjuntiva palpebral temporal inferior, próximo ao canto externo do olho do sujeito (Figura 2).

figure-protocol-1
Figura 2: Posição do fio vermelho de fenol durante a coleta de lágrimas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

  1. Peça ao sujeito que feche os olhos suavemente e incline levemente a cabeça para frente para evitar que o PRT toque sua pele facial.
    NOTA: A lágrima absorvida induziria gradualmente uma frente de corante vermelha, indicando a região amostrada da PRT devido ao fenol vermelho sensível ao pH. Para garantir fluido lacrimal suficiente para análise lipidômica, a coleta de volume lacrimal equivalente a 50 mm de PRT é preferível, normalmente realizada em 2 minutos.
  2. Puxe suavemente a pálpebra inferior do sujeito para baixo e retire o PRT amostrado. Evite tocar na região amostrada.
  3. Registre o comprimento da região amostrada do PRT e transfira o PRT para um novo tubo de amostra com o auxílio de pinças estériles.
    NOTA: Se o comprimento do PRT amostrado for <50 mm, peça gentilmente ao sujeito que descanse por 1-3 minutos e repita a coleta com o mesmo olho. Transfira cada PRT amostrado para um tubo de amostra separado.
  4. Rotule e tampe corretamente os tubos da amostra.
  5. Limpe as luvas e as pinças cuidadosamente com metanol e limpe lenços de papel para remover resíduos de lágrimas ou contaminantes, e depois deixe secar.
  6. Repita os passos 1.2-1.10 para o outro olho.
  7. Sele os tubos da amostra com parafilme e armazene imediatamente a -20°C para armazenamento temporário ou -80°C para armazenamento a longo prazo. Evite ciclos desnecessários de congelamento e descongelamento e proteja o PRT amostrado da luz.

2. Processamento de PRT amostrado

  1. Pré-lave a microtesoura com metanol antes de processar os PRTs.
  2. Descarte a extremidade curvada do gancho (ou seja, os primeiros 3 mm) dos PRTs (Figura 3).

figure-protocol-2
Figura 3: Aparência física da linha vermelha de fenol (PRT). (A) PRT não utilizada com extremidade do gancho curvada. (B) Utilizou PRT com a seção indicada cortada e coletada para extração lipídica. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

  1. Corte a região amostrada do PRT (ou seja, a região acima da frente do corante vermelho fenol) em pedaços de 2 mm e transfira esses pedaços para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL tolerante a solventes orgânicos.

3. Separação bifásica MTBE/metanol para extração lipídica a partir de PRT amostrado

ATENÇÃO: MTBE e metanol são inflamáveis e voláteis. Use em uma área bem ventilada ou exaustor de fumo. Evite chamas abertas e faíscas. Use luvas e jaleco. Lave as mãos após o manuseio.

  1. Coloque as amostras no gelo.
  2. Adicione 232 μL de metanol gelado (grau MS) a cada amostra e vórtice por 15 segundos.
  3. Sonice as amostras em um limpador ultrasônico pré-resfriado por 15 minutos.
  4. Adicione 774 μL de MTBE (grau HPLC) e 194 μL de água desionizada a cada amostra e vórtice por 15 segundos. A razão volumosa resultante de MTBE:metanol:água na amostra deve ser 4:1,2:1 (v/v/v).
  5. Sonice as amostras novamente em um limpador ultrassônico pré-resfriado por 15 minutos.
  6. Incube a amostra no termomisturador por 8 horas a 4 °C, com agitação a 1.200 rpm.
  7. Deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 10 minutos.
  8. Centrifuge as misturas resultantes a 10.000 × g por 10 minutos a 4 °C.
  9. Após a centrifugação, as misturas são separadas em duas fases (Figura 4).
    NOTA: Após a conclusão da separação de fase, inspecione a amostra em busca de duas camadas distintas: a fase orgânica superior (rica em MTBE) deve parecer transparente com uma leve opacidade leitosa, enquanto a fase aquosa inferior apresenta coloração amarela atribuível à presença de indicador vermelho fenol. Prossiga somente se essas características de fase forem observadas, como mostrado na Figura 4.

