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Artigo de método

Abordagens experimentais para análise bioquímica da proteína ácida fibrilar glial e suas variantes associadas a doenças

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DOI:

10.3791/69523

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28 de novembro de 2025

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

Neste artigo

Resumo

Este estudo apresenta métodos experimentais para caracterizar bioquimicamente o GFAP e suas mutações causadoras de doenças, com foco na montagem, agregação e modificação pós-translacional de filamentos. Proteínas GFAP de alta pureza foram analisadas, revelando insights sobre os mecanismos da doença de Alexander que podem fornecer uma estrutura para estudar potenciais alvos terapêuticos e compreender mutações GFAP e distúrbios relacionados.

Resumo

A Proteína Ácida Fibrilar Glial (GFAP) é uma proteína intermediária chave do filamento fundamental, fundamental para manter a integridade estrutural e a função dos astrócitos no sistema nervoso central. Mutações no GFAP são a causa raiz da doença de Alexander (AxD), um distúrbio neurodegenerativo raro e frequentemente fatal, caracterizado pelo aumento dos níveis de GFAP e pelo acúmulo de GFAP na forma de fibras de Rosenthal. Aqui, delineamos um conjunto abrangente de abordagens experimentais para a caracterização bioquímica do GFAP e suas variantes causadoras de doenças. Utilizando expressão otimizada e técnicas avançadas de purificação, alcançamos altos rendimentos e pureza tanto das proteínas GFAP selvagens quanto mutantes. Ensaios bioquímicos foram empregados para avaliar os efeitos de mutações patogênicas na montagem dos filamentos, solubilidade e agregação. Além disso, exploramos o papel das modificações pós-traducionais aberrantes na agregação GFAP e seu impacto nas propriedades do filamento. Esse trabalho avança nossa compreensão do papel do GFAP no AxD e estabelece as bases para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas voltadas para a disfunção do GFAP. Além disso, as metodologias apresentadas aqui servem como ferramentas valiosas para investigar as consequências bioquímicas das mutações do GFAP e avançar em intervenções para distúrbios relacionados ao tipo GFAP.

Introdução

A doença de Alexander (AxD) é um distúrbio genético resultante de mutações dominantes no gene que codifica a proteína ácida glial fibrilar (GFAP)1, uma proteína do tipo III do filamento intermediário (FI) encontrada predominantemente em astrócitos maduros. O AxD é caracterizado pela regulação de altade GFAP 2, astrogliosereativa 3 e acúmulo de fibras de Rosenthal, que são inclusões proteicas compostas principalmente por GFAP junto com proteínas associadas como αB-cristalina4 e ubiquitina5. Mutações no gene GFAP perturbam a montagem normal dofilamento 6, levando à agregação anormal, indução de respostas celularesao estresse 7 e maior desestabilização por meio de modificações pós-traducionais (PTMs) aberrantes, como fosforilação8,oxidação 9 eubiquitinação 10.

Apesar do papel central do GFAP na patologia do AxD, os mecanismos moleculares pelos quais o GFAP mutante interrompe a montagem do filamento, promove a agregação e induz o estresse celular ainda são pouco compreendidos. Essa lacuna de conhecimento dificulta o desenvolvimento de terapias direcionadas para lidar com a agregação e toxicidade do GFAP. Estudar as propriedades bioquímicas do GFAP e suas variantes associadas ao AxD é crucial para descobrir os mecanismos moleculares subjacentes à progressão da doença. No entanto, a propriedade propensa à agregação do GFAP e seu comportamento alterado de montagem em variantes associadas a doenças apresentam desafios únicos para análise experimental. Estudos bioquímicos controlados requerem GFAP purificado, obtido tanto de modelos animais quanto por expressão recombinante, para investigar os efeitos das mutações do AxD na montagem, agregação e modificações patológicas de filamentos.

As abordagens experimentais apresentadas neste estudo oferecem várias vantagens em relação a técnicas alternativas. Por exemplo, embora os modelos baseados em células11 e os estudos imunohistoquímicos12 forneçam insights valiosos sobre expressão e localização de GFAP, eles frequentemente falham em capturar os mecanismos bioquímicos precisos de montagem e agregação de filamentos devido à complexidade dos ambientes celulares. Em contraste, os métodos descritos aqui, como ensaios de montagem de filamentos in vitro , análises de sedimentação e caracterização de PTM, permitem uma investigação controlada das propriedades bioquímicas intrínsecas do GFAP e suas variantes associadas a doenças. Essas abordagens permitem que pesquisadores dissequem o comportamento de montagem e agregação de filamentos em um sistema simplificado, facilitando a identificação dos mecanismos moleculares subjacentes à disfunção GFAP. Estudos anteriores demonstraram a utilidade dessas técnicas bioquímicas para analisar proteínas de FI, incluindo desmin13 equeratinas 14, ressaltando sua aplicabilidade à pesquisa com GFAP.

