Artigo de método

Imagem de células vivas da permeabilização da membrana lisossômica durante a necroptose

DOI:

10.3791/69495

⸱

14 de novembro de 2025

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Heart Institute, Department of Internal Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um método de imagem de células vivas para monitorar a permeabilização da membrana lisossômica durante a necroptose, utilizando sondas fluorescentes que detectam alterações na integridade e acidificação da membrana lisossômica.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A necroptose, uma forma de necrose regulada, culmina na ruptura da membrana celular. Nosso laboratório e outros descobriram que a permeabilização da membrana lisossômica (LMP) é um evento precoce e crucial nesse processo, precedendo a ruptura da membrana. A LMP rápida libera enzimas lisossômicas potentes, particularmente proteases, no citosol, promovendo ativamente a morte celular. A imagem de células vivas fornece uma ferramenta inestimável para detectar a DUM durante a necroptose em tempo real. Vários corantes fluorescentes são altamente eficazes: (1) os corantes LysoTracker sensíveis ao pH rastreiam as mudanças no pH lisossômico. Uma diminuição no sinal de fluorescência indica uma perda do gradiente de pH lisossômico, um sinal primário de disfunção lisossômica, que pode ser um precursor ou consequência direta da DUM. (2) As esferas de dextrana marcadas com fluoresceína são internalizadas e se acumulam nos lisossomos. Sua liberação no citosol sinaliza LMP completo e vazamento de carga. Aqui, observamos uma perda progressiva de fluorescência do Lysotracker, com a difusão da fluorescência do Dextrano no citosol após a indução da necroptose. Assim, a metodologia de imagem de células vivas permite que os pesquisadores rastreiem com precisão o momento e a extensão da disfunção lisossômica, contribuindo para uma compreensão mais abrangente dos mecanismos de necroptose e iluminando possíveis intervenções terapêuticas.

Introdução

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A necroptose é uma forma independente de caspase de morte celular regulada, implicada em muitas doenças inflamatórias, neurodegenerativas, pulmonares, hepáticas e cardíacas 1,2,3. Essa via é mediada por uma cascata complexa de reações que culminam na ativação da proteína quinase 1 de interação com o receptor (RIPK1), que interage com a proteína quinase 3 de interação com o receptor (RIPK3) por meio de seus domínios de motivo de interação RIP homotípico (RHIM) 4,5,6. O RIPK3, por sua vez, recruta proteína quinase de linhagem mista (MLKL) para formar o necrossomo 7,8. A fosforilação de MLKL por RIPK3 leva à sua oligomerização e subsequente polimerização. Os polímeros MLKL então se translocam para as membranas celulares, levando à ruptura da membrana celular e à morte celular 9,10,11. No entanto, os mecanismos pelos quais os polímeros MLKL se translocam para os compartimentos da membrana e induzem a ruptura da membrana não são totalmente compreendidos.

Os lisossomos são organelas responsáveis pela degradação e reciclagem de materiais celulares. Em seu lúmen, existem proteases, lipases, nucleases e hidrolases que são responsáveis pela digestão de macromoléculas, mantendo assim a homeostase celular 12,13. Portanto, a manutenção da integridade lisossômica e da função adequada é essencial para garantir a depuração celular eficaz, adaptações ao estresse e sobrevivência celular global 14,15,16. Estudos recentes indicam uma associação entre necroptose e permeabilização da membrana lisossômica (DUM)17,18,19.

Nossas observações recentes mostraram que a DUM é um evento precoce e significativo no processo de necroptose, precedendo a ruptura final da membrana celular19. Especificamente, a polimerização de MLKL na membrana lisossômica induz a LMP rápida a liberar enzimas lisossômicas potentes, particularmente proteases, incluindo catepsina B, no citosol. Essas proteases então clivam proteínas vitais para promover a morte celular. É importante ressaltar que a inibição da atividade do CTSB protege fortemente contra a morte celular19,20. Esses dados sugerem que a DUM é um modulador crucial da via de necroptose. Portanto, monitorar o tempo de DUM durante a necroptose é essencial para entender os mecanismos moleculares e identificar potenciais alvos terapêuticos.