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Figura 4: Separação de fases da extração lipídica usando MTBE-metanol-água: fase orgânica superior e fase aquosa inferior. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

  1. Colete cuidadosamente 700 μL da fração orgânica superior contendo lipídios e transfira para um novo tubo de microcentrífuga pré-resfriado de 1,5 mL.
  2. Descarte a fase aquosa inferior contendo MTBE residual e metanol como resíduos químicos perigosos. Colete resíduos em recipientes rotulados e lacrados e descarte-os de acordo com os protocolos institucionais de resíduos perigosos e as regulamentações locais. Não jogue solventes no ralo.
  3. Seque os extratos lipídicos usando um concentrador refrigerado SpeedVac por 4 horas a 4 °C.
    NOTA: Para garantir a secagem completa, verifique periodicamente a secura da amostra a partir de 2 horas. Estenda o tempo de secagem conforme necessário até que as amostras estejam totalmente secas.
  4. Armazene os extratos lipídicos secos a -20 °C para armazenamento de curto prazo ou -80 °C para armazenamento a longo prazo.

4. Reconstituição dos lipídios lacrimais extraídos para análise LC-MS/MS

  1. Reconstitua os extratos lipídicos secos com 50 μL da mistura de metanol gelado (grau MS)/clorofórmio (grau HPLC) (1:1, v/v) como solvente (1 μL de solvente por 1 mm de PRT utilizado) e depois de sonicação em um limpador ultrassônico pré-resfriado por 15 minutos.
  2. Centrifuge os extratos lipídicos reconstituídos a 14.000 × g e 4 °C por 10 minutos.
  3. Transfira cuidadosamente 40 μL do sobrenadante para um frasco de vidro autosampler com um inserto de vidro instalado.
  4. Tampe bem firmemente o frasco com uma tampa aberta do septo sem fenda e esteja pronto para análise LC-MS/MS.

5. Aquisição de amostras por LC-MS/MS

  1. Para Cromatografia Líquida, ajuste a câmara da coluna e a temperatura do amostrador em 50 °C e 4 °C, respectivamente.
  2. Para cada injeção, carregue 5 μL da amostra em uma coluna de LC em fase reversa (C18; 1,7 μm, 100 mm × 2,1 mm) e fracione os lipídios a uma vazão de 0,3 mL/min em um gradiente de separação de 24 minutos.
    1. Use a fase móvel A, composta por uma mistura de acetonitrila 60:40 (grau MS) e água (v/v) com 5 mM de formiato de amônio (grau MS) e 0,1% (v/v) de ácido fórmico (grau MS) e fase móvel B contendo 90:10 isopropanol (grau MS): acetonitrilo (v/v) com 5 mM de formiato de amônio e 0,1% (v/v) de ácido fórmico.
    2. Use o seguinte gradiente: 0-2 min: 40% B; 2-2,5 min: 40% B; 2,5-3 min: 58% B; 3-18 min: 99% B; 18-20 min: 99% B; 20-20,1 min: 40% B; 20,1-24 min: 40% B.
  3. Para o Espectrômetro de Massa Orbitrap, ajuste a tensão de pulverização para +3,5 kV para modo positivo ou -2,5 kV para modo negativo.
  4. Ajuste a vazão do gás da bainha para 45 Arb e a vazão auxiliar para 10 Arb.
  5. Ajuste a vazão do gás de varredura para 2 Arb.
  6. Ajuste a temperatura do tubo de transferência de íons para 300 °C e a do vaporizador para 320 °C.
  7. Use o modo de aquisição dependente de dados (DDA).
  8. Para MS1, ajuste a resolução para 120.000, alcance de varredura para 100-2000 m/z, alvo AGC padrão, tempo de injeção automática, exclusão dinâmica para 6 s e limiar de intensidade em 5,0e4.
  9. Para MS2, defina a resolução para 15.000, alcance de varredura automática, alvo padrão AGC, tempo de injeção dinâmica, janela de isolamento em 1,6 m/z, tipo de energia de colisão como dissociação colisional de energia mais alta (HCD) e energia normalizada de colisão (NCE) para valores escalonados de 15, 30 e 40.
  10. Analise dados brutos com o software LipidSearch ou outras plataformas compatíveis.