Além disso, este manuscrito fornece informações para ajudar os leitores a determinar se os métodos descritos são apropriados para suas aplicações específicas. Pesquisadores interessados em estudar propriedades bioquímicas do GFAP, seu comportamento de montagem ou PTMs acharão essas técnicas particularmente úteis para investigar variantes associadas a doenças e seus efeitos patológicos. Ao integrar essas abordagens bioquímicas com outros sistemas experimentais, como estudos baseados em células ou modelos animais, os pesquisadores podem alcançar uma compreensão mais abrangente da disfunção do GFAP em AxD e outras astrocitopatias relacionadas.

O objetivo geral deste método é apresentar abordagens experimentais para a análise bioquímica do GFAP e suas variantes associadas ao AxD, incluindo técnicas de purificação de proteínas, ensaios de montagem in vitro de filamentos, análises de sedimentação e caracterização de PTM. Esses métodos fornecem insights fundamentais sobre a base molecular da disfunção do GFAP no AxD, abrindo caminho para o desenvolvimento terapêutico. Além disso, a aplicação dessas técnicas experimentais avançará nossa compreensão da bioquímica do GFAP no AxD e contribuirá para o campo mais amplo da pesquisa em IF.

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Protocolo

Os animais usados neste estudo são ratos modelo AxD com a mutação knock-in R237H11. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal da Faculdade de Ciências da Vida e Medicina da Universidade Nacional Tsing Hua (Aprovação NTHU IACUC nº 109088 e 111060) e de acordo com as diretrizes do Guia Agrícola para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Purificação de GFAP recombinante de bactérias (Figura 1)

  1. Transforme a cepa pLysS BL21 (DE3) de E. coli com o vetor pET 23b contendo cDNA de WT ou GFAP mutante.
  2. Cultivar bactérias em 1 L de meio Luria-Bertani suplementado com 100 μg/mL de ampicilina e 34 μg/mL de cloroanfenicol a 37 °C até OD600 de ~0,2.
  3. Adicione isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG, 0,5 M) a uma concentração final de 0,5 mM para induzir a expressão de GFAP a 37 °C por 4 horas.
  4. Colhe bactérias por centrifugação a 6.371 xg por 30 min a 4 °C.
  5. Lisar bactéria em 50 mL de tampão TEN (20 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl) suplementada com 0,2 mM de fluoreto de phnenilmetanosulfonil (PMSF) por homogeneização em um homogeneizador Dounce.
  6. Centrifuge lisa bacteriana a 22.045 xg por 20 minutos a 4 °C, e então extraia o pellet no tampão Triton X-100 (TEN com 1% (v/v) Triton X-100).
  7. Após a centrifugação nas mesmas condições, extraia o pellet resultante no tampão de alto teor de sal (TEN com 1% (v/v) Triton X-100 e 1,5 M KCl).
  8. Após a centrifugação nas mesmas condições, lave o pellet com o buffer TEN.
  9. Dissolva o último pellet em 10 mL de tampão de ureia (8 M ureia, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM EDTA e 0,2 mM PMSF) mexendo por 3 h em temperatura ambiente.
  10. Extratos de ureia centrífuga a 80.000x g em uma ultracentrífuga de mesa a 4 °C por 20 minutos.
  11. Adicione polietilenemina (1% (v/v)) à fração urei-solúvel até uma concentração final de 0,06% (v/v) e incube no gelo por 5 minutos.
  12. Centrifuge a 80.000x g a 4 °C por 20 minutos e depois dialise a fração sobrenadante contra o tampão A (6 M ureia, 20 mM MES, pH 6,0, 14,4 mM β-mercaptoetanol).
  13. Os diálises de carga sobre uma coluna de troca iônica CM-Sepharose pré-equilibrada no buffer A em um Sistema de Cromatografia NGC.
  14. Proteínas elutas com gradiente linear de 0-0,5 M NaCl no tampão A por 1 hora com uma vazão de 1 mL/min.
  15. Agrupe frações contendo GFAP e diálisa contra o tampão B (6 M ureia, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) e 1 mM de EDTA).
  16. Carga diálisa sobre uma coluna de troca aniônica pré-equilibrada no tampão B. Elute proteínas com gradiente linear de 0-0,5 M NaCl no tampão B ao longo de 1 hora com vazão de 1 mL/min.
  17. Analise frações de colunas por meio de coloração SDS-PAGE e azul Coomassie. Recolha aqueles que contêm GFAP purificado e armazene a -80 °C.
    NOTA: A lise bacteriana pode ser facilitada por vários ciclos de congelamento e descongelamento. A concentração final de polietilemeina não deve exceder 0,06% (v/v), acima da qual as proteínas também precipitam. Ao trabalhar com materiais perigosos como PMSF e β-mercaptoetanol, é fundamental incluir orientações claras de segurança e instruções para o descarte de resíduos perigosos. O PMSF é altamente tóxico e pode causar irritação na pele, olhos e trato respiratório. Prepare soluções de PMSF frescas em uma exaustão e evite contato direto. Use β-mercaptoetanol em um local bem ventilado, pois ele emite vapores fortes e tóxicos.