Muitos métodos convencionais de detecção de LMP, como imunocoloração, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) ou citometria de fluxo, requerem amostras fixas ou fornecem apenas informações de endpoint21 , 22 , 23 , falhando em capturar o processo dinâmico de ruptura lisossômica, particularmente no contexto de rápida progressão da necroptose. Em contraste, o método de imagem de células vivas permite a visualização em tempo real e de alta resolução da DUM durante a necroptose. Neste protocolo, combinamos dois marcadores lisossômicos complementares e induzimos necroptose em células HT-29 para analisar a integridade da membrana lisossômica em tempo real19. Essa técnica fornece uma plataforma robusta e adaptável para estudar a DUM não apenas na necroptose, mas também potencialmente em outras formas de estresse celular em que a integridade lisossômica está comprometida, particularmente no contexto de doenças ou no uso de terapias direcionadas aos lisossomos24 , 25 , 26 .

Protocolo

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1. Cultura celular - dia 0

  1. Placa 5.000 células em 2 mL de DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de Penicilina e Estreptomicina (P/S) em um prato estéril com fundo de vidro.
  2. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 durante a noite.

2. Carregamento de contas de dextrano - dia 1

  1. Dilua as esferas verdes de dextrano a 25 μg / mL em DMEM fresco suplementado com 10% de FBS e 1% de P / S adicionando 20 μL da solução estoque de 2,5 mg / mL.
  2. Remova o meio antigo e substitua-o por 2 mL de DMEM contendo esferas suplementado com 10% de FBS e 1% de P/S.
  3. Incubar a célula por 24 h a 37 ° C com 5% de CO2 para permitir a internalização de grânulos em lisossomos.

3. Coloração Lysotracker - dia 2 (dia do experimento)

  1. Prepare o meio de coloração adicionando 2 μL de solução estoque Lysotracker 1 mM a 2 mL de DMEM fresco suplementado com 10% de FBS e 1% de P/S para obter uma concentração final de 1 μM. Substitua o meio antigo por esta solução de coloração.
  2. Incubar a 37 °C com 5% de CO2 por 2 h, seguindo o tempo de incubação recomendado (30 min a 2 h) fornecido nas Diretrizes para Uso de Sondas Moleculares da Life Technologies27. Em nossos experimentos, 2 h de incubação em células HT-29 resultaram em coloração puncta robusta com forte colocalização com grânulos de dextrana, indicando fluorescência estável do corante.
    NOTA: Ligue o microscópio confocal 30 minutos antes da imagem de células vivas.

4. Configuração do microscópio confocal

  1. Ligue os componentes do sistema confocal na seguinte ordem: microscópio PC; potência do scanner; potência do laser; emissão de laser; Potência Leica.
  2. Ligue os controles ambientais: The Cube - controlador de temperatura; O controlador do misturador de gás Brick - CO2 . Fornecimento aberto de CO2 e O2 .
  3. Defina os parâmetros do gás:
    1. Ajuste o controlador de temperatura (o cubo) para 37 °C.
    2. Defina o controlador de gás e umidade (o tijolo) para 5% CO2 e 95% de umidade.
  4. Monte a câmara de imagem conforme mostrado na Figura 1.
  5. Configure a objetiva confocal:
    1. Use uma objetiva de imersão em óleo de 63x/1.40 NA.
    2. Defina os lasers de excitação para 488 nm (fluoróforo verde) e 555 nm (fluoróforo vermelho).
    3. Para o laser de 488 nm, selecione um detector híbrido (HyD) e, para o laser de 555 nm, selecione um detector PMT.
      NOTA: A diafonia de fluorescência foi minimizada usando portas predefinidas no software confocal, o que confirmou que não havia diafonia entre os canais.

