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Artigo de método

Efeito da Prescrição Yi-Nao-Jie-Yu na Depressão Pós-AVC em ratos usando Oclusão da Artéria Cerebral Média Combinada com Contenção Comportamental

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DOI:

10.3791/69537

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9 de janeiro de 2026

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1School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 2Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3Capital Medical University Yanjing College, 4School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 5Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo de rato para depressão pós-AVC (PSD) combinando oclusão da artéria cerebral média (MCAO) com estresse leve crônico, contenção comportamental e isolamento de alojamento, além da avaliação dos efeitos terapêuticos da prescrição Yi-nao-jie-yu (YNJYP) por meio de testes comportamentais.

Resumo

A depressão pós-AVC (PSD) é uma complicação comum e tratável do AVC, caracterizada por sintomas depressivos e somáticos que prejudicam a recuperação e a qualidade de vida do paciente. Este estudo descreve um protocolo que combina a oclusão da artéria cerebral média (MCAO) com contenção comportamental e isolamento para estabelecer um modelo de PSD em ratos, e avalia o efeito terapêutico da Receita Yi-nao-jie-yu (YNJYP) na neurogênese adulta em ratos com PSD. Para o estabelecimento do modelo, ratos nos grupos AVC, PSD, fluoxetina hidrocloreto (FXT) e YNJYP passaram por MCAO: um ponto monofilamento foi avançado da artéria carótida interna para a artéria cerebral média (MCA) durante 2 horas de isquemia, seguido por reperfusão. A partir do sétimo dia pós-MCAO, ratos dos grupos PSD, FXT e YNJYP foram alojados individualmente e presos em uma plataforma personalizada em formato de T por 2 horas diárias e 7 dias. As avaliações comportamentais incluíram o teste de natação forçada (FST, para desespero), o teste de consumo de sacarose (SCT, para anedonia) e o teste de campo aberto (OFT, para comportamento exploratório). Com 4 e 8 semanas após o AVC, ratos PSD apresentaram maior tempo de imobilidade na FST e menor preferência por sacarose em SCT do que ratos com AVC (P < 0,01). O YNJYP reverteu esses comportamentos depressivos (P < 0,01), com eficácia comparável à da FXT. Este protocolo confirma a validade do modelo PSD e o potencial terapêutico do YNJYP, apoiado por experimentos rigorosos e análise de dados.

Introdução

A depressão pós-AVC (PSD) é uma complicação comum e tratável do AVC, que afeta significativamente o processo de reabilitação e a qualidade de vida dos pacientes. Pacientes com PSD não sofrem apenas de deficiências funcionais físicas, mas também enfrentam distúrbios mentais, como baixo humor e perda de interesse. Isso dificulta muito a recuperação das funções neurológicas e até aumenta a taxa de mortalidade. Atualmente, a patogênese da PSD é complexa e envolve múltiplos aspectos, como neurobiologia, desequilíbrio de neurotransmissores e resposta inflamatória. Há uma necessidade urgente de explorar profundamente métodos eficazes de intervenção.

O objetivo geral desse método é estabelecer um modelo confiável e reprodutível de PSD em ratos que imite de perto a condição humana, combinando oclusão da artéria cerebral média (MCAO) com estresse leve crônico (CMS, principalmente contenção comportamental) e alojamento isolado, e utilizar esse modelo para avaliar potenciais terapêuticas como a Prescrição Yi-nao-jie-yu (YNJYP). A justificativa para o desenvolvimento dessa técnica decorre da necessidade de integrar tanto o insulto isquêmico inicial quanto o estresse psicológico crônico subsequente, reconhecidos como componentes-chave na patogênese da DSP, em um único modelo padronizado 1,2,3. Comparado a métodos alternativos, como aqueles que dependem exclusivamente de paradigmas extensos de CUMS, esse protocolo oferece uma abordagem mais focada e replicável ao empregar uma forma específica de contenção comportamental projetada para simular a restrição de movimento frequentemente experimentada por pacientes comAVC 3,4,5.

Esse modelo contribui para a literatura mais ampla sobre PSD ao fornecer uma estrutura detalhada e prática para induzir e avaliar a PSD em roedores, atendendo à necessidade de padronização na pesquisa pré-clínica. Pesquisadores interessados em estudar os efeitos fisiopatológicos combinados da isquemia cerebral e do estresse pós-AVC, ou em rastrear intervenções inovadoras para PSD, podem considerar esse protocolo apropriado, pois delineia procedimentos claros para criação de modelos, aplicação do estresse e avaliação comportamental.