2. Montagem in vitro e ensaio de sedimentação (Figura 2)

  1. Dilua WT purificado ou GFAP mutante a 0,3 mg/mL em 6 M ureia em tampão com baixo teor de sal (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA e 14,4 mM β-mercapetanol).
  2. Dialise amostras contra o tampão de baixo teor de sal contendo 4 M e depois 2 M de ureia por 4 horas em temperatura ambiente.
  3. Dialise amostras contra o tampão com baixo teor de sal sem ureia durante a noite a 4 °C.
  4. Diálisa amostras contra o tampão de montagem (10 mM Tris-HCl, pH 7, 50 mM NaCl e 14,4 mM β-mercapetanol) em temperatura ambiente por 12-16 horas.
  5. Transfira as misturas de montagem para o topo de uma almofada de sacarose contendo 0,2 mL de 0,85 M de sacarose no buffer de montagem.
  6. No ensaio de sedimentação em alta velocidade, centrifuge as misturas a 80.000x g por 20 minutos a 20 °C usando uma micro-ultracentrífuga de mesa.
  7. Concentre o GFAP não montado na fração sobrenadante realizando precipitação de metanol/clorofórmio15. Os precipitados de ressuspensão em 0,2 mL de amostra tampão de Laemmli (25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1% (p/v) dodecil sulfato de sódio (SDS), 12,5% (v/v) glicerol, 0,01% (p/v) azul de bromofenol e 355 mM β-mercaptoetanol).
  8. Ressuspenda o GFAP montado na fração de pellets no buffer de amostras de Laemmli.
  9. Faça uma análise de frações de sobrenadante e de pellets em gel de eletroforese de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) a 10% (p/v) e tinga com 10 mL de azul Coomassie.
  10. No ensaio de sedimentação em baixa velocidade, a montagem da centrífuga mistura a 3.000x g por 5 minutos a 20 °C usando uma centrífuga de bancada.
  11. Adicione 0,2 mL de buffer amostral de Laemmli às formas não agregadas de GFAP na fração sobrenadante.
  12. Resuspenda o GFAP agregado diretamente na fração de pellets no tampão de amostras de Laemmli em um volume proporcional à fração sobrenadante.
  13. Analise frações de sobrenadante e de pellets com gel SDS-PAGE de 10% (w/v), seguido pela coloração azul de Coomassie.
    NOTA: Metanol e clorofórmio são solventes tóxicos e podem causar efeitos graves à saúde. Evite contato com a pele e a inalação. Manuseie com cuidado em uma exaustão para evitar derramamentos.

3. Coloração negativa e microscopia eletrônica (Figura 2)

  1. Descarga glow nas grades de cobre revestidas com Formvar/carbono por 45 s a 20 mA em um sistema de limpeza por descarga glow.
  2. Entregue as misturas de montagem à grade com descarga incandescente e permita que as amostras se unam ao filme de suporte por 60 s.
  3. Remova o excesso de líquido removendo a borda da grade com um pedaço de papel secante.
  4. Lave as grades com água destilada, depois tinga com 20 μL de acetato de uranil a 1% (p/v) por 60 s.
  5. Remova o excesso de solução de mancha e deixe a grade secar ao ar por 30 segundos.
  6. Examine grades sob um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) H-7600 usando modo de alta resolução com uma tensão aceleradora de 100 kV.
    NOTA: A descarga glow das grades em um evaporador a vácuo antes de adicionar a amostra de proteína melhora a adsorção da amostra na grade. Acetato de uranila é um produto químico radioativo e altamente tóxico, comumente usado na microscopia eletrônica para coloração negativa. O manuseio exige rigorosa adesão a protocolos de segurança e instruções de descarte de resíduos perigosos para minimizar riscos de exposição para o pessoal e o meio ambiente. Prepare soluções de acetato de uranila apenas em uma exaustão para evitar a inalação de partículas ou vapores no ar.