5. Preparação pós-coloração (após a incubação do LysoTracker)

  1. Lave as células cuidadosamente três vezes com 2 mL de PBS.
  2. Adicione 2 mL de DMEM fresco suplementado com 10% de FBS e 1% de P/S.
  3. Aplique uma gota de óleo de imersão na lente objetiva antes de criar imagens.
  4. Monte o prato no microscópio stage.
  5. Ajuste a intensidade do laser e o fundo.
    1. Ajuste a intensidade do laser em até 3%, mas não mais do que 5%.
    2. Ajuste o ganho do detector no software do microscópio para otimizar o sinal.
    3. Para minimizar o plano de fundo, ajuste a barra de contraste.
  6. Adquira imagens de linha de base de células não tratadas (antes da adição de T / S / Z), que servem como condição de controle.
  7. Retorne a placa à capela de fluxo laminar e adicione 1 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de P/S, contendo 100 ng/mL de TNF-α (T), 500 nM de SMAC mimético (S) e 100 μM de Z-VAD-FMK (Z).
  8. Continue a imagem no microscópio confocal.
    NOTA: T / S / Z foram adicionados intencionalmente em concentrações mais altas do que os protocolos padrão. Essa escolha foi feita para acelerar a DUM e a morte celular, permitindo que os eventos iniciais sejam capturados de forma mais confiável em imagens em tempo real.

6. Configurações de aquisição de imagem

  1. No software de aquisição, defina os parâmetros da seguinte forma: modo: xyt; formato: 512 x 512; velocidade: 400; zoom: 3; média da linha: 1; acumulação de linha: 3; acumulação de quadros: 1; intervalo de tempo: 3 min; duração: 8 h; Ative o foco automático.
  2. Clique em Iniciar para iniciar a aquisição de lapso de tempo.

Resultados

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Os procedimentos descritos neste protocolo permitem a aquisição de imagens de células vivas por meio de microscopia confocal para monitorar a DUM em tempo real. A Figura 1 ilustra uma representação esquemática do protocolo experimental, desde o plaqueamento celular até a aquisição da imagem. No Dia 0, 5.000 células HT-29 foram plaqueadas e incubadas por 24 h a 37 °C e 5% de CO2. Após 24 h (Dia 1), as células foram incubadas com esferas de dextrano marcadas com fluoresceína (25 μg/mL) por mais 24 h nas mesmas condições. Essas esferas são internalizadas por endocitose e tráfego para os lisossomos, onde se acumulam e aparecem como pontos brilhantes. No Dia 2 (Dia do Experimento), as células foram tratadas com corante LysoTracker sensível ao pH (1 μM) por 2 h a 37 ° C e 5% de CO2. O LysoTracker concentra e exibe forte fluorescência dentro de compartimentos ácidos, como endossomos tardios e lisossomos. Trinta minutos antes da imagem, o sistema de microscópio confocal foi ligado e estabilizado, incluindo controladores de temperatura, gás e umidade, conforme descrito na etapa 4 do protocolo. A câmara de imagem foi montada, conforme demonstrado na Figura 2. Foram utilizados os lasers de 488 nm (verde) e 555 nm (vermelho).

Após a incubação com LysoTracker, as células foram cuidadosamente lavadas três vezes com PBS, e 2 mL de DMEM fresco suplementado com 10% de FBS e 1% de P/S foram adicionados. A placa foi transferida para o microscópio e uma gota de óleo de imersão foi aplicada na objetiva de imersão em óleo 63x/1,40 NA. A intensidade do laser e os níveis de fundo foram então ajustados para otimizar as condições de imagem, conforme descrito na etapa 5.5. do protocolo. Nossas imagens iniciais confirmaram a presença de pontos estáveis do Lysotracker e dextrana marcada com fluoresceína, indicando lisossomos intactos (Figura 3). As imagens basais foram adquiridas antes de T/S/Z e utilizadas como controle. Nenhum veículo foi aplicado.