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Results

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Amostras compostas de lágrimas foram coletadas de 16 voluntários saudáveis em três consultas independentes espaçadas por duas semanas (R1, lote mais antigo; R2, R3 coletados sequencialmente duas semanas após cada um). Usando o LipidSearch com critérios rigorosos (ou seja, Relação Sinal-Ruído ≥100, grau C ou superior, e intensidade iônica ≥30.000), identificamos 773.890 e 1.025 espécies lipídicas únicas em R1-R3, respectivamente (Figura 5A). O modo iônico pos...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vantagens da amostragem por lágrimas à base de PRT e extração de lipídios
O fluxo de trabalho de lipidômicos de lágrimas baseado em PRT apresentado aqui oferece um método de amostragem minimamente invasivo e prático para um perfil abrangente de lípidos lacrimais. Comparada às tiras de Schirmer, que exigem contato prolongado e volumes de amostras maiores, a amostragem PRT é rápida, pode ser realizada em 2 minutos, bem tolerada por populações diversas, incluindo aquelas...

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Disclosures

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse trabalho foi apoiado pela iniciativa InnoHK, pelo Governo da Região Administrativa Especial de Hong Kong e pelo Centro de Pesquisa para a Visão SHARP da Universidade Politécnica de Hong Kong. Os autores também agradecem o apoio técnico da University Research Facility em Análise Química e Ambiental (UCEA) e da University Research Facility in Life Sciences (ULS) da Hong Kong Polytechnic University.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrilo (ACN), grau LC-MSRCI LabscanLM1005
Coluna C18 ACQUITY UPLC CSHWaters Corporation186005297130Å, 1,7 µ m, 2,1 mm x 100 mm
Formiato de amônio, grau LC-MSSigma-Aldrich55674
Frasco de Vidro AutoamostradorWell Rich Scientific2ML-9-V1002Frasco de rosca de rosca 9-425 de 2mL de vidro transparente 12*32mm com rosca de rosca 9-425 (COM bloco de escrita)
Tampa de rosca nervada aberta azul 9-425  Well Rich Scientific9-SP1003com 9mm, PTFE branco/septa de silicone vermelho 1mm
Clorofórmio, grau HPLCReagentes Duksan1271
Tubos Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mLEppendorf30120086
Ácido Fórmico (FA),  Grau LC-MSThermoFisher ScientificA117-50
Micro-inserto de vidroWell Rich Scientific2ML-N2002250 & micro; Inserto em L, vidro transparente, base cônica com polimola, tamanho: 5,8*28,5mm
Isopropanol, grau LC-MSRCI LabscanLM1162
LipidSearch SoftwareThermoFisher ScientificOPTON-30879Versão 5
Metanol,   Grau LC-MSRCI LabscanLM1115
Fio Vermelho de Fenol   (PRT)Tianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd20192160086
Centrífuga refrigeradaThermoFisher Scientific75007200
Concentrador centrífugo refrigerado CentriVap e armadilhas frias CentriVapLabconco16108335
Microtubos com tampa de roscaThermoFisher Scientific3488
Éter metílico tert-butílico (MTBE), grau HPLCReagentes Duksan1070
Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 HPLCThermoFisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
Thermo Scientific Orbitrap IQ-X Tribrid MSThermoFisher ScientificFSN05-10001
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Limpador UltrassônicoUltrassônico CrestP500D-45
Misturador de vórticesReferênciaBV1003

References

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