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Protocolo

O protocolo de estudo animal foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação

  1. Obtenha 216 ratos machos Sprague-Dawley (SD) livres de patógenos específicos (FPS), pesando entre 300 e 320 g.
  2. Acostume os ratos ao ambiente de moradia por 1 semana antes do experimento.
    1. Mantenha as condições de moradia em 23 ± 3 °C, 45% ± 5% de umidade e um ciclo de 12 horas luz/escuro (luzes acesas às 8h, apagadas às 20h).
    2. Alojar cinco ratos por gaiola, com acesso ad libitum a comida e água padrão estéreis.
      NOTA: Minimize o número de animais usados e reduza o sofrimento por meio de manuseio suave e procedimentos otimizados (por exemplo, restrições ajustáveis para evitar supressão respiratória).

2. Cirurgia de oclusão da artéria cerebral média (MCAO)

NOTA: Esta etapa descreve o estabelecimento do modelo MCAO/reperfusão (MCAO/R), modificado a partir de Bederson et al.6.

  1. Prepare os ratos para a cirurgia.
    1. Jejue os ratos durante a noite (12 horas) antes da cirurgia (sem restrição de água).
    2. Anestesie os ratos por meio de injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio a 1% (50 mg/kg).
      NOTA: Nenhum analgésico adicional foi administrado, pois o pentobarbital de sódio era usado exclusivamente como agente anestésico.
      ATENÇÃO: O pentobarbital de sódio é um anestésico controlado. Manuseie em uma exaustão, use luvas e óculos de proteção e guarde em um armário trancado conforme as normas institucionais.
  2. Assegure e prepare o local da cirurgia.
    1. Coloque ratos anestesiados em posição supina e conserte seus membros.
    2. Raspe o pelo do pescoço e desinfete a pele com um desinfetante apropriado (por exemplo, etanol 75%).
  3. Expor e preparar os vasos do pescoço.
    1. Faça uma incisão de 2-3 cm na linha média da pele do pescoço e, em seguida, dissece diretamente as glândulas subcutâneas e a fáscia. Separe a artéria carótida comum (CCA), a artéria carótida interna (ICA) e a artéria carótida externa (ECA), que são formadas pelos ramos da CCA.
    2. Localize o CCA, coloque dois pontos sob ele como reserva, ligue um próximo à extremidade do coração e faça um nó vivo próximo à bifurcação do CCA com o outro.
    3. Use uma pinça arterial para fechar a extremidade distal da CCA próxima à bifurcação.
    4. Localize o ECA e ligue-o com um ponto.
  4. Insira o ponto para ocluir o MCA.
    1. Corte cuidadosamente uma incisão na parede entre o local de ligadura da extremidade proximal do CCA e o local de fixação do clipe da artéria, depois insira um tampão especial (sutura monofilamento) nessa incisão.
    2. Abra o clipe arterial e insira o plugue roscado no ICA pelo garfo até sentir uma leve resistência, então pare (Figura 1).
      NOTA: O comprimento da sutura (18 mm ± 2 mm) é fundamental para a oclusão consistente do MCA; Ajuste levemente com base no peso do rato (300-320 g).
  5. Induz isquemia e reperfusão.
    1. Mantenha isquemia por 2 horas (estritamente cronometrado com cronômetro).
    2. Após 2 horas, retire suavemente o ponto para restaurar o fluxo sanguíneo do MCA, corte o excesso de sutura e remova o clipe arterial.
  6. Feche o local cirúrgico e monitore a recuperação.
    1. Irrige a incisão com soro fisiológico estéril, depois suture o tecido subcutâneo e a pele.
    2. Coloque os ratos em uma gaiola de recuperação (mantida a 25 ± 1 °C) até que recuperem a consciência; Monitore para sangramento ou sofrimento por 24 horas.
  7. Estabeleça o grupo de operações simuladas.
    1. Realize a mesma dissecação do pescoço e exposição dos vasos que nos passos 2.1-2.3.
    2. Insira o ponto no CCA por apenas 5 mm, depois remova-o imediatamente; Suture a incisão sem oclusão MCA.

3. Agrupamento de animais

  1. Divida aleatoriamente os ratos em seis grupos (n = 36 por grupo inicialmente) para avaliação neurológica.
    1. Grupo AVC: apenas MCAO, sem restrição comportamental ou tratamento medicamentoso.
    2. Grupo PSD: MCAO + restrição comportamental + isolamento de moradia, sem tratamento medicamentoso.
    3. Grupo FXT: MCAO + contenção comportamental + alojamento de isolamento + gavage de cloridrato de fluoxetina.
    4. Grupo YNJYP: MCAO + contenção comportamental + alojamento de isolamento + Yi-nao-jie-yu (YNJYP) gavage.
    5. Grupo em branco: Nenhuma operação realizada.
    6. Grupo de cirurgia simulado: Sem obstrução da artéria cerebral média.
  2. Exclua ratos com escores de 0 ou 4 ou aqueles que morreram após a cirurgia.
    1. Realize a pontuação neurológica Longa7 24 horas após o MCAO para selecionar ratos qualificados.
    2. Use a escala Longa de 5 pontos: 0 = sem déficit; 1 = flexão do membro anterior quando levantada pela cauda; 2 = caminhada circular em direção ao lado parético; 3 = cair em direção ao lado parético; 4 = inconsciência ou incapacidade de andar.