Após estabelecer as configurações iniciais de imagem e microscopia, a placa foi devolvida à capela de fluxo laminar e 1 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de P/S, contendo 100 ng/mL de TNF-α (T), 500 nM de SMAC mimético (S) e 100 μM Z-VAD-FMK (Z) foi adicionado. A imagem continuou no microscópio confocal usando o parâmetro de aquisição de imagem descrito na etapa 6 do protocolo. Conforme mostrado na Figura 3, Filme suplementar S1 e Filme suplementar S2, a diminuição progressiva na fluorescência do LysoTracker em células tratadas com T / S / Z serviu como um indicador precoce de alteração lisossômica. Essa perda foi seguida e ocasionalmente ocorreu simultaneamente com o efluxo de dextrano marcado com fluoresceína dos lisossomos para o citosol (mudança puntiforme para difusa), indicando LMP. Às 8 h, quase todo o sinal do Lysotracker desapareceu, no entanto, muitas células ainda retinham pontos verdes com sinal verde citosólico, sugerindo que a perda do gradiente de pH lisossômico precede a LMP completa e a liberação de carga.

Figura 1
Figura 1: Representação esquemática do protocolo experimental. (Criado em BioRender.com) Inicialmente, 5.000 células foram plaqueadas (0 h) e incubadas por 24 h; em seguida, grânulos de dextrano (25 μg/mL) foram adicionados e incubados por mais 24 h. Às 48 h, o LysoTracker (1 μM) foi adicionado e incubado por 2 h. As células foram lavadas três vezes com PBS (etapa 1), seguida da adição de 2 mL de DMEM fresco suplementado com 10% de FBS e 1% de P/S (etapa 2). As configurações de microscopia foram ajustadas (etapa 3) e as células foram tratadas com TNF-α (T), mimético de SMAC (S) e inibidor de pan-caspase Z-VAD-FMZ (Z) (etapa 4), antes da aquisição da imagem de células vivas (etapa 5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Diagrama da configuração da câmara de imagem. (A) O suporte da amostra, (B) a câmara de incubação de gás e (C) a tampa superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Imagens representativas de células HT29 antes e depois do tratamento T / S / Z. As células foram coradas com grânulos vermelhos de Lysotracker e verdes de Dextran e tratadas com TNF-α (T), mimético de SMAC (S) e inibidor de pan-caspase Z-VAD-FMZ (Z). Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Filme suplementar S1: Lapso de tempo de células HT29 incubadas com grânulos verdes de dextrano e tratadas com T / S / Z. As células foram monitoradas por mais de 6 h para avaliar a resposta celular. Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme suplementar S2: Lapso de tempo de células HT29 incubadas com LysoTracker vermelho e tratadas com T / S / Z. As células foram monitoradas por mais de 6 h para avaliar a resposta celular. Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Discussão

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Este protocolo demonstrou que a combinação do LysoTracker e dos grânulos de dextrana marcados com fluoresceína permite o monitoramento simultâneo do pH lisossômico e da liberação de carga em tempo real. Os resultados representativos (Figura 3, Filme suplementar S1 e Filme suplementar S2) confirmam que as células não tratadas mantêm um sinal de puncta estável para ambos os marcadores. Em contraste, o tratamento T / S / Z indica uma perda progressiva da intensidade do Lysotracker e uma mudança de dextrana de puncta para distribuição citosólica difusa, consistente com LMP.

Um primeiro passo crítico neste protocolo é selecionar as células para aquisição de imagens. Nossos dados anteriores demonstram que o tratamento T/S/Z causa a morte de aproximadamente 80% das células HT-29 em 24 horas, com os 20% restantes sobrevivendo19. Como a LMP não está presente no início do experimento, as células são inicialmente selecionadas com base na morfologia e em seu sinal positivo duplo para as esferas LysoTracker e Dextrana. Embora este método não possa prever quais células específicas sofrerão DUM, observamos consistentemente que aproximadamente 60% da população monitorada eventualmente exibe DUM durante o período de imagem de 8 horas. Outro desafio decorre da natureza inerente da imagem sequencial. Um ligeiro desvio na posição Z da célula, que ocorre durante a aquisição da imagem a cada 3 minutos, impede o rastreamento contínuo do mesmo sinal de ponto durante todo o experimento. Além disso, as células migram e sofrem alterações morfológicas em resposta ao tratamento T/S/Z 28. Consequentemente, é impossível acompanhar a dinâmica dos lisossomos individuais durante todo o período de imagem. Em imagens de células vivas de longo prazo, a contribuição potencial da fototoxicidade como mediador da morte celular é uma consideração importante. A excitação contínua durante sessões prolongadas pode gerar espécies reativas de oxigênio e prejudicar a viabilidade celular29, potencialmente interferindo na resposta necroptótica genuína. Para minimizar esse efeito, aplicamos baixa potência do laser e tempos de exposição curtos. Além disso, a concentração de cinco vezes de T / S / Z foi administrada para acelerar o processo de morte celular. No entanto, não podemos excluir totalmente a contribuição do estresse induzido pela luz para as alterações lisossômicas observadas.