4. Modificação oxidativa (Figura 3)

  1. Dilua o GFAP para 0,3 mg/mL em 6 M de ureia em tampão com baixo teor de sal (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM de EDTA e 14,4 mM β-mercapetanol) em temperatura ambiente por 2 horas.
  2. Dialise contra o tampão de baixo teor de sal contendo 4 M de ureia por 2,5 horas em temperatura ambiente. Mexa o tampão suavemente usando um agitador magnético para manter a distribuição uniforme e evitar gradientes de concentração.
  3. Após 2,5 h, transfira a membrana de diálise para o tampão de baixo teor de sal contendo 2 M ureia por mais 2,5 h em temperatura ambiente, garantindo uma agitação suave durante todo o processo.
  4. Dialise contra o tampão de baixo sal, sem ureia, a 4 °C por 18 horas.
  5. Trate amostras dialisadas com 10 mMH 2O 2 por 15 minutos, seguido de tratamento com 10 ou 100 mM de ditiotreitol (DTT) por mais 15 minutos em temperatura ambiente.
  6. Analise amostras de proteína com SDS-PAGE padrão de 10% (v) sem β-mercapetanol e colora com 10 mL de azul Coomassie.
    NOTA: Ao usarH2O2, manuseie com cuidado, pois é um agente oxidante forte e pode causar queimaduras. Use equipamentos de proteção individual para evitar contato com pele e olhos. A DTT pode causar irritação na pele, nos olhos e no sistema respiratório. Ao trabalhar com DTT e H2O 2, é essencial seguir protocolos de segurança adequados para minimizar riscos.

5. Purificação do GFAP do cérebro de ratos AxD (Figuras 4A,B)

  1. Extraia tecidos cerebrais com 10 mL de tampão TEN (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl e 5 mM EDTA) usando um homogeneizador Douce.
  2. Centrifuge o cérebro homogenea a 76.000x g a 4 °C por 20 minutos e depois extraia o pellet resultante com 10 mL de tampão Triton X-100 (1% (v/v) Triton X-100 em tampão TEN).
  3. Centrifuge a 76.000x g a 4 °C por 20 minutos e depois extraia o pellet resultante com 10 mL de tampão de sacarose (0,85 M de sacarose e 0,5% (v/v) Triton X-100 em tampão TEN).
  4. Centrifuge a 76.000x g a 4 °C por 20 minutos e depois extraia o pellet resultante com 10 mL de tampão de alto teor de sal (1,5 M KCl e 0,5% (v/v) Triton X-100 em tampão TEN).
  5. Centrifuge a 76.000x g a 4 °C por 20 minutos e, em seguida, extraia o pellet final com 10 mL de tampão de ureia (8 M ureia, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 e 5 mM EDTA).
  6. Colete a fração sobrenadante e dialise contra o tampão da coluna Q (6 M ureia, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA e 14,4 mM β-mercaptoetanol).
  7. Carregue os diálisados em uma coluna de troca de ânions em um Sistema de Cromatografia NGC.
  8. Elute a proteína ligada com um gradiente linear de 0-0,5 M NaCl em buffer Q a uma vazão de 1 mL/min.
  9. Agrupe fração contendo GFAP e diálisa contra o tampão da coluna S (6 M ureia, 20 mM MES, pH 6 e 14,4 mM β-mercaptoetanol).
  10. Aplicar diálisados a uma coluna de troca catiônica e, em seguida, eluir as proteínas ligadas com um gradiente linear de 0-1 M NaCl em buffer S a uma vazão de 1 mL/min.
  11. Analise frações eluídas por coloração SDS-PAGE e azul Coomassie, e colete aquelas que contêm GFAP purificado.