4. Administração de cloridrato de fluoxetina (FXT) e YNJYP

  1. Prepare YNJYP e FXT.
    NOTA: YNJYP contém seis materiais medicinais chineses: Ciwujia (raízes de Acanthopanax senticosus ) 30 g, Yujin (rizomas de Curcuma longa ) 10 g, Wuweizi (frutos de Schisandra chinensis ) 15 g, Zhizi (frutos de Gardenia jasminoides ) 10 g, Danshen (raízes de Salvia miltiorrhiza ) 15 g, e Chuanxiong (Ligusticum chuanxiong rizomas) 15 g (fornecidos pelo Departamento de Farmácia, Terceiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim). Com base em estudosanteriores, 8 a dose de administração intragástrica foi determinada em 9,92 g/(kg·d).
    1. Dissolva as cápsulas de cloridrato de fluoxetina em água destilada para atingir uma concentração de 0,233 g/L quando utilizadas. Com base na dosagem adulta multiplicada por sete, ajuste a dosagem para ratos em 2,33 mg/(kg·d).
  2. Administre drogas por meio de gavage.
    1. Comece o gavage no primeiro dia pós-MCAO e continue até o final do experimento, com o procedimento sendo realizado consistentemente pela manhã em todos os grupos.
    2. Administrar FXT ao grupo FXT a 2,33 mg/(kg·d), YNJYP ao grupo YNJYP a 9,92 g/(kg·d) e 0,9% de soro fisiológico normal (10 mL/kg) aos grupos AVC e PSD.
      NOTA: Use uma agulha gavage de 1 mL; Certifique-se de que a agulha seja inserida no estômago (não na traqueia) para evitar aspiração.

5. Estresse leve crônico (contenção comportamental) combinado com isolamento

  1. Comece a restrição comportamental e isolamento no dia 7 pós-MCAO (para evitar a fase aguda de AVC).
  2. Prepare a plataforma de contenção personalizada em formato de T.
    1. A plataforma consiste em uma base (20 cm × 10 cm × 2,8 cm) e uma área de contenção (22 cm × 6,6 cm).
    2. A área de contenção contém ranhuras para fixar a cabeça e os membros do rato e três tiras ajustáveis para diferentes tamanhos de ratos (Figura 2, Figura 3 e Figura 4).
      NOTA: A plataforma foi modificada a partir do Chen3 e do Tian4, com slots adicionais para os membros anteriores para simular a postura parética dos pacientes com AVC.
  3. Realize contenção diária.
    1. Selecione aleatoriamente uma janela de 2 horas a cada dia (por exemplo, 9:00-11:00 ou 14:00-16:00) para evitar viés circadiano.
    2. Prenda cada rato à plataforma usando as ranhuras e correias; Ajuste o aperto para evitar dificuldades, mas não supressão respiratória.
    3. Mantenha a contenção por 2 horas seguidas e 7 dias consecutivos.
  4. Ratos domésticos isolados.
    1. Transfira ratos nos grupos PSD, FXT e YNJYP de alojamentos coletivos (cinco ratos por gaiola) para gaiolas individuais no início da contenção comportamental.
    2. Mantenha moradia individual até que a contenção comportamental seja concluída (pós-MCAO dia 14).

6. Teste de consumo de sacarose (SCT)

NOTA: Selecione aleatoriamente seis ratos de cada grupo com 2, 4 e 8 semanas após o MCAO. Testar todos os ratos na ordem SCT, OFT e FST.

  1. Prepare ratos para o teste.
    1. Jejue e prive os ratos de água por 24 horas antes do teste.
    2. Garanta que a temperatura da sala de teste (23 ± 2 °C) e a iluminação estejam alinhadas com o ambiente da carcaça.
  2. Realize o teste.
    1. Coloque duas garrafas (150 mL cada) em cada gaiola: uma contendo água da torneira e a outra com solução de sacarose a 1%.
    2. Após 1 hora de consumo livre, registre os volumes de solução de sacarose e água consumidos.
  3. Calcule a preferência de sacarose.
    1. Use a fórmula: Preferência por sacarose (%) = (Volume da solução de sacarose consumida / Volume total consumido) × 100%.
    2. Troque as posições das duas garrafas no meio do período de consumo para eliminar o viés de posição.