Uma vantagem importante deste protocolo de imagem de células vivas é sua capacidade de monitorar a mudança de pH lisossômico e a DUM em tempo real, capturando eventos dinâmicos que são perdidos por análises de endpoint, como TEM, citometria de fluxo e imunocoloração. Embora o TEM ofereça insights estruturais de alta resolução, ele não pode capturar a progressão temporal da DUM. Métodos alternativos de células vivas, como ensaios de realocação de laranja de acridina30 ou formação de galectina-puncta31, também são ferramentas valiosas para monitorar a integridade lisossômica, mas cada um tem limitações quando usado isoladamente. O ensaio de laranja de acridina relata a redistribuição do corante das organelas ácidas para o citosol, que é influenciada tanto pelas alterações do pH lisossômico quanto pela permeabilização da membrana e, portanto, não se correlaciona diretamente com a liberação de carga. Da mesma forma, a formação de galectina-puncta reflete a exposição de glicanos luminais ao citosol e, portanto, marca dano à membrana lisossômica31,32, mas não discrimina entre permeabilização parcial e ruptura lisossômica completa.

A principal força deste protocolo reside na combinação de LysoTracker e grânulos de dextrana, o que permite a investigação simultânea da acidificação lisossômica e vazamento de carga. Isso fornece uma leitura dupla exclusiva da funcionalidade lisossômica e da integridade estrutural. O desvanecimento do LysoTracker atua como um indicador de uma alteração no pH lisossômico, enquanto a liberação de dextrano relata diretamente o vazamento físico do conteúdo lisossômico. Ao usar esses dois marcadores juntos, aumentamos significativamente a detecção de DUM parcial e completa. Portanto, essa estratégia de imagem de células vivas é amplamente aplicável. Os pesquisadores podem adaptá-lo para uso com outros tipos de células e diferentes sondas fluorescentes para estudar a integridade lisossômica sob várias condições experimentais, incluindo perturbações farmacológicas ou genéticas. Essa capacidade é fundamental para avançar nossa compreensão dos mecanismos de necroptose e identificar possíveis intervenções terapêuticas.

Divulgações

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Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

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A pesquisa no laboratório do Dr. Zhigao Wang é apoiada por bolsas do NIH R35GM158455 e R01GM147474.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Células HT-29ATCCHTB-38Células do Câncer de Cólon
Prato de fundo de vidro de 35 mmMatTek CorporationP35G-1.5-14-C-GRD
Incubadora de CO2PHCBIMCO-170AICUVL
Microscópio ConfocalLeicaSP8WLL
Contas verdes DextranoThermoFisherD1820Dextran, Fluoresceína, 10.000 MW, Aniônica, Lisina Fixável
Eagle Médio Modificado (DMEM) de DulbeccoCorning 10-013-CV
Soro Bovino Fetal (FBS)Cytiva & nbsp;SH30910.03
LysoTracker Vermelho DND-99InvitrogenL7528
Tipo de imersão em óleo HFCiências da Microscopia Eletrônica16915-01
Penicilina e estreptomicina (P/S) Sigma-AldrichP4333
Soro Tamponado com Fosfato (PBS)Corning21-040-CV
Smac mimético (S)BV6, ApexBio, CatálogoB4653Concentração final, 1 mM
O Tijolo Serviços de imagem de vida13685Controlador de CO2 do Misturador de Gás
O CuboServiços de imagem de vidaCBO2AMicroscópios de câmara de controle de temperatura
Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-&alfa; - T)Peprotech30001A100UGConcentração final, 20 ng/ml
z-VAD-FMK (Z)ApexBioA1902Concentração final, 20 mM

Referências

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