6. Análise da ubiquitinação de GFAP por imunoblotting (Figura 4C)

  1. Faça um GFAP purificado com gel SDS-PAGE a 10% (c/v).
  2. Transfira as proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose.
  3. Bloqueie a membrana incubando-a com 10 mL de albumina sérica bovina a 3% (p/v) em soro sorológico tampão Tris (TBS: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl) contendo 0,1% (v/v) Tween 20 (TBST) por 1 h em temperatura ambiente.
  4. Incubar a membrana com 5 μL de anti-GFAP e 5 μL de anticorpos primários anti-ubiquitina diluídos em 5 mL de TBST a 4 °C durante a noite. Lave a membrana três vezes com TBST.
  5. Incubar a membrana com 5 μL de anticorpos secundários conjugados com corantes fluorescentes, diluídos em 5 mL de TBST, em temperatura ambiente por pelo menos 1 hora. Lave a membrana três vezes com TBST.
  6. Adquira imagens usando um sistema de detecção de imagem fluorescente.
  7. Analise a montagem in vitro de GFAP nativo por ensaios TEM e sedimentação (Figura 5) usando o mesmo procedimento descrito nos passos 2.1 a 2.13 e 3.1 a 3.6.

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Resultados

Para investigar como mutações causadoras de AxD afetam as propriedades de montagem do GFAP, produzimos proteínas recombinantes em bactérias usando um sistema de expressão baseado em PET. Detalhamos os protocolos para expressar e purificar GFAP, usando o GFAP WT como exemplo. Após a indução do IPTG (Figura 1A, pista 2), o GFAP foi purificado por meio de um processo em três etapas envolvendo preparação do corpo de inclusão (Figura 1B) e cromatografia de troca iôni...

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Discussão

Esse protocolo estabelece uma estrutura experimental abrangente para a caracterização bioquímica do GFAP e seus mutantes associados à doença. Ao fornecer uma abordagem confiável e padronizada, esse método é um recurso valioso que aprimora nossa compreensão dos papéis biológicos do GFAP e suas implicações patológicas, especialmente no contexto do AxD. Nesta seção, discutimos vários aspectos críticos do protocolo, incluindo possíveis modificações e estratégias de solução de problemas, limi...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos à Dra. Tracy Hagemann (Waisman Center, University of Wisconsin-Madison) por fornecer os ratos knock-in R237H. A sugestão e o apoio do Prof. Albee Messing (Waisman Center, University of Wisconsin-Madison) neste estudo são muito apreciados. Esse trabalho foi apoiado por subsídios do Ministério da Ciência e Tecnologia (111-2320-B-007-008 e 112-2320-B-007-006 para N.-H. L. e M.-D.P.). Também agradecemos ao BioTEM da Universidade Nacional Tsing Hua (MOST-104-2731-M-007-002) pelo uso dos equipamentos neste estudo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução 30% de Acrilamida/Bis 37,5:1Biorad1610158
Persulfato de Amônio (APS)Biorad1610700
AmpicilinaUSB11259
Anticorpo anti-GFAPTecnologia de Sinalização Celular12389
Anticorpo anti-ubiquitinaMilliporeST 1200Clone FK2
Centrífuga Avanti J-26S XPBeckman
CloroanfenicolUSB23660
CM-SephroseCytiva1707 1901
Corante azul CoomassieUSB32826
Grade de cobreTed Pella01753-F
CS 150 NX Micro ultra-centrfugaHitachiNA
Homogeneizador de dounceWheaton
DTTURDTT
Cepa pLysS de E. coli BL21(DE3)Agilent
EasiGlowTed Pella
Reagente ECLPerkinElmerNEL 105001
EDTAUSB15699
H2O2Sigma-Aldrich18312
Coluna S do HiResCytiva2927 5877
Coluna Q do HiTrapCytiva1711 5301
IPTGURIPTG
KClHoneywell12636
LB médio (LB Agar)USB75851
Médio LB (LB Broth)BD Difco244620
mercaptoetanolSigma-AldrichM3148
MESSigma-AldrichM8250
NaClHoneywell31434S
Sistema de cromatografia NGCBioRad
Optima XE-90 UltracentrífugaBeckman
PMSFACROS ORGANICS215740050
PolietileeneiminaSigma-AldrichP3143
RotorBeckman
S55S RotorHitachi
S80AT3 RotorHitachi
SDSUSB75819
SDS-PAGEBiorad
StarBright Blue 520 cabras anti-camundongo IgG Biorad12005867
StarBright Blue 700 cabras anti-coelho IgG BioRad12004161
SacaroseSigma-AldrichS5391
TEMEDUSB76320
Microscópio eletrônico de transmissão H-7700)HitachiNA
TrisUSB75825
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
Acetato de uranilaCiências do Microscópio Eletrônico  22400
ureiaHoneywell15604H

Referências

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