7. Teste em campo aberto (OFT)

NOTA: Selecione o mesmo lote de ratos de cada grupo usado para o FST nas 2, 4 e 8 semanas. Jejue e prive os ratos de água por 24 horas antes do teste para manter condições fisiológicas consistentes.

  1. Prepare o aparelho de campo aberto.
    1. Use uma caixa quadrada preta com o piso dividido em 25 grades iguais.
    2. Mantenha a sala de testes silenciosa e pouco iluminada.
  2. Realize o teste.
    1. Coloque cada rato na grade central da caixa e comece um temporizador de 5 minutos.
    2. Registre atividade horizontal (número de cruzamentos na grade com três quartos das patas em uma nova grade) e atividade vertical (número de traseiros com dois quartos das patas fora do chão por observação manual usando marcadores portáteis.
    3. Registre o tempo gasto nas grades centrais e a frequência de cuidados (opcional, para insights comportamentais adicionais).

8. Teste de natação forçada (FST)

NOTA: Selecione o mesmo lote de ratos de cada grupo usado para o FST nas 2, 4 e 8 semanas. Jejue e prive os ratos de água por 24 horas antes do teste para manter condições fisiológicas consistentes.

  1. Prepare o aparelho de teste.
    1. Encha um cilindro de vidro com a quantidade adequada de água, garantindo que o nível da água esteja alto o suficiente para que o rato não possa se apoiar tocando o fundo com os pés.
    2. Ajuste a temperatura da água para 25 ± 1 °C.
  2. Realize o teste.
    1. Coloque cada rato no cilindro e deixe ele nadar por 5 minutos.
    2. Registre o tempo total de imobilidade durante os 5 minutos.
    3. Defina 'imobilidade' como flutuar passivamente (apenas movimentos mínimos para manter o nariz acima da água) e 'atividade' como remar com membros ou arranhar paredes.
  3. Cuide de ratos após o teste.
    1. Retire o rato do cilindro após 5 minutos, seque com uma toalha e coloque-o sob uma lâmpada térmica (30 ± 2 °C) por 30 minutos para evitar hipotermia (Figura 5).

9. Análise estatística

  1. Organize os dados como média ± desvio padrão (média ± SD).
  2. Analise dados usando o software SPSS versão 20.0.
  3. Antes de realizar testes paramétricos, testar os dados quanto à normalidade (usando o teste de Shapiro-Wilk) e à homogeneidade das variâncias (usando o teste de Levene). Os dados de cada grupo seguem uma distribuição normal e satisfazem a homogeneidade da variância.
    1. Use análise unidirecional da variância (ANOVA unidirecional) para comparações de médias amostrais entre grupos, combinadas com os testes de menor diferença significativa (LSD) e Student-Newman-Keuls (SNK). Use o teste de Welch quando as variâncias são desiguais.
  4. Defina significância estatística em p < 0,05.

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Resultados

Um total de 5 grupos experimentais foram formados neste estudo para detecção relevante. Após análise estatística dos dados comportamentais de cada grupo de ratos, constatou-se que, na quarta semana do experimento, o tempo de imobilidade dos ratos do grupo PSD no FST foi significativamente aumentado em comparação com os ratos do grupo AVC, e a diferença entre os dois grupos foi estatisticamente significativa (P < 0,01); ao mesmo tempo, a preferência por sacarose dos ratos do grupo PSD no ...

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Discussão

No processo de construção do modelo de isquemia cerebral de rato, existem vários métodos diferentes de modelagem, incluindo o método de ligadura, craniotomia, método de asfixia e método de oclusão por fio. Comparado aos três métodos de modelagem: ligadura, craniotomia e asfixia, o método de oclusão por fio demonstra vantagens significativas e únicas. Essas vantagens residem principalmente em três aspectos principais: a natureza minimamente invasiva da operação, a precisão do controle de ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Yuankai Su e Yonghao Sun escreveram o manuscrito, incluindo a interpretação dos resultados e a seção de discussão. Huiling Tian conduziu os experimentos e analisou os dados. Ning Ding e Xin Wang revisaram o manuscrito. Zitong Yang e Jingyao Zhao contribuíram para a busca de dados.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ratos Sprague-Dawley machos adultosVital River Laboratory Animal Technology, Pequim, ChinaNão. SCXK2012-0001300– 320 g
Cápsulas de Fluoxetina CloridrataPatheon França, Jiangsu, China0943A
Grânulos do YNJYPo Departamento de Farmácia, Terceiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Chinesa de PequimCaseiro
Caixa aberta para teste em campo abertoCaseiro -
Pentofenobarbital de sódioSigma Corporation of AmericaP3761-5
O fio de oclusãoBeijing Shadong Biotechnology Co., Ltd2838-A4
Tanque de água para experimento de natação forçadaCaseiro -

Referências

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